熒光定量技術及miRNA定量

1、熒光定量 PCR 技術及其在 microRNA 定量分 析方面應用摘要熒光定量 PCR 技術是近幾年在 PCR 技術基礎上發(fā)展起來的一種核酸定 性定量技術。熒光定量 PCR 具有特異性強、靈敏度高、重復性好、定量準 確、速度快、全封閉反應等特點 , 擴大了 PCR 的應用范圍,成為分子生物 學和醫(yī)學研究中的重要工具。 microRNA 是存在于真核生物中的一種大小為 20-25nt 的非編碼 RNA 。自 2001年被發(fā)現(xiàn)以來,一直備受關注。論文綜述 了熒 光定 量 PCR 技 術的原 理 、 熒光定 量 PCR 實時 定量檢測系 統(tǒng)及其 在 microRNA 表達分析方面的應用。關鍵詞:熒光

2、定量 PCR 熒光染料 探針標記 microRNA定量1前言熒光定量 PCR 是通過熒光染料或熒光標記的特異性的探針,對 PCR 產 物進行標記跟蹤,實時在線監(jiān)控反應過程,結合相應的軟件可以對產物進 行分析, 計算待測樣品模板的初始濃度。 該技術是由美國 PE (Perkin Elmer 公司 1995年研制出來的一種新的核酸定量技術,目前已經得到廣泛應用。 它不僅實現(xiàn)了 PCR 技術從定性到定量的飛躍, 更重要的是與常規(guī) PCR 相比, 它具有操作簡便、快速高效、高通量、特異性強、靈敏度更高、重復性好、 定量準確、自動化程度高、全封閉式反應等優(yōu)點成為分子生物學和醫(yī)學研 究中的重要工具 1。m

3、icroRNA( miRNA是一類廣泛存在于真核生物中 , 不編碼蛋白質的短 序列 RNA, 長度為 20-24nt 。成熟 miRNA 的 5端為磷酸基團 , 3端為羥基 , 它通過與靶 mRNA 3端非編碼區(qū)特異性結合 , 引起靶 mRNA 的降解或者抑制其 翻譯 , 從而調低基因表達。 miRNAs 在控制真核生物生長發(fā)育、新陳代謝和 生理反應等方面起著重要作用。 除此之外 , 多數(shù) miRNA 還具有高度保守性、時序性和組織特異性 2-6。目前大量 miRNA 在真核生物中被發(fā)現(xiàn) , 但絕大多 數(shù) miRNA 的生物學功能研究尚顯滯后 , 而 miRNA 生物學功能研究的重要一 環(huán)是探

4、究 miRNA 在特定時期、特定組織及特定環(huán)境的表達特性 , 進而實現(xiàn) miRNA 對目標基因的調控。利用熒光定量 PCR 技術,了解 miRNA 在不同組織 部位的時空表達是研究其功能的重要環(huán)節(jié)。2熒光定量 PCR 原理熒光定量 PCR 最早稱 TaqMan PCR,后來也叫 Real-Time PCR,該技術 是在常規(guī) PCR 基礎上加入熒光標記探針或相應的熒光染料來實現(xiàn)其定量功 能的。其基本原理是在 PCR 體系中加入熒光基團,隨著 PCR 反應的進行, PCR 反應產物不斷累計,熒光信號強度也等比例增加,利用熒光信號累積實 時監(jiān)測整個 PCR 進程,最后通過標準曲線或其他方法對未知模板

5、進行相對 或絕對定量分析的方法 7。每經過一個循環(huán),收集一個熒光強度信號,這樣 我們就可以通過熒光強度變化監(jiān)測產物量的變化,從而得到一條熒光擴增 曲線圖。 一般而言, 熒光擴增曲線可以分成三個階段:熒光背景信號階段, 熒光信號指數(shù)擴增階段和平臺期。在熒光背景信號階段,擴增的熒光信號 被熒光背景信號所掩蓋,無法判斷產物量的變化。在熒光信號指數(shù)擴增階 段, PCR產物量的對數(shù)值與起始模板量之間存在線性關系,我們可以選擇 在這個階段進行定量分析。 而在平臺期, 擴增產物已不再呈指數(shù)級的增加, 這是由于隨著 PCR 循環(huán)數(shù)的增加, DNA 聚合酶的失活, dNTP 和引物的枯竭 以及反應副產物的干擾等

6、原因造成的。此階段 PCR 擴增產物的數(shù)量與原始 模板數(shù)量之間沒有一個固定的比例關系,通過檢測擴增產物很難對原始模 板進行準確定量 8。為了便于對所檢測樣本進行比較, 在實時熒光定量 PCR 反應的指數(shù)期, 首先需設定一定熒光信號的域值,它可以設定在熒光信號指數(shù)擴增階段任 意位置上,但一般這個域值(threshold 是以 PCR 反應的前 15個循環(huán)的 熒光信號作為熒光本底信號,熒光域值的缺省設置是 3-15個循環(huán)的熒光信 號的標準偏差的 10倍。另外閾值與擴增出線的交點為 Ct 值, C 代表 Cycle (循環(huán) , t 代表 threshold(閾值 。 Ct 值是指每個反應管內的熒光信

7、號達到閾值時所經歷的循環(huán)數(shù)(threshold cycle 9。研究表明,每個模板 的 Ct 值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關系,起始拷貝數(shù)越多, Ct 值越小 10,11。 利用已知起始拷貝數(shù)的標準品可作出標準曲線, 其中橫坐標代 表起始拷貝數(shù)的對數(shù),縱坐標代表 Ct 值如下圖所示。因此,只要獲得未知 樣品的 Ct 值,即可從標準曲線上計算出該樣品的起始拷貝數(shù)。 3熒光定量 PCR 技術中標記方法的分類熒光定量檢測可分為擴增序列非特異和擴增序列特異兩類檢測。根據(jù) 所使用的標記物不同又可分為熒光染料法和熒光探針法兩種。熒光染料法 包括飽和熒光染料和非飽和熒光染料,非飽和熒光染料的典型代表

8、就是現(xiàn) 在最常用的 SYBR Green,飽和熒光染料有 Eva Green、 LC Green等;熒 光探針法包括水解探針法、 Beacon 技術(分子信標技術 、雜交探針以及 Scorpion 引物 /探針等。3.1非特異性的 DNA 結合染料法熒光染料能結合在 DNA 雙鏈結構的小溝中而發(fā)光,而游離的熒光染料 不發(fā)出熒光,因此擴增開始時檢測不到熒光信號隨著擴增的進行,熒光染 料與逐漸增多的 dsDNA 結合,熒光強度逐漸增強,直到達到閾值,被熒光 探測系統(tǒng)檢測到 12。 染料與 DNA 雙鏈分子的結合是非特異性的 , 它可以和反 應體系中所有 DNA 分子結合 , 易受到非特異性擴增和引

9、物二聚體的影響 , 使定量結果不可靠。因此引物設計和反應條件的優(yōu)化對消除非特異性熒光 有很大幫助。在實驗中常用的熒光染料有 Pico Green 和 SYBR Green。 SYBR Green染料的應用最為廣泛,能與所有的雙鏈 DNA 結合,它的最大 吸收波長約為 497 nm,發(fā)射波長最大約為 520 nm,適合于所有的熒光定量 PCR 。如圖 3為 SYBR Green的工作原理。然而,正由于能和所有雙鏈 DNA 結合,使得引物二聚體、單鏈二級結構以及錯誤的擴增產物引起假陽性而 影響定量的精確性。 Pico Green 是一種新型的染料,與 SYBR Green相 比,其靈敏度較高,可以

10、檢測出至少 25pg mL -1的 dsDNA 分子,且具有線性 范圍廣, RNA ssDNA 及其他物質的影響小的優(yōu)點 13。熒光染料的優(yōu)勢在于 它能監(jiān)測任何 dsDNA 序列的擴增,不需要設計探針且方便、成本低。但由 于染料與 DNA 雙鏈分子的結合是非特異性的,一首非特異性擴增和引物二 聚體的影響,使得定量結果不可靠?？梢越柚芙馇€分析法區(qū)分非特異 性產物和引物二聚體所產生的熒光,排除假陽性。 3.2特異性熒光定量 PCR特異性熒光定量 PCR 的基本原理是當一個熒光分子(又稱供體分子 的熒光光譜與另一個熒光分子(又稱受體分子的激發(fā)光譜相重疊時,供 體熒光分子的激發(fā)能誘導受體分子發(fā)出熒

11、光,同時供體熒光分子自身的熒 光強度衰減,這種現(xiàn)象即是熒光 FRET 。當 PCR反應開始后,熒光探針的發(fā) 光基團所發(fā)出的熒光強度與 PCR 產物的數(shù)量呈對應關系,因此對熒光信號 進行檢測即可實現(xiàn)對 PCR 產物的準確定量 14。3.2.1水解探針(TaqMan 探針法TaqMan 探針是應用最廣泛的水解探針,它是一種寡核苷酸探針, 5 端和 3端分別標記一個報告熒光基團和一個淬火熒光基團。 其基本原理主 要是在 PCR 反應體系中加入一個特異的熒光標記探針,當探針完整時,檢 測不到熒光信號。在 PCR 退火時,探針與模板發(fā)生特異性雜交,然后引物 沿模板 DNA 延伸到達探針,而 Taq 酶有

12、 5 -3外切活性,發(fā)生置換反應使 得 3端與 5端分離,熒光信號釋放,熒光檢測系統(tǒng)就能檢測到光密度隨 PCR 反應進行而增加。模板每復制一次,就有一個熒光信號被釋放。因此, 根據(jù) PCR 反應液中得熒光強度即可計算出初始模板的數(shù)量 15。 圖 4是TaqMan 圖 3 SYBR GREEN 1工作原理探針的工作原理。 圖 4TaqMan 探針工作原理3.2.2分子信標分子信標(也稱為分子燈塔 ,是一莖環(huán)發(fā)卡結構的單鏈 DNA 分子,環(huán) 部與靶 DNA 序列互補,長度約 15-35bp ,莖部 GC 含量高,且與靶 DNA 序列 無同源性,約 8bp 。探針的 3端和 5端分別標記有熒光報告基

13、團和熒光 淬火基團。探針自身兩端序列互補,形成發(fā)卡結構,不發(fā)熒光。當探針特 異的模板雜交時,破壞探針發(fā)卡結構,產生熒光。隨著 PCR 產物的積累, 熒光信號不斷增強,課被熒光檢測儀檢測到。如圖 5所示,為分子信標的 工作原理。理論上,分子信標是可以區(qū)分單個核苷酸差異的 DNA ,但探針標 記比較復雜,并且在溶液中,探針如果不能無選擇性折疊則會造成部分熒 光本底信號。另外,如果莖結構的熱力學溫度過高時,會影響探針與靶序 列雜交。總體來說,分子信標的優(yōu)點是特異性強,熒光背景低;缺點是設 計困難,雜交探針不能完全與模板結合,穩(wěn)定性較差,價格高 16。 3.2.3雜交探針雜交探針又稱雙雜交探針,由 A

14、 、 B 兩條相鄰探針組成,探針 A 在 3 端攜帶一熒光供體,另一探針 B 的 5端攜帶一熒光受體,探針 B 的 3端 被封閉,防止在退火時延伸 17。在 PCR 退火階段,兩個探針雜交在模板 DNA 的相鄰區(qū)段,并頭尾結合,兩者產生 FRET 現(xiàn)象,發(fā)出熒光,當兩探針游離 時,無熒光產生。反應中使用了兩個探針,只有兩探針獨立雜交在正確的 靶序列上才能檢測到熒光信號,增加了反應的特異性,對探針設計提供了 更多選擇。但兩個探針結合于模板上影響擴增效率 , 合成兩個探針 , 成本相 對較高 18。由于 FRET 探針是靠近發(fā)光,所以熒光檢測儀檢測到的信號是實 時信號,而不是累積信號 11。3.2

15、.4蝎子引物法蝎子引物 /探針即 Scorpion 引物 /探針。該方法將序列特異引物延伸和 探針雜交轉換成單分子活動,直到聚合酶水解雙標記才發(fā)生熒光信號,與 較慢的 TaqMan 反應相比,使信號反應速度增快 19。 Scorpion 引物 /探針是 由一條發(fā)卡結構的探針和一條引物構成,探針的 5端和 3端分別連有報 告熒光和淬火熒光。在 PCR的變性階段,探針的發(fā)卡結構會打開,退火的 圖 5 分子信標工作原理時候與模板 DNA 結合,報告熒光和淬火熒光分離而產生熒光。 Scorpion 引 物 /探針中,序列特異性引物和探針在同一個分子上,因此,更加靈敏,熒 光信號產生的特別快。圖 6是蝎

16、子引物法的工作原理圖。 4熒光定量 PCR 技術的定量方法在熒光定量 PCR 中,模板定量有絕對定量和相對定量兩種。該技術可 以對 DNA 、 RNA 樣品進行定性和定量分析。絕對定量可以得到某一個樣本中 基因的拷貝數(shù)和濃度;相對定量可以比較不同方式處理的兩個樣本中得基 因表達水平。4.1標準曲線的絕對定量法用已知濃度的標準品作為模板進行 PCR 擴增,以標準品的濃度的對數(shù) 值為橫坐標,以所測得的 Ct 值為縱坐標,繪制出標準曲線。然后在相同條 件下檢測未知樣品的 Ct 值,根據(jù)標準曲線可計算出未知樣品的拷貝數(shù)。定 量的標準曲線可以通過化學合成目的基因,或者將已知基因 DNA片段克隆 圖 6

17、蝎子探針法的工作原理在載體上,提取質粒后,測量濃度并計算出其拷貝數(shù),然后再進行 5倍或 10倍系列稀釋作為 PCR 的模板,制作標準曲線。根據(jù)產生曲線的斜率可以 計算出 PCR 效率。如果 PCR 效率大于 100%,說明加入的已知陽性對照不正 確,或者在標準品中有 PCR 抑制物。如果有進行 PCR 效率計算,則可能導 致高估未知樣品的模板量。4.2雙標準曲線法的相對定量法雙標準曲線法是指在測定目的基因的同時測定某一內源性管家基因并 用目的基因和管家基因的標準品分別作出標準曲線處理與未處 理樣品同時 擴增目的基因和管家基因獲得 Ct 值然后從各自的標準曲線上求出初始模板 量經管家基因均一化處

18、理后求出目的基因的相對含量 20。使用相對定量時, 要求所有樣品擴增的 PCR 效率相近,一般要求大于 90%。定量 PCR 過程中, 要求管家基因的表達量不受實驗處理的影響,而且其表達量在不同組織中 也不發(fā)生變化。而目前還沒有一種適用于各種材料的通用管家基因,因此 在實驗過程中應盡量選擇一種表達量變化較小的管家基因。通常選用的管 家基因有 GAPDH 、 -actin 2、 2微球蛋白、 18SrRNA 、 TATA-box 等。 5熒光定量 PCR 在 microRNA 定量方面的應用成熟 miRNA 長度為 20-24nt ,與常規(guī) PCR 反應中的引物長度相近,因此 常規(guī) PCR 無法

19、實現(xiàn)對 miRNA 的檢測,這是 miRNA 分析檢測研究中的一大挑 戰(zhàn) 21。如今,科學家已經研究出多種 miRNA 的定量檢測技術,有基于直接 雜 交 的 檢 測 技 術 , 如 Northern blotting 22,23, mirVana miRNA detection(Ambion公司 和 microarray 24,25等 , 這些方法的優(yōu)點是通量高 , 一次可以同時檢測多個 miRNA 的表達情況 , 缺點是技術含量較高 , 成本大 , 還存在同一 miRNA 不同家族成員之間互相錯配雜交的噪音信號 , 且不適合 表 達 量 較 低 的 miRNA 檢 測 ; 結 合 PCR

20、與 探 針 的 定 量 檢 測 技 術 , 如 stem-loop 26, key-like27及 Ligation Assay28, 這三者需要使用 miRNA 特異的探針 , 這類方法的突出優(yōu)點是特異性強 , 常常能區(qū)分同一 miRNA 家 族的不同變體 , 缺點是探針的設計與合成需借助于商業(yè)公司 , 方便性與特異性很難得到統(tǒng)一的解決 ; 基于 PCR 與熒光染料如 SYBR Green的定量檢測 技術 , 如 poly(A聚合酶加尾法 29、引物延伸法 30、 Multiplexed RT法 31和 miR-Q 法 32等 , 由于這些技術靈敏度高、操作流程簡單、設備和試劑要 求相對較低

21、、集通用性和特異性于一身 , 便于一般實驗室開展。 后 兩者 miRNA 檢測技術都是以熒光定量 PCR 技術為基礎的。5.1探針定量 PCR 檢測技術探針定量 PCR 檢測技術主要有 stem-loop, key-like以及 Ligation Assay 技術。 stem-loop 與 key-like 技術的原理基本相同。但兩者之間還 有一些區(qū)別。首先,逆轉錄引物有區(qū)別, stem-loop 技術的逆轉錄引物為 5 -GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACNNNNNN- 3, 由 44個堿基組成 , 其形成互補雙鏈的 stem 部分由 1

22、4對互補堿基構成 , A=T和 G=C對數(shù)目相同 , 有 6個堿基與成熟 miRNA 互補, key-like 技術的逆轉錄 引物為 5 -CGCGAGCACAGAATTAATACGACTCACTATACGCGNNNNNNNN- 3, 由 35個 堿基組成 , 其形成互補雙鏈的 stem 部分由 4對互補堿基構成 , 均為 G=C, 有 8個堿基與成熟 miRNA 互補。再者,就是探針的區(qū)別, stem-loop 技術的 探針有 8個左右的堿基與成熟 miRNA 互補 , 而 key-like 技術的探針只有 3個堿基與成熟 miRNA 互補 , 但 stem-loop 技術探針的發(fā)光基團位于

23、與反向 引物配對的一端 , 而 key-like 技術探針的發(fā)光基團位于與 miRNA 配對的一 端。最后,還有正向引物的區(qū)別, stem-loop 技術的正向引物在設計時為了 讓探針與更多的 miRNA 配對 , 有意識地讓引物向外滑動了一些堿基 , 而 key-like 技 術 的 正 向 引 物 則 基 本 上 是 miRNA 序 列 。 另 外 就 是 連 接 法 (ligation Assay , 這中技術與前兩種檢測技術相比,原理略有不同。連 接法首先利用 8個左右的與成熟 miRNA 互補的短核苷酸鏈逆轉錄合成單鏈 cDNA, 在利用包含通用序列和 miRNA 特異序列的左、 右

24、核苷酸鏈與 miRcDNA 互補配對 , 并用 T4連接酶補平缺口 , 形成一條完成的 miRcDNA 鏈 ; 再利用 根據(jù) miRNA 序列設計的探針和左、右核苷酸鏈前端預置的正反向引物進行 實時定量 PCR 擴增 , 收集熒光信號 , 獲得 miRNA 的表達量。如圖 7是三種 探針定量 PCR 的 miRNA 檢測技術。 圖 7 基于 PCR 和探針的 3種 miRNA 檢測方法示意圖5.2熒光染料 PCR 定量檢測技術熒光定量 PCR 定量檢測 miRNA 技術又可分為 polyA 聚合酶加尾法 ( polyA tailing assay , 引 物 延 伸 法 ( prmier ex

25、tension assay , Multiplexed RT法 (multiplexed RT assay以及 miR-Q 法 (miR-Q assay。 polyA 聚合酶加尾法是在成熟的 miRNA 的 3端加上一個 poly(A尾巴,形 成一個近似 mRNA 的結構,然后設計一個帶有 poly(T的逆轉錄引物,再以 miRcDNA 為模板,利用 miRNA 特異的反向引物和帶有 poly(T的通用正向逆 轉錄引物以及 SYBR Green進行 qPCR 擴增。引物延伸法引進了一種新的寡 聚核苷酸鎖核酸(locked nucleic acid LNA 。該方法首先利用逆轉錄引 物,逆轉錄合

26、成 miRcDNA ,然后利用逆轉錄引物 5端預置的通用正向引物 和包含兩個鎖核酸且與 miRcDNA 互補配對的反向引物進行實時定量 PCR 擴 增,確定 miRNA 的表達量。 Multiplexed RT法不同于其他方法的最大特點 就是取消了通用引物的正向和反向 qPCR 引物,使得每個 miRNA 都具有特異 的逆轉錄引物和 qPCR 的正向和反向引物,這種方法的基本原理和引物延伸 法相似。 Multiplexed RT 法首先將需要研究的所有 miRNA 的特異 RT引物等量混合 , 構建一個 RT 引物庫進行逆轉錄合成 miRcDNA, 然后給每一個不同 的 miRNA 設計特異的

27、正反向引物進行 qPCR 擴增。 miR-Q 法的逆轉錄引物 RT6-miR-x 由 2部分組成 , 其 3端為與 miRNA 互補的堿基序列 (約 6nt, 另 一部分為通用引物 MP-fw 序列。在進行 qPCR 擴增時,需要另外引入一個包 含寡聚核苷酸鏈 short-miR-x-rev, 其 3端為 miRcDNA 的互補序列 , 5 端為通用引物 MP-rev 序列。圖 8是 SYBR Green熒光染料定量 PCR 技術的 四種 miRNA 檢測方法的原理圖。圖 8 SYBR Green熒光染料定量 PCR 技術的四種 miRNA 檢測方法示意圖 6小結熒光定量 PCR 的發(fā)明,使得

28、實時檢測 PCR 擴增產物成為了可能,實現(xiàn) 了從粗略定量、半定量到相對定量、絕對定量的跨越。通過設計針對目的 基因的特異性引物和探針 并優(yōu)化反應體系和控制反應條件 可以成功地建 立快速靈敏特異的熒光定量 PCR 檢測方法實現(xiàn)大樣本同時檢測,節(jié)省大量 的時間和反應成本。目前, miBase 數(shù)據(jù)庫公布了近 15000條 miRNA 序列, 但多數(shù) miRNAs 參與生命活動的分子機制還有待研究。近年來 , 人們把研究 的重點越來越多地放到了 miRNAs 參與基因表達調控的分子機制上。因此, 了解和掌握 miRNAs 的定量檢測技術對研究其具體生命活動過程中得表達量 進行檢測,成為研究 miRN

29、As 作用機制的基礎。熒光定量 PCR 成為了此方面 研究的重要工具。參考文獻1趙煥英 , 包金風 . 實時熒光定量 PCR 技術的原理及其應用研究進展 J.中國 組織化學與細胞化學雜志 ,2007,16(4:492-497.2 Wheeler BM, Heimberg AM, Moy VN, et al The deep evolution of metazoan microRNAs. Evol Dev, 2009,11:50-68.3 SunkarR, Jagadeeswaran G. In silico identification of conserved microRNAs in l

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