當(dāng)歸注射液對(duì)缺血再灌注損傷心肌細(xì)胞組織化學(xué)變化的影響(一)

1、當(dāng)歸注射液對(duì)缺血再灌注損傷心肌細(xì)胞組織化學(xué)變化的影響(一)    【關(guān)鍵詞】 當(dāng)歸注射液；,缺血再灌注；,心肌；,組織化學(xué)摘 要： 目的：探討當(dāng)歸抗心肌缺血再灌注損傷保護(hù)作用的機(jī)理。方法:將45只SD大鼠隨機(jī)分成3組(每組n=15) :假手術(shù)組(組)，缺血再灌注組(組)，當(dāng)歸治療組(組) ,建立在體心肌缺血再灌注動(dòng)物模型。實(shí)驗(yàn)完畢后，將各組動(dòng)物心肌組織做組織化學(xué)染色，觀察各組動(dòng)物心肌細(xì)胞內(nèi)琥珀酸脫氫酶(SDH)活性。利用HPIAS2000圖像分析系統(tǒng)測(cè)定SDH在以上3組中表達(dá)的平均光密度和平均陽(yáng)性面積率。結(jié)果：當(dāng)歸治療組心肌細(xì)胞中SDH反應(yīng)物呈顆粒狀,均

2、勻分布于肌膜下或肌絲區(qū)之間, 顆粒呈深紫色, 表示酶活性很強(qiáng)；假手術(shù)組酶反應(yīng)物呈淺紫色細(xì)小顆粒狀，肌膜下或肌絲區(qū)之間可見(jiàn)少量的紫色顆粒，分布較稀疏，表示酶活性較弱；缺血再灌注損傷組SDH反應(yīng)物極弱，幾乎未見(jiàn)酶活性表達(dá)。圖像分析結(jié)果顯示當(dāng)歸治療組與假手術(shù)組和缺血再灌注損傷組之間平均光密度及陽(yáng)性面積率的差異有顯著性意義(P0.01)；假手術(shù)組與缺血再灌注損傷組之間平均光密度及陽(yáng)性面積率的差異無(wú)顯著性意義(P>0 05)。結(jié)論：當(dāng)歸注射液對(duì)大鼠缺血再灌注損傷心肌細(xì)胞有重要的保護(hù)作用。關(guān)鍵詞： 當(dāng)歸注射液； 缺血再灌注； 心??； 組織化學(xué) 自1977年Hearse首次提出缺血再灌注損傷概念以來(lái)，

3、已逐漸引起醫(yī)學(xué)界的高度重視。大量動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示，氧自由基、鈣超載、心肌纖維能量代謝障礙、血管內(nèi)皮細(xì)胞、一氧化氮、中性粒細(xì)胞、細(xì)胞黏附分子和細(xì)胞凋亡等均可能參與再灌注損傷的發(fā)病過(guò)程。缺血再灌注損傷對(duì)心肌組織的結(jié)構(gòu)和功能的影響一直是研究的重點(diǎn)之一。當(dāng)歸的藥用價(jià)值早已為人們所認(rèn)識(shí), 從當(dāng)歸的乙醇提取物中分離到6種化合物分別為: (E)藁本內(nèi)酯, (Z)藁本內(nèi)酯, (Z)正丁基呋內(nèi)酯, 棕櫚酸, B2谷甾醇, 阿魏酸。此外還含有蔗糖、多種氨基酸及微量金屬元素、煙酸、丁二酸、腺嘌呤、尿嘧啶、膽堿等成分。當(dāng)歸的藥理作用主要是：促進(jìn)機(jī)體免疫；對(duì)呼吸系統(tǒng)的作用；對(duì)血液循環(huán)系統(tǒng)的作用，有文獻(xiàn)報(bào)道1。 當(dāng)歸對(duì)冠心病

4、患者應(yīng)用當(dāng)歸注射液治療能平衡和抑制血小板聚集的作用，因而能明顯改善胸痛、胸悶等臨床癥狀和心電圖缺血性STT 的變化, 是治療冠心病的有效藥物2。當(dāng)歸具有鈣通道阻滯作用, 拮抗鈣超載, 對(duì)心肌缺血再灌注所致心肌損傷有保護(hù)作用。在缺血及再灌注狀態(tài)下, 心臟順應(yīng)性及射血功能得到良好的保護(hù), 使反映心肌損傷程度的CPK 活性和氧自由基損傷過(guò)程產(chǎn)生的過(guò)氧化脂質(zhì)分解產(chǎn)物MDA 的濃度大大降低3。但當(dāng)歸對(duì)缺血再灌注損傷心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)的影響，目前國(guó)內(nèi)外未見(jiàn)報(bào)道。本研究采用組織化學(xué)方法，并利用HPIAS2000圖像分析系統(tǒng)測(cè)定SDH在以上3組中表達(dá)的平均光密度和平均陽(yáng)性面積率，探討當(dāng)歸抗心肌缺血再灌注損傷保護(hù)作用

5、的機(jī)理。1 材料與方法11 動(dòng)物模型制備及分組健康雄性SD大鼠（SPF級(jí)）45只,體重250300 g 左右，由武漢大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物試驗(yàn)中心提供。腹腔注射戊巴比妥鈉4.5 mg?(100 g)-1 ,麻醉動(dòng)物后行氣管切開(kāi)接微型呼吸機(jī)人工呼吸呼吸頻率60 次?min-1 ,潮氣量2ml?(100g)-1,微型呼吸機(jī)由第二軍醫(yī)大學(xué)生產(chǎn) ,沿胸骨左緣第4 肋骨開(kāi)胸在左心室、右心室與左心房交界處結(jié)扎/ 開(kāi)放左冠狀動(dòng)脈前降支建立心肌缺血再灌注模型。將動(dòng)物隨機(jī)分成3組(每組n = 15):假手術(shù)組(組) ,絲線穿過(guò)冠狀動(dòng)脈前降支但不結(jié)扎；缺血再灌注組( 組) ,缺血再灌注前5min 腹腔注射生理鹽水0. 8

6、 ml?(100 g)；當(dāng)歸治療組( 組),缺血再灌注前5min 腹腔注射當(dāng)歸注射液0.8 ml?( 100g)-1 。每組5只動(dòng)物缺血30min再灌注40min ,10只動(dòng)物缺血30min 再灌注120min。在缺血再灌注開(kāi)始前, 經(jīng)舌靜脈注射伊文氏藍(lán), 缺血40min后心尖無(wú)藍(lán)色且呈烏紅部分為缺血區(qū),再灌注120min 后心肌經(jīng)TTC處理后心尖為白色部分為梗死區(qū)。12 主要試劑25%當(dāng)歸注射液由武漢大學(xué)中南醫(yī)院制藥廠提供,批號(hào)為970118。13 標(biāo)本制作及觀察用Nachlas硝基四氮唑藍(lán)法顯示琥珀酸脫氫酶(SDH)活性。以上各組動(dòng)物實(shí)驗(yàn)完畢后,將各組動(dòng)物從心底部剪取心臟,切下心室。新鮮組

7、織恒冷式切片，片厚10m。 入孵育液中，370C，1560分鐘 孵育液配法：0.2M磷酸緩沖液（pH7.6） 1份 0.2M的琥珀酸溶液 1份 NitroBT水溶液 2份 生理鹽水稍洗； 10%甲醛鹽水固定10分鐘； 15%酒精稍洗1分鐘； 生理鹽水稍洗； 甘油明膠封片。14 圖像分析采用HPLAS2000高清晰度彩色病理圖文報(bào)告管理系統(tǒng)對(duì)酶活性表達(dá)進(jìn)行定量分析,每張切片隨機(jī)選取5個(gè)高倍鏡視野(×400),測(cè)定SDH每個(gè)視野下陽(yáng)性反應(yīng)的平均光密度、陽(yáng)性反應(yīng)面積和所有細(xì)胞總面積,計(jì)算陽(yáng)性面積率。以每例5個(gè)視野的平均光密度、陽(yáng)性面積率的平均值作為該例的測(cè)量值。15 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理用SPSS1

8、1.5軟件對(duì)各組組織化學(xué)反應(yīng)陽(yáng)性顆粒的平均光密度、陽(yáng)性面積率做單因素方差分析和(q)檢驗(yàn),檢驗(yàn)水準(zhǔn)為0.05。2 結(jié)果21 光鏡觀察假手術(shù)組可見(jiàn)心肌細(xì)胞呈短圓柱狀，有分支，但可見(jiàn)部分胞漿溶解。缺血再灌注損傷組見(jiàn)心肌細(xì)胞呈短圓柱狀，有分支，胞漿溶解呈空泡或網(wǎng)狀，細(xì)胞界限模糊，可見(jiàn)心肌細(xì)胞斷裂。當(dāng)歸治療組可見(jiàn)心肌細(xì)胞呈短圓柱狀，有分支，細(xì)胞核呈橢圓形位于中央，胞漿內(nèi)可見(jiàn)平行排列的肌原纖維，細(xì)胞輪廓清晰。22 組織化學(xué)觀察 琥珀酸脫氫酶(SDH) 活性當(dāng)歸治療組心肌細(xì)胞中SDH反應(yīng)物呈顆粒狀,均勻分布于肌膜下或胞漿內(nèi), 顆粒呈深紫色, 表示酶活性很強(qiáng)。假手術(shù)組肌酶反應(yīng)物呈淺紫色細(xì)小顆粒狀，可見(jiàn)少量的

9、紫色顆粒，分布較稀疏，表示酶活性較弱。缺血再灌注損傷組SDH反應(yīng)物極弱，幾乎未見(jiàn)酶活性表達(dá)，表示無(wú)酶活性表達(dá)。經(jīng)單因素方差分析,各組間的差異有顯著性意義(P0.05)，見(jiàn)表1。表1 當(dāng)歸注射液對(duì)大鼠缺血/再灌注損傷心肌細(xì)胞內(nèi)SDH活性影響的平均光密度和陽(yáng)性面積率(略)經(jīng)SNK()檢驗(yàn), 當(dāng)歸治療組與假手術(shù)組和缺血再灌注損傷組之間SDH 活性的平均光密度及陽(yáng)性面積率分別為：當(dāng)歸治療組平均光密度0.4625±0.0875；假手術(shù)組平均光密度0.2684±0.0076；缺血再灌注損傷組平均光密度0.2471±0.0021。當(dāng)歸治療組陽(yáng)性面積率0.4448±0.

10、0918； 假手術(shù)組陽(yáng)性面積率0.1963±0.0824；缺血再灌注損傷組陽(yáng)性面積率0.1841±0.0679。當(dāng)歸治療組與假手術(shù)組比較平均光密度及陽(yáng)性面積率的差異有顯著性意義(P0.01)；當(dāng)歸治療組與缺血再灌注損傷組比較平均光密度及陽(yáng)性面積率的差異有顯著性意義(P0.01)；假手術(shù)組與缺血再灌注損傷組之間比較平均光密度及陽(yáng)性面積率的差異無(wú)顯著性意義(P>0 05)。3 討論局部組織或器官缺血將導(dǎo)致組織或器官的損害，但隨著血供恢復(fù)，在隨后的一定時(shí)間內(nèi)組織或器官的損傷不僅不會(huì)減輕，反而逐漸加重，此即所謂的缺血再灌注損傷（ischemic reperfusion inj

11、ury,IRI）。自1977年Hearse首次提出缺血再灌注損傷概念以來(lái)，已逐漸引起醫(yī)學(xué)界的高度重視。大量動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示，氧自由基、鈣超載、心肌纖維能量代謝障礙、血管內(nèi)皮細(xì)胞、一氧化氮、中性粒細(xì)胞、細(xì)胞黏附分子和細(xì)胞凋亡等均可能參與再灌注損傷的發(fā)病過(guò)程。目前雖然對(duì)缺血或缺血再灌注損傷的確切機(jī)制還不十分清楚,但已經(jīng)知道損傷的臨床結(jié)局主要就是細(xì)胞死亡。細(xì)胞死亡有兩種形式:一種是壞死,另一種是凋亡。凋亡(apoptosis) 是細(xì)胞在基因調(diào)控下的主動(dòng)性死亡,不引起炎癥反應(yīng)。持續(xù)缺血和缺血再灌注時(shí)心肌組織都可發(fā)生細(xì)胞凋亡。已經(jīng)證實(shí),人類(lèi)心肌梗死除細(xì)胞壞死外,細(xì)胞凋亡也參與了梗死的病理過(guò)程,細(xì)胞凋亡不僅影

12、響梗死面積,而且促成心臟結(jié)構(gòu)的重構(gòu),心肌梗死的早期和晚期均存在凋亡現(xiàn)象4。再灌注損傷引起的細(xì)胞凋亡多分布于短暫缺血后血管再通的相關(guān)部位和梗死灶的收縮帶區(qū)域。有資料顯示,心肌梗死急性期的存活心肌其Bcl2 表達(dá)增加,而慢性期Bax表達(dá)增加,說(shuō)明刺激因子由Bcl2和Bax 基因產(chǎn)物來(lái)抑制或誘導(dǎo)存活的心肌細(xì)胞凋亡5。細(xì)胞凋亡的基因調(diào)控是一個(gè)十分復(fù)雜的問(wèn)題,尤其是相關(guān)基因的相互關(guān)系尚不十分清楚。缺血再灌注損傷對(duì)心肌組織的結(jié)構(gòu)和功能的影響一直是研究的重點(diǎn)之一。當(dāng)歸為傘形科植物當(dāng)歸Angelicasinennsis(Oliv.)Diels的干燥根，味甘、辛,性溫。當(dāng)歸能顯著延緩肌肉萎縮,增加肌肉組織SOD

13、的含量,其機(jī)理可能與當(dāng)歸促進(jìn)肌肉血液循環(huán)、改善代謝有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn),應(yīng)用當(dāng)歸注射液對(duì)更年期大鼠進(jìn)行靜脈連續(xù)給藥20天后,血SOD活性明顯增高,脂質(zhì)過(guò)氧化物(LPO)水平下降,說(shuō)明當(dāng)歸注射液可清除氧自由基,抗脂質(zhì)過(guò)氧化物反應(yīng),對(duì)更年期大鼠心血管系統(tǒng)有重要的保護(hù)作用6，7。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)結(jié)扎/松解左冠狀動(dòng)脈前降支復(fù)制心肌缺血再灌注模型，并用當(dāng)歸注射液預(yù)處理，結(jié)果顯示當(dāng)歸治療組心肌結(jié)構(gòu)正常，未受到破壞和影響，且心肌酶的活性很強(qiáng)。心肌細(xì)胞內(nèi)線粒體含量豐富，構(gòu)成細(xì)胞容積的35%40%，含有大量催化三羧酸（TCAC）、氨基酸代謝、脂肪酸分解、電子傳遞以及能量轉(zhuǎn)換的酶和輔酶，LDH 、SDH則是其中的兩種酶。心肌

14、脫氫酶學(xué)改變是心肌損害的早期有意義的指征，缺血心肌脫氫酶的缺失是不可逆性心肌損害的明確指標(biāo)8。我們的實(shí)驗(yàn)也已證明了這一點(diǎn)。因此通過(guò)實(shí)驗(yàn)表明：當(dāng)歸注射液預(yù)處理提高了心肌酶的活性并維持了細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的完整性，對(duì)缺血再灌注心肌細(xì)胞有保護(hù)作用。從以上的實(shí)驗(yàn)結(jié)果和討論來(lái)分析當(dāng)歸注射液為防治缺血再灌注損傷的應(yīng)用具有重要的研究意義，并且為加強(qiáng)心肌保護(hù)作用提供重要的理論依據(jù)。參 考 文 獻(xiàn)1 戴瑞鴻,李勇,范維琥，等. 保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞功能在防治心血管疾病中的重要性. 國(guó)際心血管雜志,2000 ,2 (4) : 3282 謝志泉. 細(xì)胞凋亡與缺血性心臟病. 心血管病學(xué)進(jìn)展,1999 ,20(5) :2793 Ol

15、ivetti G,Abbi R ,Quaini F， et alApoptosis in the failing humanheart.N Eng J Med ,1997,336:11314 Kehl F,Pagel PS,Krolikowski JG,et al.Is Isofluraneinduced Preconditioning Dose Related. Anesthesiology,2002,96(3):6756805 Li F,Hayes JK,Wong KC, et al. Administration of sevoflurance prior to prolonged global ischemia improves heart function in isolated rat hea