植物組織培養(yǎng)實驗中相關(guān)的問題答案-

1、1.為什么頂端分生組織沒有病毒,生長的好?病毒在寄生植物體內(nèi)隨維管束系統(tǒng)轉(zhuǎn)移,在莖尖分生組織中沒有維管束系統(tǒng),病毒運動困難,其移動速度落后于莖尖生長速度,導(dǎo)致頂端分生組織附近病毒濃度低,甚至不帶病毒。、在植物體內(nèi),病毒是通過維管束系統(tǒng)移動的,分生組織不存在維管束系統(tǒng)。病毒在細(xì)胞間移動的另一個途徑是通過胞間連絲移動,速度較慢,難以趕上莖尖分裂旺盛的分生細(xì)胞。分裂旺盛的分生細(xì)胞代謝活性強,使病毒無法復(fù)制。2.超凈工作臺的工作原理?將室內(nèi)空氣經(jīng)粗過濾器初濾,由離心風(fēng)機壓入靜壓箱,再經(jīng)過高效空氣過濾器精濾,由此送出的潔凈氣流從一定的均勻的斷面風(fēng)速通過無菌區(qū),從而形成無塵無菌的高潔凈度工作環(huán)境。將空氣通

2、過由特制的微孔泡沫塑料片層疊合組成的“超級濾清器”后吹送出來,形成連續(xù)不斷的無塵無菌的超凈空氣層流,即所謂“高效的特殊空氣”,它除去了大于0.3m 的塵埃、真菌和細(xì)菌孢子等等。超凈空氣的流速為2430m/min,這已足夠防止附近空氣可能襲擾而引起的污染,這樣的流速也不會妨礙采用酒精燈或本生燈對器械等的灼燒消毒。3.植物組織培養(yǎng)中培養(yǎng)液中的碳源為什么蔗糖最好,為何不用單糖?螯合鐵有何好處?植物在光合作用后合成的碳水化合物一般以蔗糖和淀粉形式儲存,蔗糖可以儲存也方便轉(zhuǎn)運,且植物利用蔗糖的系統(tǒng)很完善,因此培養(yǎng)基用蔗糖。培養(yǎng)基中添加蔗糖而不是葡萄糖,是以大量實驗為基礎(chǔ)的。大量實驗表明,蔗糖能支持絕大多

3、數(shù)植物離體培養(yǎng)物的旺盛生長,因此被作為植物組織培養(yǎng)的標(biāo)準(zhǔn)碳源而廣泛應(yīng)用,大多數(shù)合成培養(yǎng)基也均以蔗糖作為唯一的碳源。其中的原因可能有下列幾個方面:同樣作為碳源和能源物質(zhì),蔗糖較葡萄糖能更好地維持培養(yǎng)基內(nèi)的低滲環(huán)境。配制相同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的培養(yǎng)基,蔗糖形成的滲透壓要明顯低于葡萄糖,若采用葡萄糖作為碳源,易使植物細(xì)胞脫水而生長不良。同時,植物細(xì)胞吸收蔗糖的速率要明顯慢于吸收葡萄糖的速率,所以蔗糖形成的滲透壓可較長時間地保持相對穩(wěn)定。植物組織培養(yǎng)過程中,要特別注意防止培養(yǎng)基受到微生物的污染。微生物生長所需的碳源最適合的是葡萄糖,而較少利用蔗糖,因此采用蔗糖作為培養(yǎng)基的碳源,可在一定程度上減少微生物的污染。從

4、能源供應(yīng)來說,相同物質(zhì)的量濃度下,蔗糖比葡萄糖提供的能量多。使用螯合鐵的目的:避免沉淀;緩慢不斷地供應(yīng)鐵。4.培養(yǎng)基為什么不能太軟?培養(yǎng)基太軟,材料在培養(yǎng)基中不穩(wěn)定,甚至下沉,從而影響組織的呼吸。培養(yǎng)基的硬度可能受到所用瓊脂的質(zhì)量、培養(yǎng)基pH 及無機鹽濃度的影響,滅菌時間過長也回導(dǎo)致培養(yǎng)太軟。5.至少5種滅菌劑的滅菌原理?1.氯化汞氯化汞也稱升汞,是一種劇毒的重金屬鹽殺菌劑,其殺菌的原理是Hg2+可與帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)結(jié)合,使細(xì)菌蛋白變性,酶失活。氯化汞使用濃度為0.1%0.2%,浸泡815分鐘,就可以有效地殺死附著在外植體表面的細(xì)菌及真菌芽孢,滅菌效果極好。但用氯化汞滅過菌的外植體材料要用無菌

5、水反復(fù)多次洗滌(一般不少于5次,才可將殘留的藥劑除凈。使用氯化汞會給環(huán)境造成污染,一般情況下,應(yīng)盡量用其它消毒劑滅菌,而以少用或不用氯化汞為宜。2.次氯酸鈉市售次氯酸鈉又稱為“安替福民”,活性氧含量是0.8%,使用時稀釋35倍,浸泡外植體530分鐘后,再用無菌水洗滌45次。它分解出具有殺菌作用的氯氣,滅菌后易于除去,不留殘余,殺菌力強,對植物材料無害,是植物組織培養(yǎng)常用的殺菌劑之一。3.漂白粉漂白粉為白色的粉末,一般含10%20%(質(zhì)量/體積的次氯酸鈣Ca(ClO2,使用時用飽和溶液,殺菌的原理在于它分解出具有殺菌作用的氯氣。氯與蛋白質(zhì)中的氨結(jié)合,使菌體蛋白質(zhì)氧化,代謝功能發(fā)生障礙。注意漂白粉

6、腐蝕金屬、棉織品,刺激皮膚,易吸潮散失有效氯而失效,平時要密封儲藏,最好現(xiàn)配現(xiàn)用,不要儲藏太久。4.酒精酒精(乙醇具有較強的穿透力和殺菌力,它使細(xì)菌蛋白質(zhì)變性。使用的濃度一般為70%75%。處理時間1530秒,不宜太長,因為細(xì)胞容易收縮脫水。它具有浸潤和滅菌的雙重作用,使用于表面消毒,但不能達(dá)到徹底的滅菌,必須結(jié)合其它藥劑滅菌。為了提高乙醇的殺菌效果,可在乙醇溶液中加入0.1%的酸或堿,以改變細(xì)胞表面帶電荷的性質(zhì)而增加膜透性,提高乙醇的滅菌效果。5.高錳酸鉀高錳酸鉀的滅菌原理在于它能使細(xì)菌酶蛋白中的巰基氧化成二硫基而失去酶活性。濃度稀時起氧化作用殺死細(xì)菌,日常生活中通常用作皮膚、果蔬的表面消毒

7、劑,在一盆清水中加入幾粒高錳酸鉀就可起到殺菌的作用。6.植物組織培養(yǎng)中脫除病毒的方法及其優(yōu)缺點。熱處理是利用病毒和寄主植物對高溫的忍耐性的差異,使植物的生長速度超過病毒的擴散速度,得到一小部分不含病毒的植物分生組織,進(jìn)行無毒個體培育。常用的方法是將病毒感染的植物用3538熱空氣處理24周或者更長時間進(jìn)行脫毒。此法尤其適合處理生理干旱的材料和處于休眠狀態(tài)的果樹。熱處理法中,最主要的影響因素是溫度和時間。Bhardwaj等發(fā)現(xiàn)在熱空氣處理過程中,通常溫度越高、時間越長、脫毒效果就越好,但是同時植物的生存率卻呈下降趨勢。所以溫度選擇應(yīng)當(dāng)考慮脫毒效果和植物耐性兩個方面。洪霓等在梨病毒的脫毒研究中采用兩

8、種處理,一為恒溫處理,溫度控制在37±1;二為變溫處理,溫度為32和38每隔8h變換一次,發(fā)現(xiàn)變溫處理比恒溫處理植株死亡率低,脫毒效率高。該項技術(shù)要求的設(shè)備條件比較簡單,脫毒操作也比較容易。主要缺點是脫毒時間長,脫毒不完全,例如TMV這類桿狀病毒就不能用這種方法脫除,因而該方法有一定的局限性。莖尖培養(yǎng)脫毒的原理是植物體內(nèi)病毒靠維管束系統(tǒng)移動,分生組織中沒有維管束存在,病毒只靠胞間連絲移動,速度很慢,難以追上生長活躍的分生組織,所以旺盛生長的根尖、莖尖一般都無病毒或很少有病毒分布。莖尖培養(yǎng)中最主要的影響因素就是莖尖大小,一般要求莖尖長度小于1mm。技術(shù)上通常切取莖尖越小,脫毒效果越好,

9、但是莖尖培養(yǎng)成活率變低。莖尖培養(yǎng)脫毒法脫毒率高,脫毒速度快,能在較短的時間內(nèi)得到較多的原種繁殖材料,但這種方法存在的缺點是植物的存活率低。為了克服這一缺點,現(xiàn)在經(jīng)常是將熱處理與莖尖培養(yǎng)相結(jié)合來使用。熱處理與莖尖培養(yǎng)相結(jié)合之所以能夠提高脫毒效果,是由于熱處理可使植物生長本身所具有的頂端免疫區(qū)得以擴大,有利于切取較大的莖尖(在1mm左右,從而能夠提高培養(yǎng)或嫁接的成活率。董雅鳳等在梨樹蘋果莖溝病毒的脫毒技術(shù)研究中發(fā)現(xiàn),梨莖尖培養(yǎng)比較困難,且脫毒效果差,成活率僅為28%。熱處理后進(jìn)行莖尖培養(yǎng),成活率和脫毒率比單純莖尖培養(yǎng)平均增加11.7%和54.3%。抗病毒藥劑法是一種新的脫毒方法,其作用原理是抗病毒

10、藥劑在三磷酸狀態(tài)下會阻止病毒RNA帽子結(jié)構(gòu)形成。常用的抗病毒化學(xué)藥物有三氮唑核苷(病毒唑,5-二氫尿嘧啶(DHT和雙乙酰-二氫-5-氮尿嘧啶(DA-DHT。這些藥物常常通過直接注射到帶病毒的植株上,或者加到植株生長的培養(yǎng)基上。這種方法一般要與莖尖培養(yǎng)相結(jié)合應(yīng)用。經(jīng)過抗病毒藥劑處理的嫩莖,切取莖尖,再進(jìn)行組織培養(yǎng),就會提高脫毒率和成活率。采用病毒抑制劑與莖尖培養(yǎng)相結(jié)合的脫毒方法,可以較容易的脫除多種病毒,而且這種方法對取材要求不嚴(yán),接種莖尖可大于1mm,易于分化出苗,提高存活率。有些病毒比較難去除,單獨使用其中某一個方法很難獲得成功,所以有人將熱處理、抗病毒藥劑和莖尖培養(yǎng)相結(jié)合使用,效果更好。7

11、.無病毒株系的檢測方法及其原理。1.指示植物法當(dāng)原始寄主的癥狀不明顯時,就可用指示植物法,這是因為指示植物比原始寄主更容易表現(xiàn)癥狀。具體做法是將病葉研磨,把汁液接種到寄主植物上,對于木本植物,是將原始寄主嫁接到指示植物上。指示植物法簡便易行,成本低,但它靈敏性差,所需時間長,難以區(qū)分病毒種類。2.酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISAELISA是一種免疫酶技術(shù),它是本世紀(jì)70年代在熒光抗體和組織化學(xué)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種新的免疫測定技術(shù),是在不影響酶活性和免疫球蛋白分子的反應(yīng)條件下,使酶分子和免疫球蛋白分子共價結(jié)合成酶標(biāo)記抗體。酶標(biāo)記抗體可直接或通過免疫橋與包被在固相支持物上待測定的抗原或抗體特異性結(jié)合,

12、來檢測病毒的存在。ELISA方法依據(jù)支持物的不同,可分為雙抗體夾心法(DAS-ELISA和硝酸纖維素膜(NCM-ELISA。(1DAS-ELISA 這種方法是以聚苯乙烯塑料管或血凝滴定板為支持物,采用直接ELISA,基本步驟是先加入第一抗體,再依次加入病毒提取液、第二抗體、底物,所以叫做雙抗體夾心。DAS-ELISA方法檢測病毒,特異性強,非常適合于大規(guī)模的檢測,該方法可檢測出110ng/mL的抗原濃度,通過分光光度計可測定出病毒含量,對脫毒苗的確認(rèn)極具應(yīng)用價值。(2NCM-ELISA 又稱Dot-ELISA,該種方法是以NCM為固相載體,通常采用間接ELISA,基本步驟是首先將待測樣品點在N

13、CM膜上,然后依次加入病毒第一抗體,第二抗體,底物。此法與常規(guī)法相比有很多優(yōu)點,NCM對蛋白質(zhì)有較高的親和力,提供蛋白較大的結(jié)合表面,使檢測的靈敏度提高,而且反應(yīng)產(chǎn)生鮮明的色斑,形成強烈的對比;NCM法測定所需的最低病毒量低于常規(guī)ELISA。3. 免疫電鏡法(ISEM植物病毒免疫電鏡檢測是利用植物病毒特異性的抗體,使它誘捕或包被病毒的粒體,產(chǎn)生免疫吸附反應(yīng)。將此程序制備的載網(wǎng),放到電子顯微鏡下觀察。此法鑒定植物脫毒苗病毒能夠保證核心種苗的質(zhì)量,而且快速準(zhǔn)確,反應(yīng)靈敏。但是電鏡方法的缺點是受條件限制,操作要求嚴(yán)格,不適于普及應(yīng)用。此外,Ig指示試紙法,病毒細(xì)菌協(xié)同凝集法(VB,也可以用來檢測病毒

14、。4.反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCRRT-PCR的基本原理是以所需檢測的病毒RNA為模板,反轉(zhuǎn)錄合成cDNA,從而使極微量的病毒核酸擴增上萬倍,以便于分析檢測。RT-PCR 的基本步驟是:首先提取病毒RNA,根據(jù)病毒基因序列設(shè)計合成引物,反轉(zhuǎn)錄合成cDNA,然后進(jìn)行cDNA擴增。取出擴增產(chǎn)物,利用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測。RT-PCR技術(shù)與免疫學(xué)方法相比較不需要制備抗體,而且檢測所需的病毒量少,具有靈敏、快速、特異性強等優(yōu)點。(1簡并引物PCR技術(shù)根據(jù)不同病毒間的同源保守序列,設(shè)計簡并性引物,而使一次實驗?zāi)軌驒z測多種病毒。(2免疫捕捉PCR技術(shù)在進(jìn)行RT-PCR擴增反應(yīng)前,利用病毒?；钥贵w與

15、病毒抗原相結(jié)合的原理,將目標(biāo)病毒固定在微管或微板等固相上,經(jīng)洗脫處理后富集病毒,再進(jìn)行RTPCR反應(yīng)這樣不僅避免了常規(guī)RT-PCR的RNA樣品制備的損失和破壞,而且捕捉RNA的效率達(dá)96%以上。(3多重PCR技術(shù)多重PCR就是在一個單一反應(yīng)中擴增多個序列,能夠節(jié)省時間與精力。RT-PCR技術(shù)與免疫學(xué)方法相比較不需要制備抗體,而且檢測所需的病毒量少,具有靈敏、快速、特異性強等優(yōu)點,是一種比較有前途的檢測方法。5.核酸斑點雜交技術(shù)(NASHNASH是根據(jù)互補的核酸單鏈可以相互結(jié)合的原理,將一段核酸單鏈以某種方式加以標(biāo)記,制成探針,與互補的待測病原核酸雜交,帶探針的雜交物指示病原的存在。此法存在的缺

16、點是在檢測大量樣品時,探針的分離比較困難33。此外,PCR微量板雜交法17,蛋白質(zhì)電泳法27也可以用來檢測植物病毒。8.植物組織培養(yǎng)如何克服玻璃化和褐變現(xiàn)象?玻璃化指在組織培養(yǎng)過程中,有些植物的嫩莖、葉片往往會呈現(xiàn)半透明狀,水浸狀的現(xiàn)象,又稱過度水化。玻璃苗的分化能力低下,難以增殖生根成苗,這是一種生理失調(diào)癥。目前已報道出現(xiàn)玻璃化苗的植物已達(dá)7O多種。隨著玻璃化產(chǎn)生機理研究的深入,某些植物的玻璃化已得到了有效的控制。主要措施有:(1選擇不易玻璃化的基因型及部位做外植體;(2采取改善氧氣供應(yīng)狀況和通氣條件,控制溫度,適當(dāng)?shù)蜏靥幚?降低容器內(nèi)相對濕度;(3適當(dāng)提高蔗糖含量,降低培養(yǎng)基中的水勢。(4

17、適當(dāng)降低培養(yǎng)基中的細(xì)胞分裂素和赤霉素濃度,或者適當(dāng)增加培養(yǎng)基中的Ca2+、Mg、Mn、K、P、Fe、Zn、Cu元素含量,降低N和Cl元素比例,尤其是降低氨態(tài)氮濃度,提高硝態(tài)氮含量;(5增加自然光照或控制溫度,通過高、低溫處理防治玻璃化;(6在培養(yǎng)基中添加間苯三酚、根皮苷、多效唑、矮壯素等添加物。褐變包括酶促褐變和非酶促褐變,目前認(rèn)為植物組織培養(yǎng)中的褐變主要是由酶促褐變引起的。酶促褐變必須具有酶、底物和氧3個條件。由于PPO是一種含銅離子的蛋白質(zhì),因此,尋找良好的抗褐變劑可從3個方面人手: (1用將Cu絡(luò)合掉使酶失活的物質(zhì),如植酸(PA和乙二胺四乙酸鈉鹽(EDTA等;(2加入與酶蛋白和底物的結(jié)合部位能夠結(jié)合的酶抑制劑,從而抑制醌類的產(chǎn)生;(3加人能減少酚類或使醌類還原的物質(zhì),如活性碳(Ac、抗壞血酸(Vc、聚乙烯吡咯烷酮等。由于不同物種的PPO存在著性質(zhì)上的差異,適宜不同植物抗褐變劑也會有所不同。從理論上講,酶促褐變可以通過以下3種方法加以