第五章酶與細(xì)胞固定化技術(shù)

1、第五章酶與細(xì)胞的固定化技術(shù)教學(xué)目的：使學(xué)生了解并掌握固左化酶（細(xì)胞、原生質(zhì)體）的概念及意義，掌握酶的常用固 定化技術(shù)，了解固定化爾的性質(zhì)。教學(xué)重點(diǎn)、難點(diǎn)：固肚化酶（細(xì)胞、原生質(zhì)體）的疇，種固泄化技術(shù)。固左化酶（細(xì)胞、 原生質(zhì)體）的疇，半透膜包埋法。教學(xué)方法：講授教學(xué)手段：多媒體第一節(jié)概述一、游離酶使用中的局限性：1. 提取純化繁瑣，價(jià)格昂貴2難以重復(fù)使用3. 穩(wěn)定性差二、固建化酶研究克服游離酶缺點(diǎn)的方法之一50年代開始60年代后期，固定化技術(shù)迅速發(fā)展1969年，千田一郎首次在工業(yè)生產(chǎn)規(guī)模應(yīng)用固左化氨基?；笍腄L-AA連續(xù)生產(chǎn)L-AA實(shí)現(xiàn) 酶應(yīng)用史上的一大變革三、基本概念1、固左化酶（1971

2、第一次國際酶工程學(xué)術(shù)會(huì)議）（Immobilized Enzyme）指在一泄空間圉呈閉鎖狀態(tài)存在的酶，能連續(xù)地進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)后的酶可以回收重復(fù) 利用。包括酶與不溶性載體結(jié)合的“固相酶"“水不溶性酶“及包埋在凝膠或超濾裝苣中 的酶。2、固定化細(xì)胞（原生質(zhì)體）指被限制自由移動(dòng)的細(xì)胞，即細(xì)胞受到物理化學(xué)等因素約束或限制在一左空間用，但 細(xì)胞仍保留催化活性并具有能被反復(fù)或連續(xù)使用的活力。四、固定化酶優(yōu)點(diǎn)增加了酶的穩(wěn)左性能降低酶的總體費(fèi)用酶的分離和回收變得容易，并可重復(fù)使用使反應(yīng)過程的連續(xù)操作成為可能反應(yīng)產(chǎn)物也易于提取純化有利于過程設(shè)計(jì)和優(yōu)化拓廣了酶的應(yīng)用用（多酶系統(tǒng)的酶反應(yīng)，非水相酶反應(yīng)，生物

3、傳感器探頭等）第二節(jié)、酶的固定化方法一、酶的固泄化方法1、酶的固泄化方法（四大類方法）1）吸附法2）包埋法3）交聯(lián)法4）化學(xué)共價(jià)法英它（酶的逆膠朿包囊法）一、酶的固定化方法2、選擇方法依據(jù)：（1）酶的性質(zhì)載體的來源、價(jià)格、機(jī)械性能、載體的功能基團(tuán)和交聯(lián)度等制備方法簡便易行3-衡量依據(jù):（D測泄固泄化酶的活力，以確泄固泄化過程的活力回收率： 研究它的最適反應(yīng)條件（底物濃度、pH值、溫度、離子強(qiáng)度等）；穩(wěn)宦性和不穩(wěn)定原因的探究：對(duì)酶進(jìn)行人工修飾，使其與載體的結(jié)合達(dá)到較為理想的構(gòu)型和相容性。（-）吸附法1、原理：主要是利用細(xì)胞與載體之間的吸引力（徳華力、離子鍵和氫鍵），使細(xì)胞固定在 載體上，常用的吸

4、附劑有玻璃、瓷、硅藻土、多孔塑料、中空纖維等。此外還可利用專一的親和力來固泄細(xì)胞，例如伴刀豆球蛋白A與a 甘露聚糖具有親和 力，而釀酒酵母細(xì)胞壁上含有a甘露聚糖，故可將伴刀豆球蛋白A先連接到載體上，然后 把酵母連接到活化了的伴刀豆球蛋白上。2、酶材料：酶或結(jié)合在菌體（死細(xì)胞）及細(xì)胞碎片上的酶或酶系。3、優(yōu)缺點(diǎn)：操作簡便，條件溫和，不會(huì)引起爾的變性失活，載體廉價(jià)易得，且可反復(fù)利用；缺點(diǎn)是蛋白質(zhì)與載體之間的結(jié)合相當(dāng)弱，而且很多情況下,酶的非特異性吸附常常會(huì)引 起部分或全部失活，高濃度的鹽溶液或底物溶液又將加速蛋白質(zhì)的脫附因此當(dāng)要求酶 的固定絕對(duì)牢靠時(shí),采用吸附法是很不可靠的.4、常用吸附劑各種礦物

5、質(zhì)以及無機(jī)載體（氧化鋁，氧化鐵，氧化鈦，硅藻土，多空瓷，多空玻璃，疑 基磷灰石等），及天然高分子載體淀粉、白蛋白等，最常用的吸附劑是離子交換劑竣甲 基纖維素，DEAE-纖維素、DEAE-匍萄糖，合成的陰離子和陽離子交換劑離子交 換劑主要靠靜電吸引，缺點(diǎn)是當(dāng)離子強(qiáng)度增加或介質(zhì)的pH、溫度變化時(shí)，這種結(jié)合發(fā) 生分解。5、舉例：將伴刀豆球蛋白A-瓊脂糖4B 50ml （在 10mM PBS pH 7.4 含 0.5M NaCl,lmM CaCl2和mM MnCh）與酶液（lOmg/ml） 5ml4°C,攪勻過夜，便成瓊脂糖復(fù)合物，ffllOmMNaAc pH4.5 （lmMCaC12和lm

6、MnCb）充分洗滌，直至測不出活性為度，最后再懸浮于10ml NaAc PBS 中備用。（二）包埋法1、概念：指將酶或含酶菌體包埋在各種多空載體中，使酶固左的方法?？煞譃槟z包埋法（網(wǎng)格型）和半透膜包埋法（微囊型）兩種。2、優(yōu)缺點(diǎn)：一般不需酶的AA殘基進(jìn)行結(jié)合反應(yīng)，很少改變酶的髙級(jí)結(jié)構(gòu)，酶活回收率高：缺點(diǎn)是包埋時(shí)發(fā)生化學(xué)聚合反應(yīng)，酶易失活，須巧妙設(shè)計(jì)反應(yīng)條件。另外網(wǎng)格結(jié)構(gòu)影 響底物和產(chǎn)物的擴(kuò)散，有時(shí)，這種擴(kuò)散會(huì)導(dǎo)致酶動(dòng)力學(xué)行為的改變，所以此法只適合 于小分子底物和產(chǎn)物的酶。3、海藻酸鹽包埋法海藻酸鈉與Ca2Mg2+,AP+多價(jià)離子間的轉(zhuǎn)移凝膠作用形成固泄化細(xì)胞顆粒缺點(diǎn)：在髙濃度電介質(zhì)（K+.N

7、a+）溶液中，固定化顆粒變得不穩(wěn)泄.02+等多價(jià)離子在磷酸緩沖溶液中易形成沉淀個(gè)定化顆粒溶解優(yōu)點(diǎn)：海藻酸鹽價(jià)格便宜包埋條件溫和4、角叉菜糖包埋法K-角叉菜是一種含有許多硫酸根基團(tuán)的多糖化合物在K+離子存在下，它能立即 生成凝膠.缺點(diǎn)：對(duì)高濃度的Na+離子敏感固泄化溫度高，需要在37°C55°C5、聚丙烯酰胺凝膠在含酶（或細(xì)胞）的水溶液中，加入一泄比例的單體丙烯酰胺和膠聯(lián)劑N,Ni甲撐 雙丙烯酰胺然后在催化劑（二甲氨基丙臘）和引發(fā)劑（過硫酸鉀）的作用下低溫（冰?。┚?合，形成凝膠缺點(diǎn)：丙烯酰胺對(duì)酶具有變性作用6、聚乙烯醇（PVA）包埋法磷酸鹽硬化法，循環(huán)冷凍法，硼酸硬化法硼酸

8、硬化法：將聚乙烯醇在7（rc8（rc進(jìn)行水浴加熱至完全溶解，然后冷卻至35°C,與酶溶液 （細(xì)胞懸浮液）混勻，滴加到飽和硼酸溶液中優(yōu)點(diǎn):原材料價(jià)格便宜條件溫和無毒害作用循環(huán)冷凍法硼酸硬化法7、半透膜包埋法7.1界而沉淀法利用某些髙聚物在水相和有機(jī)相的界而上溶解度極低而形成被膜將酶包埋。操作：酶液在油溶性表而活性劑存在下在水不互溶的有機(jī)相中乳化形成油包水的微滴，再將 溶于有機(jī)溶劑的高聚物加入乳化液中，然后加入一種不溶解髙聚物的有機(jī)溶劑，使高 聚物在油-水界而上沉淀析出，形成膜將酶包埋，最后在乳化劑幫助下由有機(jī)相移入水 相。7、半透膜包埋法7.2界而聚合法利用親水性單體和疏水性單體在界面

9、發(fā)生聚合的原理包埋酶。例：將含10%血紅蛋白的酶液與1, 6己二胺的水溶液混合，立即在含1%司盤-85的氯仿-環(huán)己 烷中分散乳化，再加入溶于有機(jī)相的葵二酰氯后，便在油-水界而上發(fā)生聚合反應(yīng)，形 成尼龍膜，將酶包埋。（三）交聯(lián)法基本原理：酶分子和多功能試劑之間形成共價(jià)鍵得到三向的交聯(lián)網(wǎng)架結(jié)構(gòu)，以戊二醛使用最 廣泛OHC （CH2） sCHO,使載體的氨基和酶蛋白中的氨基交聯(lián)形成席夫堿（基）Shiff堿將 酶固左化。含氨基的載體，可用氯乙基纖維素（纖維素-OCH2CH2NH2）,二乙氨乙基纖維 素（DEAE-纖維素）。雙功能試劑除了戊二醛外，還有乙撐二異鼠酸酯OCN （CH2）6NCO。 交聯(lián)劑的

10、特點(diǎn)：帶有二個(gè)以上的功能基團(tuán)。反應(yīng)比較劇烈條件比較嚴(yán)格。操作方 便，活力回收不高。固泄化分兩步進(jìn)行，第一步形成可溶性分子間交聯(lián)絡(luò)合物，第二步是快速反應(yīng)導(dǎo)致固化。 交聯(lián)法有5種形式： 酶直接交聯(lián)法在酶液中加入適疑多功能試劑，使其形成不溶性衍生物。固定化依賴酶與試劑的濃度、溶液 pH和離子強(qiáng)度、溫度和反應(yīng)時(shí)間之間的平衡。此法操作簡單，一種多功能試劑可制備許多 酶衍生物，但缺乏選擇性，難于避免分子交聯(lián)，活力回收往往不高。 酶輔助蛋白交聯(lián)：為避免分子交聯(lián)和在交聯(lián)過程中因化學(xué)修飾而引起失活，可使用第二個(gè) “載體"蛋白質(zhì)（即輔助蛋白質(zhì)，如白蛋白、明膠、血紅蛋白等）來增加蛋白質(zhì)濃度，使酶與 惰性蛋

11、白質(zhì)共交聯(lián)。實(shí)用中，當(dāng)酶蛋白、無酶活性蛋白與戊二醛混合（戊二醛最終濃度0.7%） 后，混合液粘度開始提高時(shí)，立即鋪膜，或者在酶蛋白戊二醛與輔助蛋白混合后，經(jīng)-30°C 低溫處理，再預(yù)熱至4°C而得泡沫狀蛋白質(zhì)共聚物。這種固泄化酶為多孔性，活力回收比酶 直接交聯(lián)髙，機(jī)械性能也有改進(jìn)。 吸附交聯(lián)法：先將酶吸附在硅膠、皂上、氧化鋁、球狀酚醛樹脂或英他大孔型離子交換樹 脂上，再用戊二醛等雙功能試劑交聯(lián)。用此法所得固定化酶也可稱為殼狀固左化酶。此法用 于胞外酶的固宦化較好，尤其是從發(fā)酵液和粗酶制劑中直接固定化時(shí)，載體的選擇性吸附有 一泄純化作用，而酶分子之間的共價(jià)交聯(lián)又保證酶分子緊緊

12、地結(jié)合于載體上，而且酶分子僅 存在于載體表而，使固定化酶與底物接觸良好。由于載體本身有較好機(jī)械性能，所以產(chǎn)生的 固泄化酶裝柱流動(dòng)性能好，缺點(diǎn)是必須保證酶吸附在載體上。 載體交聯(lián)法：用多功能試劑的一部分功能基團(tuán)化學(xué)修飾髙聚物載體，而其中另一部分功能基團(tuán)偶連酶蛋 白。也可利用多功能試劑的一部分功能基團(tuán)與一種聚合物的單體反應(yīng)，反應(yīng)后再與酶一起共 聚。 交聯(lián)包埋法：把酶液和雙功能試劑（戊二醛）凝結(jié)成顆粒很細(xì)的集合體，然后用髙分子或多糖一類物質(zhì)進(jìn) 行包埋成顆粒。這樣避免顆粒太細(xì)的缺點(diǎn)，同時(shí)制得的固泄化酶穩(wěn)泄性好戊二醛交聯(lián)法缺點(diǎn)：雙功能基團(tuán)試劑與酶蛋白的交聯(lián)作用，常引起蛋白質(zhì)高級(jí)結(jié)構(gòu)的改變，使酶失活。 為

13、了避免或減少酶在交聯(lián)過程中失活，可在被交聯(lián)的酶蛋白溶液中添加一左量的輔助 蛋白。（四）化學(xué)共價(jià)法1、概念所謂共價(jià)法就是使酶蛋白的非必需基團(tuán)（-NH2,-OH.-COOH.-SH.酚基，咪呼基，呵唏基）通 過共價(jià)鍵和不溶性載體形成不可逆的聯(lián)接。要使載體與酶形成共價(jià)鍵，必需首先使載體活化, 接上一活潑基團(tuán)，再與酶反應(yīng)2、用于共價(jià)法固定的酶蛋白上的功能基團(tuán)：1）氨基-賴氨酸上的。氨基以及多肽鏈N末端氨基酸上的a-氨基；2）竣基-雙竣基氨基酸:門冬氨基酸和谷氨酸上的游離拔基，以及多肽鏈末端的a-竣基；3）酪氨酸上的苯酚環(huán)；4）半胱氨酸上的既基；5）疑基-絲氨酸，氨酸以及酪氨酸上的疑基6）組氨酸上的咪哇

14、基；7）色氨酸上的眄I唏基其中以氨基和竣基為最常用3、一般認(rèn)為共價(jià)法的特點(diǎn)如下： 酶和載體的結(jié)合比較牢固，酶不易脫落。故使用的半衰期較長。 制備條件復(fù)雜，反應(yīng)劇烈，易引起酶蛋白高級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。 制備得到的固泄化酶，活力回收一般在50%左右。 載體不會(huì)引起蛋白質(zhì)的變性，經(jīng)得起一左的pH,濃度的改變。4、常用載體（1）天然高分子。如纖維素，葡聚糖凝膠（Sephadex）,瓊脂糖（AgaroseSepharose）,卡 那膠，淀粉以及它們的衍生物。（利用-OH）人工合成的髙聚物，如聚丙烯酰胺，聚苯乙烯，聚乙烯醇，氨基酸共聚物等。（利用-NHz）無機(jī)載體，如多孔玻璃，硅膠等。（要加上一個(gè)基團(tuán)）5、技

15、術(shù)要點(diǎn)（1）將所選用的載體上的有關(guān)基團(tuán)活化，然后和酶蛋白上有關(guān)基團(tuán)發(fā)生偶聯(lián)反應(yīng)。（直接 活化或另接一反應(yīng)基團(tuán)）在選用的載體上接上一個(gè)雙功能試劑，然后將酶蛋白和雙功能試劑偶聯(lián)。（接手臂）6、分類：重氮法；（2）疊氮法：縮合法；烷化反應(yīng)法；硅烷化反應(yīng)法：浪化鼠法。（1）重氮法目前在我們國用的較多的載體是對(duì)氨基苯磺酰乙基（ABSE）纖維素、瓊脂糖，葡聚糖凝膠 和瓊脂等，用這些載體制備了不少固定化酶。方法原理如下： 用雙功能試劑卩-硫酸酯乙颯基苯胺（SESA）,連接于被活化（-0H）的纖維素等載體 上制備成ABSE-纖維素，瓊脂糖等。 在鹽酸和.亞硝酸鈉處理下把ABSE-纖維素變成重氮鹽。 把酶偶聯(lián)于

16、ABSE-纖維素上疊氮法是在酚分子與載體間形成肽鍵的固定化方法。主要是含竣基載體，轉(zhuǎn)變成?；B氮氯化物，異氛酸鹽等活化形態(tài)的衍生物，然后與酶的游 離氨基反應(yīng)，從而形成肽鍵。例：用竣甲基纖維素疊氮衍生物制備固立化胰蛋白酶，步驟如下：酯化：CM-纖維素依 次用水、乙醇、乙礎(chǔ)洗滌干燥，然后懸于無水甲醇中，在冰浴入HC1氣體，進(jìn)行酯化反應(yīng): 最后用甲醇、乙陋洗滌，空氣干燥。腓解:把酯化后的CW纖維素懸于甲醇中，再加入80% 水合腓回流反應(yīng)1小時(shí)，過濾，甲醇洗滌干燥。疊氮化:耕解后的CM-纖維素（lg）加入 150ml 2% HC1在冰浴中混合，攪拌滴加9ml 3% NaNO2反應(yīng)20min,過濾用冷蒸

17、憾水洗滌， 同時(shí)加酶，防止戊二醛的另一醛再與載體上另一個(gè)-NH反應(yīng)。（4）偶聯(lián)：經(jīng)疊氮化后的載 體加入0.05N pH 8.0磷酸緩沖液（含250-500mg酶）,5°C攪拌2-3小時(shí),過濾用0.001NHCL 水洗滌，即為固左化胰蛋白酶（凍干保存）縮合法（對(duì)含-NH.COOH載體的另一種方法）主要利用具有竣基或氨基的載體，加入 到酶液中，在縮合劑破化二亞胺（雙環(huán)己基碳酰胺）作用下，使載體的撥基或氨基和酶蛋白 上的NH2或COOH形成肽鏈而被固建。含竣基的載體有竣甲基纖維素，竣甲基交聯(lián)葡聚糖等。含氨基的載體有氨乙基纖維素，多孔玻璃氨基硅烷衍生物。烷基化反應(yīng)法。將含有鹵素官能團(tuán)試劑與非

18、水溶性的纖維素載體進(jìn)行烷化反應(yīng)，然后和 酶進(jìn)行偶聯(lián)制得固立化酶。一般常用三氯三嗪基試劑活化纖維素，然后偶聯(lián)酶（交聯(lián)匍聚糖, 瓊脂糖，多孔玻璃等）。硅烷化法：多孔玻璃特點(diǎn)：機(jī)械強(qiáng)度好，表而積大。耐有機(jī)溶劑和微生物破壞。載體可以再生，壽命長等。一般常用的載體：多孔玻璃，多孔瓷。這些多孔玻璃的孔徑在250-1000埃之間，含SiO2 96%,由于粒度很細(xì)，每1克所擁有的表 而積達(dá)100平方米（氧化鈉，氧化硼，氧化硅經(jīng)熱處理原子重組而成，是優(yōu)良載體，但必須 加以改造）。本法進(jìn)行酶的固定化可分三個(gè)步驟：將本體接上一個(gè)結(jié)合劑（也即硅烷化）；接上功 能基團(tuán)；把酶共價(jià)結(jié)合于載體。浪化氛法-異服鍵合法本方法主要

19、用浪化鼠（CNBr）活化多糖類物質(zhì)。如纖維素、匍聚糖、瓊脂糖等，其中以瓊 脂糖為載體的占多數(shù)（大孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)）。用浪化鼠法活化瓊脂糖制備得到的固泄化酶 目前使用很廣，特別用作親和層析，有著良好的性能。上述這些載體在髙pH條件下（pHll左右），渙化魚和多糖一類物質(zhì)形成一種環(huán)化的活潑 的亞氨碳酸鹽，該化合物對(duì)蛋白質(zhì)上的NHi反應(yīng)十分敏感，生成N-取代異服，N-取代.亞氨 碳酸酯和N-取代氨基甲酸酯。其中主要產(chǎn)物為N-取代異腮，反應(yīng)式如右： 例：胰蛋白酶的固定-均在VC時(shí)進(jìn)行。（1）活化：稱取瓊脂糖凝膠100mg （Sepharose 4B）,用0.5M NaCl和HQ洗滌，除去保護(hù) 劑和防腐劑，然

20、后按lml沉淀凝膠加入50300mgCNBr。立即用2N NaOH調(diào)pH值1011, 維持pH值11, pH值不再下降，直到反應(yīng)終止。反應(yīng)在25°C通風(fēng)櫥進(jìn)行，反應(yīng)僅需10分鐘, 這樣CNBr將載體全部活化，生成活潑的亞氨碳酸鹽。反應(yīng)完畢后，用冰水和冷0.1MpH9.5 NaHCCh洗滌（注意：切忌用帶有-NH?基的緩沖液來洗滌，因?yàn)閬啺碧妓猁}對(duì)NH一敏感， 在酶偶聯(lián)時(shí)，活性部位被NH?占領(lǐng)，酶偶聯(lián)不上），去除多余CNBr和雜蛋白。偶聯(lián)：用偶聯(lián)緩沖液（O.O25MpH 10.2硼酸緩沖液-0.02MCaC12或NaHCO3平衡洗滌， 抽V，加入5ml緩沖液（含16mg酶）溫度降至4&

21、#176;C,攪拌反應(yīng)4小時(shí)，最后分別用0.1MpH8.5 硼酸緩沖液-lMNaCl洗滌即成醋酸緩沖液去除各種雜質(zhì)第三節(jié)細(xì)胞的固定化方法一、吸附法同酶的方法，（1）酵母細(xì)胞帶負(fù)電荷，在pH3-5的條件下能吸附在多孔瓷或多孔塑料 等載體表而，制成固泄化細(xì)胞（2）霊菌的菌絲可吸附在多孔塑料、金屬絲網(wǎng)等載體上來固 立化（3）植物細(xì)胞可吸附在中空纖維外壁上固立化（4）動(dòng)物細(xì)胞大多具有附壁生長特性, 須依附在固體表而才能生長，可吸附在容器壁，微載體（顆粒細(xì)小的載體，直徑100-200um） 和中空纖維外壁等載體上來固定（培養(yǎng)液在中空纖維流動(dòng)）。二、包埋法同酶包埋法例：海藻酸鈣-聚賴氨酸(ALG-PLL)

22、包埋技術(shù)動(dòng)物細(xì)胞先用海藻酸鈣凝膠包埋-聚賴氨酸處理，使膠粒外層包上一層聚賴氨酸薄膜-檸 椽酸鈉溶液處理，使海藻酸鈣凝膠溶解-聚賴氨酸膜包被的近乎透明的微囊型固定化 動(dòng)物細(xì)胞。三、原生質(zhì)體固左化可解決胞酶的生產(chǎn)利于氧的傳遞，營養(yǎng)成分的吸收一般采用凝膠包埋法包括原生質(zhì)體的制備和固左兩個(gè)步驟1原生質(zhì)體的制備要求：保持膜的完整性，不能使細(xì)胞部的結(jié)構(gòu)遭到破壞制備：對(duì)數(shù)期細(xì)胞的收集高滲溶液中加酶破壁分離除去細(xì)胞碎片、完整的細(xì)胞及酶(密 度梯度離心)-原生質(zhì)體2原生質(zhì)體的固定原生質(zhì)體T等滲緩沖液中配成一左濃度的原生質(zhì)體懸浮液j凝膠包埋角叉菜膠固定化含滲透壓穩(wěn)左劑的緩沖液與角叉菜加熱溶解配成3%-8%的凝膠-

23、火菌T冷卻到50°C左 右與等體積的原生質(zhì)體懸浮液混合均勻-滴入到一泄?jié)舛鹊念A(yù)冷的氯化鉀溶液中T 球狀的固定化原生質(zhì)體2原生質(zhì)體的固定光交聯(lián)樹脂固定化法用含有滲透壓穩(wěn)定劑的緩沖液配制30%-60%濃度的光交聯(lián)樹脂預(yù)聚體，加熱溶解后，在 50C左右，加入1%光敏劑，與等體積的原生質(zhì)體懸浮液混合均勻，攤成薄層，經(jīng)紫外光照 射2-3mm,聚合后切成一定形狀的小塊，制成片狀的固是化原生質(zhì)體。第四節(jié)固定化酶的評(píng)價(jià)一、相對(duì)酶活力具有相同酶蛋白疑的固左化酶與游離酶活力的比值稱為相對(duì)酶活力,它與載體的體結(jié)構(gòu)、顆 粒大小、底物分子量大小及酶的結(jié)合效率有關(guān)。相對(duì)酶活力低于75%的固泄化酶，一般沒有 實(shí)際

24、應(yīng)用價(jià)值。二、酶的活力固左化的單位泄義為：轉(zhuǎn)化底物的量/固宦化酶的單位重量(單位而積)/單位時(shí)間，單位 是：j.iniol/mg(cm2)/mina將酶進(jìn)行固左化時(shí)，總有一部分酶沒有與載體結(jié)合在一起，測左酶的活力回收率可以確左 固定化的效果?；盍厥?固立化酶總活力/被固過化游離酚總活力xlOO%,或稱偶聯(lián)效率、活力保留 百分?jǐn)?shù)。一般情況下，活力回收率應(yīng)小于1,若大于1.可能由于固泄化活細(xì)胞增殖或某些抑制因素 排除的結(jié)果。三、固定化酶的半衰期即固立化酶的活力下降為初始活力一半所經(jīng)歷的時(shí)間。它是衡量固左化酶操作穩(wěn)泄性的 關(guān)鍵，英測定方法與化工催化劑半衰期的測左方法相似，也可以通過長期實(shí)際操作，也

25、可以通 過較短時(shí)間的操作來推算。第五節(jié)固定化酶的性質(zhì)一、斷活力的變化固左化酶的活力在多數(shù)情況下比天然酶的活力低，專一性也可能發(fā)生變化，其原因可能 是：酶的構(gòu)象的改變導(dǎo)致了酶與底物結(jié)合能力或催化底物轉(zhuǎn)化能力的改變：載體的存在 給酶的活性部位或調(diào)節(jié)部位造成某種空間障礙，影響酶與底物或其他效應(yīng)物的作用：底物 和酶的作用受其擴(kuò)散速率的限制。在個(gè)別情況下，固左化酶由于抗抑能力的提髙使得它反而 比游離酶活力高。二、酶穩(wěn)定性提髙酶穩(wěn)左性包括熱穩(wěn)左性、對(duì)各種有機(jī)試劑的穩(wěn)泄性、對(duì)pH的穩(wěn)左性、對(duì)蛋白水解酶的 抗性及儲(chǔ)存穩(wěn)定性等。三、最適pH值的變化酶固立化后，催化底物的最適pH值和pH活性曲線常發(fā)生變化，引起變

26、化的因素主要有 兩個(gè)1、載體帶電性質(zhì)：載體帶負(fù)電荷時(shí)，會(huì)吸引反應(yīng)液中的H+,致使酶附近反映區(qū)域pH比周圍 反應(yīng)液低，須提高反應(yīng)液pH：反之，降低反應(yīng)液pH。第五節(jié)固定化酶的性質(zhì)2、產(chǎn)物性質(zhì)：由于載體的擴(kuò)散障礙，產(chǎn)物為酸性時(shí)，產(chǎn)物枳累在固泄化酶所處的催化區(qū)域, 使此區(qū)域的pH降低，須提高須提髙周圍反應(yīng)液pH：反之，降低周用反應(yīng)液pH。四、最適溫度的變化一般情況下，固泄化后的酶的最適作用溫度與游離酶差別不大，但有時(shí)由于固定化方 法和載體的影響，固左化酶的最適作用溫度可能降低，也可能升髙，須加以注意，最 適溫度提髙是有利的，可以降低酶的失活速率。五、動(dòng)力學(xué)常數(shù)的變化（隨載體性質(zhì)變化）： 由于分配效應(yīng)

27、：p珂Si微環(huán)境/S宏觀環(huán)境對(duì)簡單的固定化酶系統(tǒng)，其動(dòng)力學(xué)性質(zhì)一般服從米氏方程：（1）載體與底物帶相同電荷，SiVS，則pvlKid>Km固定化酶降低了酶的親和力。載體與底物電荷相反，靜電作用，Si>【S, p>l,Kin'<Kni六、底物特異性：對(duì)于作用于小分子底物的酶，變化不明顯：但對(duì)于可作用于小分子底物又 可作用于大分子底物的酶來說，由于載體空間位阻作用，大分子底物難以接近酶分子而使催 化速度大大降低，如固左在竣甲基纖維素上的胰蛋白酶，對(duì)二肽或多肽作用保持不變，對(duì)酪 蛋白的作用僅為游離酶的3%左右。第六節(jié)固定化輔酶一、輔酶固定化的意義輔酶類物質(zhì)是一些“全酶“的組成成分，參與催化反應(yīng)。同時(shí)當(dāng)其與某些高分子物質(zhì)結(jié)合 時(shí)，可以大大提髙催化效率。因此，將其固泄化，