淺論吡咯喹啉醌對γ射線照射后AGS細胞抗氧化力的影響

1、淺論吡咯喹啉醌對射線照射后AGS細胞抗氧化力的影響 作者：邱秀芹，劉春亮，徐嵐，趙俊宇，吳士良【摘要】 目的： 探討吡咯喹啉醌(pyrroloquinoline quinone，PQQ)對60Co射線照射細胞清除自由基能力。方法： 培養(yǎng)AGS細胞至對數(shù)期，實驗分為6組：正常培養(yǎng)未照射組、單純照射組、PQQ培養(yǎng)12 h未照射組、PQQ培養(yǎng)4 h未照射組、PQQ培養(yǎng)12 h后照射組、PQQ培養(yǎng)4 h后照射組。60Co照射，劑量8Gy。照射后6,12,24 h測定細胞總抗氧化力（TAOC），SOD，MDA含量。結(jié)果： 與正常未照組比較，照射后6，12，24 h單純照射組SOD，TAOC顯著降低（P0

2、.05），MDA顯著升高（P0.01）；與單純照射組比較：PQQ培養(yǎng)的照射組SOD，TAOC顯著升高（P0.01），除照射后6 h外MDA顯著降低（P0.05）。結(jié)論： PQQ可通過增強細胞抗氧化能力，降低氧化水平，從而對輻射細胞起保護作用。 【關(guān)鍵詞】 AGS細胞； 吡咯喹啉醌； 抗氧化力AbstractObjective: To investigate PQQ scavenging free radicals in cells by ray radiation.Methods： AGS cells were cultivated. There were 6 groups in our ex

3、periment: the normal group, simply irradiated group, nonirradiated group treated with PQQ by 12 hours, nonirradiated groups treated with PQQ by 4 hours, irradiated groups treated with PQQ by 12 hours, irradiated groups treated with PQQ by 4 hours. The radiation was 60Corays with the dose of 8Gy. Aft

4、er irradiated 6 h, 12 h, 24 h, the cells were measured of theses level: total antioxidation competence(TAOC),SOD,MDA. Results： The level of TAOC and SOD decreased (P0.05),and the level of MDA increased (P0.01)in simply irradiated groups after irradiated 6 h, 12 h, 24 h,in comparison with the normal

5、group. The level of TAOC and SOD increased (P0.01) in irradiated groups treated with PQQ in comparison with the simply irradiated group; and the level of MDA decreased (P0.05). Conclusion： PQQ can protect radiated cells,by strengthening antioxidative competence and lessening the oxidation of cells.K

6、ey wordsAGS cell; pyrroloquinoline quinone; antioxidation competence從食品輻照、醫(yī)用射線到空間電離輻射，輻射無處不在。大劑量輻射可引起機體多種組織和器官的損傷，甚至誘發(fā)細胞突變、癌變、致死等嚴重后果。如何增強機體抵抗力，防止或減輕輻射對人體健康的危害，研究高效、低毒的輻射防護劑顯得非常重要。 吡咯喹啉醌(pyrroloquinoline quinone，PQQ)是一種氧化還原酶輔基，作為電子的供體和受體參與氧化還原過程1。PQQ具有一些重要的生物活性和功能：如刺激微生物、人體細胞生長和植物發(fā)育等。本實驗室已初步研究PQQ對高能

7、電子射線照射引起的大鼠皮膚損傷有一定的防護作用，PQQ能有效提高自由基清除酶系活性，部分清除電子直線加速器照射后產(chǎn)生的自由基2。本實驗以胃癌細胞AGS為研究對象，通過檢測60Co射線照射后AGS細胞中抗氧化能力及自由基含量的變化，探討PQQ對細胞的輻照損傷效應(yīng)的影響。 1 材料與方法 1.1 主要儀器和試劑 胃癌細胞系A(chǔ)GS購自上海生科院,本室培養(yǎng)；PQQ由上海復(fù)旦大學(xué)生物化學(xué)教研室惠贈；丙二醛(MDA)、總抗氧化力(TAOC)和超氧化物歧化酶(SOD)測定試劑盒均購自南京建成生物工程研究所；60Co照射裝置由蘇州大學(xué)核輻照中心提供。 1.2 細胞培養(yǎng)、實驗分組與處理 胃癌細胞AGS培養(yǎng)在含1

8、0小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液中，置37 50 ml/L CO2培養(yǎng)箱中，保持飽和濕度，環(huán)境溫度為25。取對數(shù)生長期的細胞，經(jīng)臺盼藍染色，活細胞超過80者用于實驗。實驗分6組：正常未照射組（A組）、單純照射組（B組）、PQQ培養(yǎng)12 h未照射組（C組）、PQQ培養(yǎng)4 h未照射組（D組）、PQQ培養(yǎng)12 h后照射組（E組）、PQQ培養(yǎng)4 h后照射組（F組）。PQQ溶解在無血清的RPMI1640培養(yǎng)基中，0.22 m孔徑濾過除菌，4避光放置備用。PQQ在培養(yǎng)液中的終濃度為10 mol/L。取對數(shù)生長期細胞，接種于6孔培養(yǎng)板中，每孔達3106，貼壁過夜。C，E組于照射前12 h換含PQQ的培養(yǎng)液

9、，D，F(xiàn)組于照射前4 h換含PQQ的培養(yǎng)液，B，E，F(xiàn)組采用蘇州大學(xué)核輻照中心60Co射線照射裝置，劑量8 Gy，劑量率1 Gy/min進行單次照射。共做6批。 1.3 細胞SOD，TAOC，MDA測定 取對數(shù)生長期細胞，每孔3106細胞數(shù)接種于6孔培養(yǎng)板，貼壁過夜。按分組要求加入PQQ。細胞照射后6,12,24 h，0.25%胰酶消化,離心收集細胞，PBS洗2 次，棄洗液。取各組細胞加PBS 1 ml，Tris100裂解細胞，離心取上清液。用比色法按試劑盒說明測定SOD，TAOC，MDA含量。 1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 實驗結(jié)果用均數(shù)標準差(s)表示，數(shù)據(jù)處理用社會學(xué)統(tǒng)計程序包SPSS11.5軟件

10、系統(tǒng)，經(jīng)方差分析后，兩兩比較采用t檢驗。2 結(jié) 果2.1 60Co射線照射后不同時間點各組細胞SOD，TAOC含量變化 照射后6，12，24 h，B組細胞TAOC，SOD明顯低于A組（P0.05）；C，D，E，F(xiàn)組細胞TAOC，SOD均顯著高于A組（P0.05），C，D，E，F(xiàn)組均顯著高于B組(P0.01)。照射前4 h和照射前12 h換PQQ培養(yǎng)液比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，PQQ培養(yǎng)的未照組與照射組細胞比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（表1，表2）。表1 PQQ對60Co射線照射AGS細胞TAOC 含量的影響，Tab 1 Effects of TAOC activity by PQQ 60Coray irr

11、adiation on AGS cells（略）；表2 PQQ對60Co射線照射AGS細胞TSOD 含量的影響，Tab 2 Effects of TSOD activity by PQQ 60Coray irradiation on AGS cells（略） 照后6，12，24 h，B，E，F(xiàn)組細胞MDA明顯高于A組（P0.01）；照射后12，24 h，E，F(xiàn)組細胞MDA明顯低于B組（P0.05）；各時間點C，D組細胞MDA與A組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(表3)。表3 PQQ對60Co射線照射AGS細胞MDA含量的影響，Tab 3 Effects of MDA concentration by P

12、QQ 60Coray irradiation on AGS cells（略） 3 討論 電離輻射對生物體可造成嚴重損害。電離輻射可直接作用于核酸、蛋白質(zhì)及酶類，引起電離和化學(xué)鍵斷裂，使分子變性和細胞結(jié)構(gòu)破壞；也可以作用于機體內(nèi)水分子，使其發(fā)生電離和激發(fā)，產(chǎn)生大量具有強氧化性能的自由基，間接使組織細胞變性、壞死，致使代謝紊亂，引起免疫、神經(jīng)和內(nèi)分泌系統(tǒng)功能障礙3。本研究顯示8 Gy60Co射線照射AGS細胞后于6,12,24 h細胞SOD，TAOC均明顯降低，MDA顯著升高，細胞死亡增加，發(fā)生了明顯的輻射損傷生物學(xué)效應(yīng)。 吡咯喹啉醌為B族維生素4，Urakami等5用電子自旋共振(ESR)光譜法

13、分析證實PQQ具有很強的自由基清除能力，其清除自由基的能力比抗壞血酸高50100倍。對心肌的缺血再灌注實驗表明PQQ是有效的自由基清除劑，是一種高效的心肌保護劑6；Tao等7研究表明PQQ能減輕過氧化對心肌細胞的線粒體滲透，降低過氧化脂質(zhì)的含量；Ohwada等8研究表明PQQ能提高神經(jīng)系統(tǒng)由于氧化壓力導(dǎo)致的認知能力下降，能抑制由于氧化造成的神經(jīng)細胞的死亡9。 有研究表明攜帶PQQ合成酶基因的大腸埃希菌具有抗輻射及抗氧化能力是通過PQQ直接清除活性氧自由基及調(diào)動其他自由基清除機制實現(xiàn)的10。本研究結(jié)果顯示，照射前PQQ培養(yǎng)的AGS細胞TAOC，SOD含量于照射后6,12,24 h各時間點均明顯高

14、于單純照射組，照射前PQQ培養(yǎng)的AGS細胞MDA含量于照射后12,24 h明顯低于單純照射組，表明PQQ可提高細胞的抗氧化能力，降低自由基水平，保護輻照細胞免受自由基攻擊，從而對細胞輻照損傷有一定的防護作用。同時，研究結(jié)果顯示，PQQ處理的未照射AGS細胞TAOC，SOD含量于各時間點均明顯增加，而MDA含量沒有顯著差異。表明PQQ也能增強正常細胞的抗氧化酶的合成，其具體機制有待進一步研究?！緟⒖嘉墨I】 1Matsnshita K，Toyama H，Yamada M，et alQuinoproteins：structure，function，and biotechnological appli

15、cationsJAppl Microbiol Biotechnol，2002，58（1）：13-22 2吳祁生，王建浩，周迎會，等吡咯并喹啉醌對急性放射性皮膚損傷大鼠機體自由基的清除作用J江蘇大學(xué)學(xué)報：醫(yī)學(xué)版，2008，18 (5 )：403-4063Boucher D，Hindo J，Averbeck DIncreased repair of gammainduced DNA doublestrand breaks at lower doserate in CHO cellsJCan J Physiol Pharmaco1，2004，82(2)：125-132 4Kasahara T，Kat

16、o TNutritional biochemistry: A new redoxcofactor vitamin for mamalsJNature，2003，422（6934）：8325Urakami T，Yoshida C，Akaike T，et alSynthesis of monoesters of pyrroloquinoline quinone and imidazopyrroloquinoline, and radical scavenging activities using electron spin resonance in vitro and pharmacologica

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