研究骨碎補(bǔ)總黃酮對大腸桿菌脂多糖誘導(dǎo)的急性腎衰竭

1、研究骨碎補(bǔ)總黃酮對大腸桿菌脂多糖誘導(dǎo)的急性腎衰竭    骨碎補(bǔ)總黃酮對大腸桿菌脂多糖誘導(dǎo)的急性腎衰竭大鼠ICAM -1 基因表達(dá)的影響羅穎，蔣文功，崔淑蘭（廣東藥學(xué)院，廣東廣州510006 )【摘要】目的：探究骨碎補(bǔ)總黃酮對大腸桿菌脂多糖（LPS ）誘導(dǎo)的急性腎衰竭大鼠IcAM-1基因表達(dá)的影響。方法：將8O 只雄性三月齡的大鼠平均分為四組，其中對照組水灌胃7d 后腹腔注射生理鹽水，LPS 組則水灌胃7d 后腹腔注射3Omg / kg 的LPS ，而AFFDR 組用骨碎補(bǔ)總黃酮灌胃，LPS + AF 一FDR 組則先使用骨碎補(bǔ)總黃酮灌胃7d ，然后腹腔注

2、射LPS , 2h 后接著用骨碎補(bǔ)總黃酮灌胃。觀察測定并比較各組大鼠血清中的肌配值，同時比較各組大鼠腎臟病理檢查結(jié)果，觀察比較ED 一l 陽性巨噬細(xì)胞的浸潤，并且采用半定量化的RT 一PCR 方法檢測骨碎補(bǔ)總黃酮對腎組織ICAM 一l 基因表達(dá)的影響。結(jié)果：LPS 可以造成大鼠Scr 的顯著升高和腎小管病理改變，而AFFDR 可以有效降低LPS 的上述影響；同時對照組相比，LPS 顯著提高了腎組織ED 一l 陽性巨噬細(xì)胞浸潤以及ICAM 一1 mRNA 的表達(dá)，但是LPS + AFFDR 組在這兩個指標(biāo)上又顯著低于LPS 組。結(jié)論：AFFDR 可以有效降低LPS 對腎小管超微結(jié)構(gòu)造成的病理損害

3、以及大鼠血清肌配的含量，同時還可以對由LPS 誘導(dǎo)的腎組織ED 一l 巨噬細(xì)胞浸潤和ICAM 一l 的表達(dá)產(chǎn)生較強(qiáng)的抑制作用。關(guān)鍵詞：骨碎補(bǔ)總黃酮；急性腎衰竭；LPS ; IcAM 一l     急性腎衰竭是一種臨床危重癥之一，往往是由多種病因?qū)е碌募毙阅I損害，可以在很短時間內(nèi)造成腎單位調(diào)節(jié)功能的急劇減退，導(dǎo)致無法維持體液電解質(zhì)的平衡，且不能正常排泄代謝產(chǎn)物，進(jìn)一步導(dǎo)致代謝性酸中毒、高血鉀以及急性尿毒癥等田。ARF 的發(fā)病率居高不下，嚴(yán)重威脅著人類健康二另一方面，對于ARF 的發(fā)病機(jī)理也未完全明確。本文通過觀察骨碎補(bǔ)總黃酮預(yù)處理對腎衰竭大鼠IcAM 一l 基因表達(dá)

4、的影響，同時探討骨碎補(bǔ)總黃酮對ARF 的保護(hù)機(jī)制。1 資料與方法1 . 1 材料及分組：選取80 只Wistar 大鼠（APF 級昆明小鼠購于廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，生產(chǎn)許可證號：scxK （粵）2005 一0020 ) ，雄性，3 月齡，體重2509 一280 拜，按照隨機(jī)的原則分為4 組，分別為C ( ) ntr ( ) l 組、LPS 組、AFFDR 組以及LPS + AFFDR 組。骨碎補(bǔ)總黃酮由中華榭撅的根莖加工提取，提取率為1 . 1 % ，總黃酮的含量為75 % ，每克提取物約含生藥66 . 69 （由四川省中藥研究所提供）；大腸桿菌脂多糖購自美國519 - ma 公司二免疫

5、組化試劑盒、RT 一PCR 試劑盒購自上海碧云天生物有限公司。1 . 2 治療方法：C ( ) ll r ( ) l 組大鼠，行水灌胃，2 次d ，持續(xù)7 , l ，然后行腹腔注射0 . ZmL / 109 的生理鹽水，2h 后接著水灌胃二LPS 組大鼠，水灌胃7d , 2 次d ，然后在第7 天灌胃后2h 行腹腔注射30mg / kg 的LPS , 2h 后繼續(xù)水灌胃；AFFDR 組大鼠，先用gomg 生藥kg 的骨碎補(bǔ)總黃酮灌胃7 ( l ，第7 天灌胃后2h 腹腔注射生理鹽水，然后2h 后繼續(xù)行骨碎補(bǔ)總黃酮灌胃2 次二LPS + AF - FDR 組大鼠，先用gomg 生藥kg 的骨碎補(bǔ)

6、總黃酮灌胃7d ，第7 天灌胃后2h 腹腔注射生理鹽水，然后2h 后腹,腔注射30mg / kg 的LPS , 2h 后繼續(xù)行骨碎補(bǔ)總黃酮灌胃2 次。1 . 3 觀察指標(biāo)1 . 3 . 1 血肌配：在大鼠行腹腔注射LPS 或者生理鹽水24h 后，經(jīng)腹主動脈采取的血標(biāo)本離心處理后提取出血清，并且在24h 內(nèi)測定血清肌配值。1 . 3 . 2 腎小管病理改變：處死各組大鼠，取腎組織，放入福爾馬林液中固定，然后放入B ( ) uin 氏液中4 一6h , 再按標(biāo)準(zhǔn)方法制成4 卜m 厚的切片，HE 及PAS 染色后，在光鏡下觀察。劃分為以下四個級別： 壞死：小管已經(jīng)全部壞死，或者小管基底膜出現(xiàn)破裂二

7、局灶小管壞死：小管基底膜完好無損，但是腔內(nèi)出現(xiàn)細(xì)胞碎片，上皮細(xì)胞有壞死跡象，但并未完全壞死二 小管細(xì)胞損傷：小管基底膜完好無損，腔內(nèi)出現(xiàn)微小細(xì)胞碎片，但是喪失了刷狀緣，導(dǎo)致胞漿溶入了小管腔內(nèi)二 正常：腎小管細(xì)胞、刷狀緣以及小管基底膜等均完好無損。根據(jù)上述分級，光鏡下每張載玻片觀察15 一20 個視野，以小管受損的面積占檢測面積的百分比來表示小管組織學(xué)病變的程度。1 . 3 . 3 ICAM 一1 mRNA 的表達(dá)：在四組大鼠經(jīng)腹腔注射LPs 或者生理鹽水5h 后，處死后取50mg 腎組織，按照試劑盒說明書提取RNA , RT 一PCR 測定腎組織ICAM 一1 mRNA 的表達(dá)。ICAM 一l

8、 上游引物：5 ' CAC - ccAAGGAccGcAATAG3 ' ( 21 帥），下游引物：5 ' cGAcGccGcTccAGAA 以AccAc3 ' ( 221 ) P ) ，以GAP - DH 作為內(nèi)參照二逆轉(zhuǎn)錄42 反應(yīng)3Omin ，然后PCR , 條件是94 滅活30min , 94 變性305 , 56 退火305 , 30 次循環(huán)后72 延伸10min 乃瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像圖像分析系統(tǒng)分析，以ICAM 一1 條帶的積分吸光度值（AICAM 一l ）與GAPDN 條帶的積分吸光度值A(chǔ)GAPDN 之比代表ICAM 一lmRNA 的表達(dá)量。1

9、 . 3 . 4 ED 一l 陽性巨噬細(xì)胞免疫組織化學(xué)染色：四組大鼠經(jīng)腹腔注射LPS 或者生理鹽水24h 后，處死，然后用hist ( ) 通ear 液把腎組織標(biāo)本切片脫蠟，用酒精進(jìn)行水化，用三氮化鈉（10 % ）及過氧化氫封閉內(nèi)源性過氧化物酶，小牛血清進(jìn)行封閉，加入單克隆抗體ED 一l , 在室溫下置于PBS 濕盒內(nèi)進(jìn)行孵育。加入二抗進(jìn)行孵育，PBS 清洗3 遍后進(jìn)行DAB 染色，最后用蘇木素進(jìn)行復(fù)染，中性樹脂封片。在光鏡下觀察100 個腎小管間質(zhì)細(xì)胞中的ED 一l 陽性巨噬細(xì)胞的平均數(shù)量。1 . 4 統(tǒng)計學(xué)方法：采用SPSS13 . O 統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，采用單因素方差分析比較各均數(shù)之

10、間的差別，計量資料進(jìn)行t 檢驗(yàn)，以P < 0 . 05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。2 結(jié)果2 . 1 四組大鼠血清中階r 含量比較：結(jié)果顯示，LPS 組大鼠血清中的階r 含量顯著高于LPs + AFFDR 組和C ( ) lltr ( ) l 組的阮r 含量，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0 . 05 ）二而C ( ) lltr ( ) l 組與AFFDR 組無顯著性差異。 Control 組15 71 . 3 士7 . 6 注：* LPS + AFFDR 組與Control 組相比，P < 0 . 05 2 . 2 LPS 組與LPS + AFFDR 組近端小管細(xì)胞學(xué)結(jié)果比較：LP

11、S 組大鼠，腎小管上皮細(xì)胞呈現(xiàn)片狀變性，刷狀邊緣紊亂，且見上皮細(xì)胞脫落于管腔內(nèi)，腎小管基底膜部分?jǐn)嗔选⒙懵?，或萎縮狀，腎小球形態(tài)則無明顯改變。LPS + AFFDR 組大鼠針對上述狀況表現(xiàn)較輕，腎小管上皮細(xì)胞空泡變性減少，僅有個別管腔可見上皮細(xì)胞脫落，個別腎小管基底膜部分?jǐn)嗔选⒙懵?，或萎縮狀。由于AFFDR 組與C ( ) ntr ( ) l 組大鼠在腎結(jié)構(gòu)上未呈現(xiàn)明顯改變，因此本文僅比較LPS 組與LPS + AFFDR 組的情況，見表2 。LPS + AFFDR 組的腎小管受損程度明顯低于LPS 組的受損程度，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0 . 05 ）。LPS 組21 . 9 士1

12、4 . 2 37 . 1 士4 . 8 43 . 4 士1 . 7 8 . 1 士3 . 7 LPS + AFFDR 組8 . 9 士4 . 3 20 . 5 士9 . 4 37 . 6 士8 . 9 18 . 9 士8 . 6 注：* LPS + AFFDR 組與LPS 組相比，P < 0 . 05 2 . 3 四組大鼠腎臟ED 一l 陽性細(xì)胞數(shù)的表達(dá)：LPS + AFFDR 組ED 一1 陽性細(xì)胞數(shù)為（3 . 5 士1 . 3 ）八00 個小管間質(zhì)細(xì)胞顯著少于LPs 組（10 . 35 士3 . 1 ) / 100 個小管間質(zhì)細(xì)胞，但是上述兩組均高于c ( ) ll tn ) l 組

13、（0 . 35 士0 . 02 ) / 100 個小管間質(zhì)細(xì)胞，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0 . 05 ）。見表3 。2 . 4 對四組大鼠腎組織ICAM 一1 m RNA 表達(dá)的影響：AFFDR 組大鼠腎組織ICAM 一1 RNA 表達(dá)與C ( ) ll - tr ( ) l 組無明顯差異二但是LPS + AFFDR 組的ICAM 一l RNA 表達(dá)顯著低于LPS 組，同時LPS 組的ICAM 一1 RNA 表達(dá)又顯著高于C ( ) lltn ) l 組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意。3 討論3 . 1 急性腎衰竭：由腎外原因或者是腎臟本身引起腎臟尿功能的急劇下降，導(dǎo)致機(jī)體內(nèi)環(huán)境出現(xiàn)了嚴(yán)重紊亂，

14、臨床上稱為腎衰竭，主要癥狀為無尿或者少尿、高鉀血癥、氮質(zhì)血癥以及代謝酸中毒等喇。表現(xiàn)為電解質(zhì)平衡紊亂、急性循環(huán)衰竭、嚴(yán)重失水、失血、休克等聞。其中腎小管壞死是最為常見的致病原因，特征明顯，同時腎前性衰竭的持續(xù)發(fā)展也會轉(zhuǎn)化為急性腎小管的壞死。而引起急性腎小管壞死的病因多種多樣，可概括為以下兩大類： 腎中毒：如藥物磺胺、四氯化碳、二氯磺胺（, 11 ：hl ( ) rphenami , le ) ；抗生素如新霉素、二性霉素B 、碘造影劑、甲氧氟烷麻醉劑等二生物毒素如蛇毒、斑鰲素（Canthari （五n ）等，都可在一定條件下引起急性腎小管壞死。 腎缺血：嚴(yán)重的腎缺血如重度外傷、大面積燒傷、大手術(shù)

15、、重癥感染、敗血癥、脫水和電解質(zhì)平衡失調(diào)，特別是合并休克者，均易導(dǎo)致急性腎小管壞死。內(nèi)毒素性急性腎衰竭亦是感染性休克患者死亡的原因之一，目前臨床仍舊缺乏有效的藥物進(jìn)行治療。本研究中，注射LPS 后出現(xiàn)腎功能惡化顯示成功誘導(dǎo)急性腎衰竭動物模型，表現(xiàn)為血肌配升高，且腎組織出現(xiàn)腎小管壞死等病理特征。同時我們的研究結(jié)果提示骨碎補(bǔ)總黃酮可以減輕由LPS 引起的腎衰竭，還能降低LPS 攻擊大鼠血清肌配含量，說明骨碎補(bǔ)總黃酮可以有效的預(yù)防內(nèi)毒性腎衰竭并保護(hù)腎組織。3 . 2 骨碎補(bǔ)總黃酮保護(hù)急性腎衰竭的機(jī)制：傳統(tǒng)中藥骨碎補(bǔ)總黃酮在腎臟疾病的防治中有其優(yōu)勢，骨碎補(bǔ)藥用部分為水龍骨科植物榭蔗或中華榭蔗的根莖而骨

16、碎補(bǔ)總黃酮是由其干燥根莖中提取的，是骨碎補(bǔ)主要有效成分。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，骨碎補(bǔ)總黃酮既能顯著降低LPS 誘導(dǎo)的大鼠血清肌配含量，又可以顯著減輕LPS 對腎小管超微結(jié)構(gòu)造成的病理改變，這表明骨碎補(bǔ)總黃酮可以防止LPS 引起的腎功能障礙，并對腎組織產(chǎn)生一定保護(hù)作用。其機(jī)制可能如下： LPS 是引起休克和炎癥反應(yīng)的重要介質(zhì)，而正常生理情況下，腎組織的ICAM 一1 表達(dá)水平較低，但是注射LPS 后，它會誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞ICAM 一l 的表達(dá)，而ICAM 一l 是導(dǎo)致炎癥I 性細(xì)胞向腎間質(zhì)組織浸潤的主要分子，是腎臟炎癥活動的主要標(biāo)志，當(dāng)發(fā)生急性腎衰竭時，腎組織會高表達(dá)ICAM 一l 。本研究顯示，注射了LPS 的大鼠，血肌配顯著升高，且腎組織出現(xiàn)腎小管壞死，但注射骨碎補(bǔ)總黃酮后，腎組織ICAM 一1 mRNA 的表達(dá)明顯下降，這提示骨碎補(bǔ)總黃酮通過下調(diào)ICAM 一1 的表達(dá)保護(hù)內(nèi)毒對腎臟損害。骨碎補(bǔ)總黃酮通過何種途徑降低腎組織ICI - AM 一l 的表達(dá)，目前還不清楚，可能與抑制組織細(xì)胞或血清TNF 一。和IL 一6 的分泌，或抑制腎組織的氧化應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)，尚待進(jìn)一步研究。 早期急性腎衰竭發(fā)生的重要病理生理改變常表現(xiàn)為巨噬細(xì)胞在腎組織的浸潤和激活。這些被激活的巨噬細(xì)胞，一方面對腎小球內(nèi)皮細(xì)胞核小管上皮細(xì)胞