通脈醒腦滴丸對線栓法致腦缺血再灌注大鼠細(xì)胞凋亡線粒體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)

1、通脈醒腦滴丸對線栓法致腦缺血再灌注大鼠細(xì)胞凋亡線粒體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響                  作者：陳小睿，唐光曦，孟憲麗，黃雷雷，李佳川 【摘要】  目的 探討中藥復(fù)方制劑通脈醒腦滴丸防治腦缺血卒中可能的機(jī)理。 方法選用大鼠線栓阻斷大腦中動脈法復(fù)制腦缺血再灌注模型，運用免疫組化方法，測定腦組織bcl-2、Bax、Cyt-C和Caspase-3的表達(dá)，考察藥物對Caspase-3細(xì)胞凋亡通路的作用。結(jié)果通

2、脈醒腦滴丸下調(diào)神經(jīng)細(xì)胞的促凋亡基因Bax、Caspase-3和CytC表達(dá)。結(jié)論研究初步證實通脈醒腦滴丸對腦缺血損傷的保護(hù)作用，可能與負(fù)調(diào)Caspase-3介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡通路有關(guān)。 【關(guān)鍵詞】  通脈醒腦滴丸; 腦缺血; 再灌注 腦缺血卒中作為臨床常見的危重急癥，一直備受關(guān)注。目前認(rèn)為對腦缺血的治療核心在于對神經(jīng)元損傷的保護(hù)以及溶栓再通。是否能在腦缺血卒中發(fā)生后，盡可能延緩細(xì)胞凋亡組織壞死的進(jìn)程，減輕神經(jīng)元的損傷，是考察藥物對腦缺血保護(hù)作用的要點。 本實驗選用大鼠線栓法致局灶性腦缺血再灌注模型，采用免疫組織化學(xué)方法檢測腦組織神經(jīng)細(xì)胞bcl-2、Bax、Cyt-C、Caspase-3的

3、表達(dá)，探求藥物是否可通過影響bcl-2或Bax的表達(dá)，影響Cyt-C在線粒體膜的聚集，進(jìn)一步影響凋亡因子Caspase-3的表達(dá)，發(fā)揮其對抗缺血腦組織損傷和神經(jīng)細(xì)胞凋亡的作用。 1 材料 1.1 藥物受試藥物：通脈醒腦滴丸，成都潤華堂藥業(yè)有限公司產(chǎn)品，批號：070530。規(guī)格：10 mg/粒。用法用量：口服，88粒/d，分4次服用。主治缺血性中風(fēng)引起的半身不遂、口眼歪斜、言語不利、偏身麻木等。陽性對照藥物：尼莫地平片，山西亞寶藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司產(chǎn)品，批號：070109。規(guī)格：20 mg/片。用法用量：用于治療缺血性腦血管病，口服，30120mg/d。 1.2 試劑Rabbit Anti-Ca

4、spase-3，北京博奧生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品;Cytochrome C(A-8)SC-13156，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品;Bax(P-19)SC-526，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品;bcl-2 GM88702，基因有限公司產(chǎn)品;ChemMate Envision HRP鼠/兔 GK500705，基因有限公司產(chǎn)品;其它實驗室常備試劑均為國產(chǎn)分析純。 1.3 儀器Leica rm 2135石蠟切片機(jī)，德國;Olympus-BX40型光學(xué)顯微鏡，日本Olympus公司產(chǎn)品;MIAS2000型計算機(jī)圖像工作系統(tǒng)，電子科大金盤多媒體科技有限公司產(chǎn)品;LD2-5醫(yī)用離心機(jī)，北京醫(yī)用離心機(jī)廠

5、產(chǎn)品;WH-2型微量旋渦混合儀，上海滬西分析儀器廠產(chǎn)品;DHW-600型不銹鋼電熱恒溫水箱，北京國華醫(yī)療器械廠產(chǎn)品;202-2型干燥箱，上海市實驗儀器總廠產(chǎn)品。其它實驗室常備器皿、耗材均為國產(chǎn)優(yōu)質(zhì)品。    1.4 動物 SD大鼠，SPF級，質(zhì)量(300±20)g，雌雄各半，由四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物研究所提供，合格證號：SCXK(川)2004-15。 2 方法 2.1 分組及給藥選取健康SD大鼠18只，雌雄各半，隨機(jī)將大鼠分為模型組、給藥組、假手術(shù)組3組，每組6只。其中給藥組給予通脈醒腦滴丸73.85 mg/kg;模型組和假手術(shù)組給予等體積蒸

6、餾水。灌胃給藥，1次/d，連續(xù)給藥7 d。于第7天給藥1 h后，假手術(shù)組大鼠僅在麻醉狀態(tài)下分離右側(cè)頸總動脈，不予阻斷血流。模型組和給藥組參照下述方法，復(fù)制線栓法致大鼠腦缺血再灌注模型。 參照文獻(xiàn)方法13，第7天給藥1 h后，腹腔注射10%水合氯醛3.5 ml/kg(350 mg/kg)將大鼠麻醉，分離右側(cè)頸總動脈(CCA)、頸外動脈(ECA)和頸內(nèi)動脈(ICA)，在距CCA分叉部4 mm處剪一小口，將拴線插入到ICA，實現(xiàn)對大腦中動脈(MCA)的阻斷。固定線栓。逐層縫合切口并消毒。MCA阻斷2 h后，拔出線栓，進(jìn)行再灌注。假手術(shù)組大鼠僅在麻醉狀態(tài)下分離右側(cè)頸總動脈，不予插入線栓阻斷血流。 再灌

7、注24 h后，各組大鼠10%水合氯醛3.5 ml/kg(350 mg/kg)腹腔注射麻醉，仰臥位固定，剪開胸壁，暴露心臟，將灌流裝置的針頭刺入左心室，止血鉗固定，剪開右心耳，生理鹽水250 ml快速灌流沖洗至肺葉和肝臟變白，換用4%多聚甲醛磷酸鹽緩沖液250 ml灌注固定，30 min后斷頭取腦，置于4%多聚甲醛中低溫避光固定24 h。心臟灌流前1h給藥1次。 常規(guī)制備石蠟切片，HE染色項下，采用DAKO EnVision顯色系統(tǒng)，光鏡100×視野下尋找海馬結(jié)構(gòu)，400×視野下，運用電子科技大學(xué)金盤科技有限公司MIAS2000型計算機(jī)圖像工作系統(tǒng)，對染色結(jié)果進(jìn)行檢測，每張片

8、選取不重疊的10個視野，每個視野選20個細(xì)胞，統(tǒng)計陽性表達(dá)的細(xì)胞數(shù)和陽性面積百分比。 2.2 統(tǒng)計方法運用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。 3 結(jié)果 3.1 對線栓法致腦缺血再灌注大鼠腦組織神經(jīng)細(xì)胞Bax表達(dá)的影響結(jié)果見表1。表1 對線栓法致腦缺血再灌注大鼠腦組織神經(jīng)細(xì)胞Bax表達(dá)的影響(±s) 在高倍鏡下，免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示：大鼠腦組織神經(jīng)細(xì)胞Bax蛋白主要在胞漿出現(xiàn)陽性表達(dá)。正常大鼠神經(jīng)細(xì)胞Bax有一定的陽性表達(dá)，而腦缺血再灌注大鼠的神經(jīng)細(xì)胞表達(dá)則出現(xiàn)幾乎滿視野表達(dá)，染色呈棕黃或黃褐色。從表1可見，模型組大鼠腦組織神經(jīng)細(xì)胞的Bax表達(dá)較假手術(shù)組有明顯的升高(P<

9、;0.01)。通脈醒腦滴丸組較之模型組，Bax陽性細(xì)胞表達(dá)和陽性面積比明顯降低(P<0.01)，提示通脈醒腦滴丸具有減少大鼠腦缺血再灌注損傷后神經(jīng)細(xì)胞Bax表達(dá)的作用。    3.2 對線栓法致腦缺血再灌注大鼠腦組織細(xì)胞色素C(Cyt-c)表達(dá)的影響表2 對線栓法致腦缺血再灌注大鼠腦組織神經(jīng)細(xì)胞Cyt-C表達(dá)的影響(±s)在高倍鏡下，免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，大鼠腦組織神經(jīng)細(xì)胞Cyt-C蛋白主要在胞漿出現(xiàn)陽性表達(dá)。正常大鼠神經(jīng)細(xì)胞Cyt-C的有一定陽性表達(dá)，而腦缺血再灌注大鼠的神經(jīng)細(xì)胞表達(dá)則相對較高，染色呈棕黃或黃褐色。從表2可見，模型組

10、大鼠腦組織神經(jīng)細(xì)胞的Cyt-C表達(dá)較假手術(shù)組有明顯的升高(P<0.01)，給藥組較之模型組，Cyt-C陽性細(xì)胞表達(dá)個數(shù)和陽性面積比明顯降低(P<0.01)，提示通脈醒腦滴丸具有減少大鼠腦缺血再灌注損傷神經(jīng)細(xì)胞Cyt-C表達(dá)的作用。 3.3 對線栓法致腦缺血再灌注大鼠腦組織神經(jīng)細(xì)胞Caspase-3表達(dá)的影響結(jié)果見表3表3 對線栓法致腦缺血再灌注大鼠腦組織神經(jīng)細(xì)胞Caspase-3表達(dá)的影響(±s) 高倍鏡下，免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，大鼠腦組織神經(jīng)細(xì)胞Caspase-3蛋白在胞漿和胞核均出現(xiàn)陽性表達(dá)。正常大鼠神經(jīng)細(xì)胞Caspase-3有一定陽性表達(dá)，而模型組大鼠幾乎出現(xiàn)滿

11、視野的陽性表達(dá)，染色呈棕黃或黃褐色。從表3可見，模型組大鼠腦組織神經(jīng)細(xì)胞的Caspase-3表達(dá)較假手術(shù)組有明顯的升高(P<0.01)。通脈醒腦滴丸組較之模型組，Caspase-3陽性細(xì)胞表達(dá)和陽性面積比有所降低(P<0.05)，提示通脈醒腦滴丸具有減少大鼠腦缺血再灌注損傷神經(jīng)細(xì)胞Caspase-3表達(dá)的作用。 3.4 對線栓法致腦缺血再灌注大鼠腦組織神經(jīng)細(xì)胞bcl-2表達(dá)的影響在高倍鏡下，免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，正常組和給藥組大鼠神經(jīng)細(xì)胞bcl-2未見陽性表達(dá)，而腦缺血再灌注大鼠的神經(jīng)細(xì)胞僅出現(xiàn)極少量表達(dá)，平均每100個細(xì)胞約有1個陽性細(xì)胞表達(dá)，染色呈黃褐色，分布在神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞

12、胞漿和胞膜。 4 討論 由上實驗結(jié)果可見，通脈醒腦滴丸能通過減少腦缺血再灌注大鼠腦組織Bax的表達(dá)，引發(fā)線粒體內(nèi)釋放到胞漿的Cyt-C相對于模型組明顯減少，進(jìn)一步導(dǎo)致Caspase-3表達(dá)減少，發(fā)揮明顯的抗凋亡作用。但我們的實驗中，通脈醒腦滴丸組和假手術(shù)組未見bcl-2的陽性表達(dá)。 實驗證明，通脈醒腦滴丸可通過減少腦組織Bax的陽性表達(dá)，負(fù)調(diào)Caspase-3介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的線粒體通路，保護(hù)缺血損傷的腦組織。 由體內(nèi)外因素觸發(fā)細(xì)胞內(nèi)預(yù)存的死亡程序而導(dǎo)致的細(xì)胞死亡過程稱為細(xì)胞凋亡(apoptosis)，又稱程序性細(xì)胞死亡(programmed cell death，PCD)。細(xì)胞內(nèi)外的凋亡因素通

13、過各種受體作用于細(xì)胞后，產(chǎn)生一系列復(fù)雜的生化反應(yīng)，形成與凋亡相關(guān)的第二信使，繼而通過胞內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑激活后續(xù)凋亡程序。調(diào)控凋亡的基因接受由信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑傳來的死亡信號后，啟動并合成執(zhí)行凋亡所需的各種酶類和相關(guān)物質(zhì)。繼而由核酸內(nèi)切酶和Caspase執(zhí)行死亡，前者破壞生命活動必須的所有指令，后者導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)的全面解體。    腦缺血損傷所致的細(xì)胞凋亡過程中，許多相關(guān)的細(xì)胞因子以及其它因素皆參與其中。如p53基因、早期即刻反應(yīng)基因等，但目前認(rèn)為，神經(jīng)元凋亡最重要的調(diào)節(jié)者是Caspase(半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶)家族和bcl-2家族4。 大量研究表明Caspas

14、e家族在細(xì)胞凋亡機(jī)制中處于中心位置，而其中Caspase-3處于Caspase蛋白酶系的核心地位，通過切割多種不同的底物，導(dǎo)致蛋白酶系級聯(lián)切割反應(yīng)放大，最終誘導(dǎo)細(xì)胞走向死亡。 Caspase的激活途徑按照啟動酶活性信號的起源分成線粒體通路、死亡受體通路和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路。而由細(xì)胞色素C(Cyt-C)的釋放介導(dǎo)的線粒體通路被廣泛關(guān)注。研究證明，細(xì)胞色素C的釋放與bcl-2家族成員密切相關(guān)。 bcl-2家族即B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2基因家族，被認(rèn)為是與PCD密切相關(guān)的一組通道蛋白，主要位于線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和細(xì)胞核外膜。bcl-2家族包括抑制PCD發(fā)生的bcl-2、bcl-X1等以及促進(jìn)細(xì)胞凋亡的Bax和b

15、cl-Xs等。 bcl-2是細(xì)胞凋亡的重要抑制基因，定位于線粒體上，其功能是維持線粒體膜的完整性，控制著線粒體的深透轉(zhuǎn)換(permeability transition)和離子、蛋白的外流，阻止線粒體膜整合蛋白的釋放，尤其是細(xì)胞色素C的釋放，而阻斷Caspase的激活，最終表現(xiàn)出凋亡抑制活性5。在腦缺血再灌注損傷中，bcl-2蛋白維持促凋亡成員在細(xì)胞內(nèi)的定位分布，保護(hù)細(xì)胞不進(jìn)入凋亡程序，同時控制細(xì)胞色素C的釋放 6。 與bcl-2在凋亡進(jìn)程中密切相關(guān)的Bax基因，是bcl-2家族中第一個被確認(rèn)有細(xì)胞凋亡促進(jìn)作用的成員。Bax主要位于胞質(zhì)中，在凋亡信號誘導(dǎo)后很快遷移到線粒體，與線粒體膜結(jié)合，形成

16、滲透性膜轉(zhuǎn)移孔復(fù)合物，形成線粒體膜通道，將細(xì)胞凋亡的啟動因子細(xì)胞色素C釋放到胞質(zhì)中，發(fā)動下一級的促凋亡反應(yīng)。 研究發(fā)現(xiàn)，促凋亡蛋白Bax通過促進(jìn)電壓依賴性陰離子通道VDAC開放而誘導(dǎo)Cyt-c從線粒體釋放;抗凋亡蛋白bcl-2則通過與VDAC直接結(jié)合而關(guān)閉VDAC來阻止Cyt-C釋放7。 Cyt-C是生物氧化的一個非常重要的電子傳遞體。正常情況下細(xì)胞色素C穩(wěn)定性地結(jié)合于線粒體內(nèi)膜，不能通過外膜。在受到凋亡信號的刺激后，細(xì)胞色素c通過線粒體膜的滲透性轉(zhuǎn)移孔道釋放出來，與凋亡促進(jìn)因子-l(Apaf-1)和Caspase-9結(jié)合形成復(fù)合體，在ATP參與下，使Caspase蛋白酶家族發(fā)生酶解級聯(lián)激活，

17、主要通過Caspase-3的激活造成基因組DNA裂解，同時使DNA修復(fù)相關(guān)酶失活，造成DNA修復(fù)能力降低，以凋亡執(zhí)行過程8。細(xì)胞色素C的胞外釋放是腦缺血再灌注后線粒體凋亡通路中的關(guān)鍵的環(huán)節(jié)，應(yīng)用激光共聚焦，放射免疫測定等實驗方法，都證實了線粒體依賴性的凋亡通路中細(xì)胞色素C胞外釋放這一環(huán)節(jié)9。    基于上述，本實驗采用免疫組化的方法，檢測了線栓法致大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷后，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的線粒體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的重要通路因子bcl-2、Bax、Cyt-C、Caspase-3的水平，以探究藥物通脈醒腦滴丸是否能通過作用于該通路，減少凋亡相關(guān)因子的表達(dá)，發(fā)揮其

18、腦保護(hù)作用。 結(jié)果顯示通脈醒腦滴丸可明顯減少Caspase-3、Cyt-C陽性細(xì)胞個數(shù)，且著色較淺。表明通脈醒腦滴丸可能通過減少Cyt-C釋放和下調(diào)Caspase-3蛋白的表達(dá)而減少凋亡的產(chǎn)生，在線粒體途徑所介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮了腦保護(hù)作用。同時，與模型組比較，通脈醒腦滴丸組大鼠海馬區(qū)Bax表達(dá)明顯減少。表明通脈醒腦滴丸能通過下調(diào)凋亡促進(jìn)因子Bax的表達(dá)，抑制Cyt-C釋放，對抗缺血再灌注后腦神經(jīng)細(xì)胞的凋亡，發(fā)揮腦缺血防治作用。 有研究發(fā)現(xiàn)，在生長發(fā)育過程中，神經(jīng)系統(tǒng)的bcl-2蛋白呈高表達(dá)，以后隨年齡的增加bcl-2免疫反應(yīng)迅速下降，成年后bcl-2蛋白的免疫反應(yīng)通常不能檢出，故假手術(shù)組

19、未見bcl-2陽性表達(dá)。模型組僅出現(xiàn)少量bcl-2陽性表達(dá)，通脈醒腦滴丸組亦未見bcl-2陽性表達(dá)，提示藥物對抗細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制，可能主要與減少Bax基因的表達(dá)，抑制Cyt-C從線粒體的釋放相關(guān)。 綜上所述，通脈醒腦滴丸可通過減少缺血腦組織海馬Bax、Cyt-C和Caspase-3的陽性表達(dá)，抑制Caspase-3介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，發(fā)揮對抗腦缺血的作用，為中藥復(fù)方制劑防治腦缺血卒中的機(jī)理提供了新的佐證。 【參考文獻(xiàn)】  1 竇萬臣，王任直，張 波，等.大鼠局灶性腦缺血模型制作方法的改進(jìn)J.中國腦血管病雜志，2004，1(2)：81.2 陳佳俊，石巖殊，韓雪梅.線栓法大鼠局灶性腦缺血模型(PMCAO)的實驗研究J.吉林醫(yī)學(xué)，2004，25(10)：16.3 劉運泉，戴 穎.線栓法大鼠局灶性腦缺血模型的改進(jìn)J.中國臨床解剖學(xué)雜志，2005，23(2)：222.4 Plesnila N.Role of mito