熒光定量技術(shù)及miRNA定量

1、熒光定量 PCR 技術(shù)及其在 microRNA 定量分 析方面應(yīng)用摘要熒光定量 PCR 技術(shù)是近幾年在 PCR 技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種核酸定 性定量技術(shù)。熒光定量 PCR 具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、重復(fù)性好、定量準(zhǔn) 確、速度快、全封閉反應(yīng)等特點(diǎn) , 擴(kuò)大了 PCR 的應(yīng)用范圍,成為分子生物 學(xué)和醫(yī)學(xué)研究中的重要工具。 microRNA 是存在于真核生物中的一種大小為 20-25nt 的非編碼 RNA 。自 2001年被發(fā)現(xiàn)以來,一直備受關(guān)注。論文綜述 了熒 光定 量 PCR 技 術(shù)的原 理 、 熒光定 量 PCR 實(shí)時(shí) 定量檢測(cè)系 統(tǒng)及其 在 microRNA 表達(dá)分析方面的應(yīng)用。關(guān)鍵詞:熒光

2、定量 PCR 熒光染料 探針標(biāo)記 microRNA定量1前言熒光定量 PCR 是通過熒光染料或熒光標(biāo)記的特異性的探針,對(duì) PCR 產(chǎn) 物進(jìn)行標(biāo)記跟蹤,實(shí)時(shí)在線監(jiān)控反應(yīng)過程,結(jié)合相應(yīng)的軟件可以對(duì)產(chǎn)物進(jìn) 行分析, 計(jì)算待測(cè)樣品模板的初始濃度。 該技術(shù)是由美國 PE (Perkin Elmer 公司 1995年研制出來的一種新的核酸定量技術(shù),目前已經(jīng)得到廣泛應(yīng)用。 它不僅實(shí)現(xiàn)了 PCR 技術(shù)從定性到定量的飛躍, 更重要的是與常規(guī) PCR 相比, 它具有操作簡(jiǎn)便、快速高效、高通量、特異性強(qiáng)、靈敏度更高、重復(fù)性好、 定量準(zhǔn)確、自動(dòng)化程度高、全封閉式反應(yīng)等優(yōu)點(diǎn)成為分子生物學(xué)和醫(yī)學(xué)研 究中的重要工具 1。m

3、icroRNA( miRNA是一類廣泛存在于真核生物中 , 不編碼蛋白質(zhì)的短 序列 RNA, 長度為 20-24nt 。成熟 miRNA 的 5端為磷酸基團(tuán) , 3端為羥基 , 它通過與靶 mRNA 3端非編碼區(qū)特異性結(jié)合 , 引起靶 mRNA 的降解或者抑制其 翻譯 , 從而調(diào)低基因表達(dá)。 miRNAs 在控制真核生物生長發(fā)育、新陳代謝和 生理反應(yīng)等方面起著重要作用。 除此之外 , 多數(shù) miRNA 還具有高度保守性、時(shí)序性和組織特異性 2-6。目前大量 miRNA 在真核生物中被發(fā)現(xiàn) , 但絕大多 數(shù) miRNA 的生物學(xué)功能研究尚顯滯后 , 而 miRNA 生物學(xué)功能研究的重要一 環(huán)是探

4、究 miRNA 在特定時(shí)期、特定組織及特定環(huán)境的表達(dá)特性 , 進(jìn)而實(shí)現(xiàn) miRNA 對(duì)目標(biāo)基因的調(diào)控。利用熒光定量 PCR 技術(shù),了解 miRNA 在不同組織 部位的時(shí)空表達(dá)是研究其功能的重要環(huán)節(jié)。2熒光定量 PCR 原理熒光定量 PCR 最早稱 TaqMan PCR,后來也叫 Real-Time PCR,該技術(shù) 是在常規(guī) PCR 基礎(chǔ)上加入熒光標(biāo)記探針或相應(yīng)的熒光染料來實(shí)現(xiàn)其定量功 能的。其基本原理是在 PCR 體系中加入熒光基團(tuán),隨著 PCR 反應(yīng)的進(jìn)行, PCR 反應(yīng)產(chǎn)物不斷累計(jì),熒光信號(hào)強(qiáng)度也等比例增加,利用熒光信號(hào)累積實(shí) 時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè) PCR 進(jìn)程,最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線或其他方法對(duì)未知模板

5、進(jìn)行相對(duì) 或絕對(duì)定量分析的方法 7。每經(jīng)過一個(gè)循環(huán),收集一個(gè)熒光強(qiáng)度信號(hào),這樣 我們就可以通過熒光強(qiáng)度變化監(jiān)測(cè)產(chǎn)物量的變化,從而得到一條熒光擴(kuò)增 曲線圖。 一般而言, 熒光擴(kuò)增曲線可以分成三個(gè)階段:熒光背景信號(hào)階段, 熒光信號(hào)指數(shù)擴(kuò)增階段和平臺(tái)期。在熒光背景信號(hào)階段,擴(kuò)增的熒光信號(hào) 被熒光背景信號(hào)所掩蓋,無法判斷產(chǎn)物量的變化。在熒光信號(hào)指數(shù)擴(kuò)增階 段, PCR產(chǎn)物量的對(duì)數(shù)值與起始模板量之間存在線性關(guān)系,我們可以選擇 在這個(gè)階段進(jìn)行定量分析。 而在平臺(tái)期, 擴(kuò)增產(chǎn)物已不再呈指數(shù)級(jí)的增加, 這是由于隨著 PCR 循環(huán)數(shù)的增加, DNA 聚合酶的失活, dNTP 和引物的枯竭 以及反應(yīng)副產(chǎn)物的干擾等

6、原因造成的。此階段 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物的數(shù)量與原始 模板數(shù)量之間沒有一個(gè)固定的比例關(guān)系,通過檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物很難對(duì)原始模 板進(jìn)行準(zhǔn)確定量 8。為了便于對(duì)所檢測(cè)樣本進(jìn)行比較, 在實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 反應(yīng)的指數(shù)期, 首先需設(shè)定一定熒光信號(hào)的域值,它可以設(shè)定在熒光信號(hào)指數(shù)擴(kuò)增階段任 意位置上,但一般這個(gè)域值(threshold 是以 PCR 反應(yīng)的前 15個(gè)循環(huán)的 熒光信號(hào)作為熒光本底信號(hào),熒光域值的缺省設(shè)置是 3-15個(gè)循環(huán)的熒光信 號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)偏差的 10倍。另外閾值與擴(kuò)增出線的交點(diǎn)為 Ct 值, C 代表 Cycle (循環(huán) , t 代表 threshold(閾值 。 Ct 值是指每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信

7、號(hào)達(dá)到閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)(threshold cycle 9。研究表明,每個(gè)模板 的 Ct 值與該模板的起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)存在線性關(guān)系,起始拷貝數(shù)越多, Ct 值越小 10,11。 利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線, 其中橫坐標(biāo)代 表起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù),縱坐標(biāo)代表 Ct 值如下圖所示。因此,只要獲得未知 樣品的 Ct 值,即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算出該樣品的起始拷貝數(shù)。 3熒光定量 PCR 技術(shù)中標(biāo)記方法的分類熒光定量檢測(cè)可分為擴(kuò)增序列非特異和擴(kuò)增序列特異兩類檢測(cè)。根據(jù) 所使用的標(biāo)記物不同又可分為熒光染料法和熒光探針法兩種。熒光染料法 包括飽和熒光染料和非飽和熒光染料,非飽和熒光染料的典型代表

8、就是現(xiàn) 在最常用的 SYBR Green,飽和熒光染料有 Eva Green、 LC Green等;熒 光探針法包括水解探針法、 Beacon 技術(shù)(分子信標(biāo)技術(shù) 、雜交探針以及 Scorpion 引物 /探針等。3.1非特異性的 DNA 結(jié)合染料法熒光染料能結(jié)合在 DNA 雙鏈結(jié)構(gòu)的小溝中而發(fā)光,而游離的熒光染料 不發(fā)出熒光,因此擴(kuò)增開始時(shí)檢測(cè)不到熒光信號(hào)隨著擴(kuò)增的進(jìn)行,熒光染 料與逐漸增多的 dsDNA 結(jié)合,熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng),直到達(dá)到閾值,被熒光 探測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)到 12。 染料與 DNA 雙鏈分子的結(jié)合是非特異性的 , 它可以和反 應(yīng)體系中所有 DNA 分子結(jié)合 , 易受到非特異性擴(kuò)增和引

9、物二聚體的影響 , 使定量結(jié)果不可靠。因此引物設(shè)計(jì)和反應(yīng)條件的優(yōu)化對(duì)消除非特異性熒光 有很大幫助。在實(shí)驗(yàn)中常用的熒光染料有 Pico Green 和 SYBR Green。 SYBR Green染料的應(yīng)用最為廣泛,能與所有的雙鏈 DNA 結(jié)合,它的最大 吸收波長約為 497 nm,發(fā)射波長最大約為 520 nm,適合于所有的熒光定量 PCR 。如圖 3為 SYBR Green的工作原理。然而,正由于能和所有雙鏈 DNA 結(jié)合,使得引物二聚體、單鏈二級(jí)結(jié)構(gòu)以及錯(cuò)誤的擴(kuò)增產(chǎn)物引起假陽性而 影響定量的精確性。 Pico Green 是一種新型的染料,與 SYBR Green相 比,其靈敏度較高,可以

10、檢測(cè)出至少 25pg mL -1的 dsDNA 分子,且具有線性 范圍廣, RNA ssDNA 及其他物質(zhì)的影響小的優(yōu)點(diǎn) 13。熒光染料的優(yōu)勢(shì)在于 它能監(jiān)測(cè)任何 dsDNA 序列的擴(kuò)增,不需要設(shè)計(jì)探針且方便、成本低。但由 于染料與 DNA 雙鏈分子的結(jié)合是非特異性的,一首非特異性擴(kuò)增和引物二 聚體的影響,使得定量結(jié)果不可靠?？梢越柚芙馇€分析法區(qū)分非特異 性產(chǎn)物和引物二聚體所產(chǎn)生的熒光,排除假陽性。 3.2特異性熒光定量 PCR特異性熒光定量 PCR 的基本原理是當(dāng)一個(gè)熒光分子(又稱供體分子 的熒光光譜與另一個(gè)熒光分子(又稱受體分子的激發(fā)光譜相重疊時(shí),供 體熒光分子的激發(fā)能誘導(dǎo)受體分子發(fā)出熒

11、光,同時(shí)供體熒光分子自身的熒 光強(qiáng)度衰減,這種現(xiàn)象即是熒光 FRET 。當(dāng) PCR反應(yīng)開始后,熒光探針的發(fā) 光基團(tuán)所發(fā)出的熒光強(qiáng)度與 PCR 產(chǎn)物的數(shù)量呈對(duì)應(yīng)關(guān)系,因此對(duì)熒光信號(hào) 進(jìn)行檢測(cè)即可實(shí)現(xiàn)對(duì) PCR 產(chǎn)物的準(zhǔn)確定量 14。3.2.1水解探針(TaqMan 探針法TaqMan 探針是應(yīng)用最廣泛的水解探針,它是一種寡核苷酸探針, 5 端和 3端分別標(biāo)記一個(gè)報(bào)告熒光基團(tuán)和一個(gè)淬火熒光基團(tuán)。 其基本原理主 要是在 PCR 反應(yīng)體系中加入一個(gè)特異的熒光標(biāo)記探針,當(dāng)探針完整時(shí),檢 測(cè)不到熒光信號(hào)。在 PCR 退火時(shí),探針與模板發(fā)生特異性雜交,然后引物 沿模板 DNA 延伸到達(dá)探針,而 Taq 酶有

12、 5 -3外切活性,發(fā)生置換反應(yīng)使 得 3端與 5端分離,熒光信號(hào)釋放,熒光檢測(cè)系統(tǒng)就能檢測(cè)到光密度隨 PCR 反應(yīng)進(jìn)行而增加。模板每復(fù)制一次,就有一個(gè)熒光信號(hào)被釋放。因此, 根據(jù) PCR 反應(yīng)液中得熒光強(qiáng)度即可計(jì)算出初始模板的數(shù)量 15。 圖 4是TaqMan 圖 3 SYBR GREEN 1工作原理探針的工作原理。 圖 4TaqMan 探針工作原理3.2.2分子信標(biāo)分子信標(biāo)(也稱為分子燈塔 ,是一莖環(huán)發(fā)卡結(jié)構(gòu)的單鏈 DNA 分子,環(huán) 部與靶 DNA 序列互補(bǔ),長度約 15-35bp ,莖部 GC 含量高,且與靶 DNA 序列 無同源性,約 8bp 。探針的 3端和 5端分別標(biāo)記有熒光報(bào)告基

13、團(tuán)和熒光 淬火基團(tuán)。探針自身兩端序列互補(bǔ),形成發(fā)卡結(jié)構(gòu),不發(fā)熒光。當(dāng)探針特 異的模板雜交時(shí),破壞探針發(fā)卡結(jié)構(gòu),產(chǎn)生熒光。隨著 PCR 產(chǎn)物的積累, 熒光信號(hào)不斷增強(qiáng),課被熒光檢測(cè)儀檢測(cè)到。如圖 5所示,為分子信標(biāo)的 工作原理。理論上,分子信標(biāo)是可以區(qū)分單個(gè)核苷酸差異的 DNA ,但探針標(biāo) 記比較復(fù)雜,并且在溶液中,探針如果不能無選擇性折疊則會(huì)造成部分熒 光本底信號(hào)。另外,如果莖結(jié)構(gòu)的熱力學(xué)溫度過高時(shí),會(huì)影響探針與靶序 列雜交?？傮w來說,分子信標(biāo)的優(yōu)點(diǎn)是特異性強(qiáng),熒光背景低;缺點(diǎn)是設(shè) 計(jì)困難,雜交探針不能完全與模板結(jié)合,穩(wěn)定性較差,價(jià)格高 16。 3.2.3雜交探針雜交探針又稱雙雜交探針,由 A

14、 、 B 兩條相鄰探針組成,探針 A 在 3 端攜帶一熒光供體,另一探針 B 的 5端攜帶一熒光受體,探針 B 的 3端 被封閉,防止在退火時(shí)延伸 17。在 PCR 退火階段,兩個(gè)探針雜交在模板 DNA 的相鄰區(qū)段,并頭尾結(jié)合,兩者產(chǎn)生 FRET 現(xiàn)象,發(fā)出熒光,當(dāng)兩探針游離 時(shí),無熒光產(chǎn)生。反應(yīng)中使用了兩個(gè)探針,只有兩探針獨(dú)立雜交在正確的 靶序列上才能檢測(cè)到熒光信號(hào),增加了反應(yīng)的特異性,對(duì)探針設(shè)計(jì)提供了 更多選擇。但兩個(gè)探針結(jié)合于模板上影響擴(kuò)增效率 , 合成兩個(gè)探針 , 成本相 對(duì)較高 18。由于 FRET 探針是靠近發(fā)光,所以熒光檢測(cè)儀檢測(cè)到的信號(hào)是實(shí) 時(shí)信號(hào),而不是累積信號(hào) 11。3.2

15、.4蝎子引物法蝎子引物 /探針即 Scorpion 引物 /探針。該方法將序列特異引物延伸和 探針雜交轉(zhuǎn)換成單分子活動(dòng),直到聚合酶水解雙標(biāo)記才發(fā)生熒光信號(hào),與 較慢的 TaqMan 反應(yīng)相比,使信號(hào)反應(yīng)速度增快 19。 Scorpion 引物 /探針是 由一條發(fā)卡結(jié)構(gòu)的探針和一條引物構(gòu)成,探針的 5端和 3端分別連有報(bào) 告熒光和淬火熒光。在 PCR的變性階段,探針的發(fā)卡結(jié)構(gòu)會(huì)打開,退火的 圖 5 分子信標(biāo)工作原理時(shí)候與模板 DNA 結(jié)合,報(bào)告熒光和淬火熒光分離而產(chǎn)生熒光。 Scorpion 引 物 /探針中,序列特異性引物和探針在同一個(gè)分子上,因此,更加靈敏,熒 光信號(hào)產(chǎn)生的特別快。圖 6是蝎

16、子引物法的工作原理圖。 4熒光定量 PCR 技術(shù)的定量方法在熒光定量 PCR 中,模板定量有絕對(duì)定量和相對(duì)定量兩種。該技術(shù)可 以對(duì) DNA 、 RNA 樣品進(jìn)行定性和定量分析。絕對(duì)定量可以得到某一個(gè)樣本中 基因的拷貝數(shù)和濃度;相對(duì)定量可以比較不同方式處理的兩個(gè)樣本中得基 因表達(dá)水平。4.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的絕對(duì)定量法用已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品作為模板進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增,以標(biāo)準(zhǔn)品的濃度的對(duì)數(shù) 值為橫坐標(biāo),以所測(cè)得的 Ct 值為縱坐標(biāo),繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線。然后在相同條 件下檢測(cè)未知樣品的 Ct 值,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線可計(jì)算出未知樣品的拷貝數(shù)。定 量的標(biāo)準(zhǔn)曲線可以通過化學(xué)合成目的基因,或者將已知基因 DNA片段克隆 圖 6

17、蝎子探針法的工作原理在載體上,提取質(zhì)粒后,測(cè)量濃度并計(jì)算出其拷貝數(shù),然后再進(jìn)行 5倍或 10倍系列稀釋作為 PCR 的模板,制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)產(chǎn)生曲線的斜率可以 計(jì)算出 PCR 效率。如果 PCR 效率大于 100%,說明加入的已知陽性對(duì)照不正 確,或者在標(biāo)準(zhǔn)品中有 PCR 抑制物。如果有進(jìn)行 PCR 效率計(jì)算,則可能導(dǎo) 致高估未知樣品的模板量。4.2雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法的相對(duì)定量法雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法是指在測(cè)定目的基因的同時(shí)測(cè)定某一內(nèi)源性管家基因并 用目的基因和管家基因的標(biāo)準(zhǔn)品分別作出標(biāo)準(zhǔn)曲線處理與未處 理樣品同時(shí) 擴(kuò)增目的基因和管家基因獲得 Ct 值然后從各自的標(biāo)準(zhǔn)曲線上求出初始模板 量經(jīng)管家基因均一化處

18、理后求出目的基因的相對(duì)含量 20。使用相對(duì)定量時(shí), 要求所有樣品擴(kuò)增的 PCR 效率相近,一般要求大于 90%。定量 PCR 過程中, 要求管家基因的表達(dá)量不受實(shí)驗(yàn)處理的影響,而且其表達(dá)量在不同組織中 也不發(fā)生變化。而目前還沒有一種適用于各種材料的通用管家基因,因此 在實(shí)驗(yàn)過程中應(yīng)盡量選擇一種表達(dá)量變化較小的管家基因。通常選用的管 家基因有 GAPDH 、 -actin 2、 2微球蛋白、 18SrRNA 、 TATA-box 等。 5熒光定量 PCR 在 microRNA 定量方面的應(yīng)用成熟 miRNA 長度為 20-24nt ,與常規(guī) PCR 反應(yīng)中的引物長度相近,因此 常規(guī) PCR 無法

19、實(shí)現(xiàn)對(duì) miRNA 的檢測(cè),這是 miRNA 分析檢測(cè)研究中的一大挑 戰(zhàn) 21。如今,科學(xué)家已經(jīng)研究出多種 miRNA 的定量檢測(cè)技術(shù),有基于直接 雜 交 的 檢 測(cè) 技 術(shù) , 如 Northern blotting 22,23, mirVana miRNA detection(Ambion公司 和 microarray 24,25等 , 這些方法的優(yōu)點(diǎn)是通量高 , 一次可以同時(shí)檢測(cè)多個(gè) miRNA 的表達(dá)情況 , 缺點(diǎn)是技術(shù)含量較高 , 成本大 , 還存在同一 miRNA 不同家族成員之間互相錯(cuò)配雜交的噪音信號(hào) , 且不適合 表 達(dá) 量 較 低 的 miRNA 檢 測(cè) ; 結(jié) 合 PCR

20、與 探 針 的 定 量 檢 測(cè) 技 術(shù) , 如 stem-loop 26, key-like27及 Ligation Assay28, 這三者需要使用 miRNA 特異的探針 , 這類方法的突出優(yōu)點(diǎn)是特異性強(qiáng) , 常常能區(qū)分同一 miRNA 家 族的不同變體 , 缺點(diǎn)是探針的設(shè)計(jì)與合成需借助于商業(yè)公司 , 方便性與特異性很難得到統(tǒng)一的解決 ; 基于 PCR 與熒光染料如 SYBR Green的定量檢測(cè) 技術(shù) , 如 poly(A聚合酶加尾法 29、引物延伸法 30、 Multiplexed RT法 31和 miR-Q 法 32等 , 由于這些技術(shù)靈敏度高、操作流程簡(jiǎn)單、設(shè)備和試劑要 求相對(duì)較低

21、、集通用性和特異性于一身 , 便于一般實(shí)驗(yàn)室開展。 后 兩者 miRNA 檢測(cè)技術(shù)都是以熒光定量 PCR 技術(shù)為基礎(chǔ)的。5.1探針定量 PCR 檢測(cè)技術(shù)探針定量 PCR 檢測(cè)技術(shù)主要有 stem-loop, key-like以及 Ligation Assay 技術(shù)。 stem-loop 與 key-like 技術(shù)的原理基本相同。但兩者之間還 有一些區(qū)別。首先,逆轉(zhuǎn)錄引物有區(qū)別, stem-loop 技術(shù)的逆轉(zhuǎn)錄引物為 5 -GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACNNNNNN- 3, 由 44個(gè)堿基組成 , 其形成互補(bǔ)雙鏈的 stem 部分由 1

22、4對(duì)互補(bǔ)堿基構(gòu)成 , A=T和 G=C對(duì)數(shù)目相同 , 有 6個(gè)堿基與成熟 miRNA 互補(bǔ), key-like 技術(shù)的逆轉(zhuǎn)錄 引物為 5 -CGCGAGCACAGAATTAATACGACTCACTATACGCGNNNNNNNN- 3, 由 35個(gè) 堿基組成 , 其形成互補(bǔ)雙鏈的 stem 部分由 4對(duì)互補(bǔ)堿基構(gòu)成 , 均為 G=C, 有 8個(gè)堿基與成熟 miRNA 互補(bǔ)。再者,就是探針的區(qū)別, stem-loop 技術(shù)的 探針有 8個(gè)左右的堿基與成熟 miRNA 互補(bǔ) , 而 key-like 技術(shù)的探針只有 3個(gè)堿基與成熟 miRNA 互補(bǔ) , 但 stem-loop 技術(shù)探針的發(fā)光基團(tuán)位于

23、與反向 引物配對(duì)的一端 , 而 key-like 技術(shù)探針的發(fā)光基團(tuán)位于與 miRNA 配對(duì)的一 端。最后,還有正向引物的區(qū)別, stem-loop 技術(shù)的正向引物在設(shè)計(jì)時(shí)為了 讓探針與更多的 miRNA 配對(duì) , 有意識(shí)地讓引物向外滑動(dòng)了一些堿基 , 而 key-like 技 術(shù) 的 正 向 引 物 則 基 本 上 是 miRNA 序 列 。 另 外 就 是 連 接 法 (ligation Assay , 這中技術(shù)與前兩種檢測(cè)技術(shù)相比,原理略有不同。連 接法首先利用 8個(gè)左右的與成熟 miRNA 互補(bǔ)的短核苷酸鏈逆轉(zhuǎn)錄合成單鏈 cDNA, 在利用包含通用序列和 miRNA 特異序列的左、 右

24、核苷酸鏈與 miRcDNA 互補(bǔ)配對(duì) , 并用 T4連接酶補(bǔ)平缺口 , 形成一條完成的 miRcDNA 鏈 ; 再利用 根據(jù) miRNA 序列設(shè)計(jì)的探針和左、右核苷酸鏈前端預(yù)置的正反向引物進(jìn)行 實(shí)時(shí)定量 PCR 擴(kuò)增 , 收集熒光信號(hào) , 獲得 miRNA 的表達(dá)量。如圖 7是三種 探針定量 PCR 的 miRNA 檢測(cè)技術(shù)。 圖 7 基于 PCR 和探針的 3種 miRNA 檢測(cè)方法示意圖5.2熒光染料 PCR 定量檢測(cè)技術(shù)熒光定量 PCR 定量檢測(cè) miRNA 技術(shù)又可分為 polyA 聚合酶加尾法 ( polyA tailing assay , 引 物 延 伸 法 ( prmier ex

25、tension assay , Multiplexed RT法 (multiplexed RT assay以及 miR-Q 法 (miR-Q assay。 polyA 聚合酶加尾法是在成熟的 miRNA 的 3端加上一個(gè) poly(A尾巴,形 成一個(gè)近似 mRNA 的結(jié)構(gòu),然后設(shè)計(jì)一個(gè)帶有 poly(T的逆轉(zhuǎn)錄引物,再以 miRcDNA 為模板,利用 miRNA 特異的反向引物和帶有 poly(T的通用正向逆 轉(zhuǎn)錄引物以及 SYBR Green進(jìn)行 qPCR 擴(kuò)增。引物延伸法引進(jìn)了一種新的寡 聚核苷酸鎖核酸(locked nucleic acid LNA 。該方法首先利用逆轉(zhuǎn)錄引 物,逆轉(zhuǎn)錄合

26、成 miRcDNA ,然后利用逆轉(zhuǎn)錄引物 5端預(yù)置的通用正向引物 和包含兩個(gè)鎖核酸且與 miRcDNA 互補(bǔ)配對(duì)的反向引物進(jìn)行實(shí)時(shí)定量 PCR 擴(kuò) 增,確定 miRNA 的表達(dá)量。 Multiplexed RT法不同于其他方法的最大特點(diǎn) 就是取消了通用引物的正向和反向 qPCR 引物,使得每個(gè) miRNA 都具有特異 的逆轉(zhuǎn)錄引物和 qPCR 的正向和反向引物,這種方法的基本原理和引物延伸 法相似。 Multiplexed RT 法首先將需要研究的所有 miRNA 的特異 RT引物等量混合 , 構(gòu)建一個(gè) RT 引物庫進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成 miRcDNA, 然后給每一個(gè)不同 的 miRNA 設(shè)計(jì)特異的

27、正反向引物進(jìn)行 qPCR 擴(kuò)增。 miR-Q 法的逆轉(zhuǎn)錄引物 RT6-miR-x 由 2部分組成 , 其 3端為與 miRNA 互補(bǔ)的堿基序列 (約 6nt, 另 一部分為通用引物 MP-fw 序列。在進(jìn)行 qPCR 擴(kuò)增時(shí),需要另外引入一個(gè)包 含寡聚核苷酸鏈 short-miR-x-rev, 其 3端為 miRcDNA 的互補(bǔ)序列 , 5 端為通用引物 MP-rev 序列。圖 8是 SYBR Green熒光染料定量 PCR 技術(shù)的 四種 miRNA 檢測(cè)方法的原理圖。圖 8 SYBR Green熒光染料定量 PCR 技術(shù)的四種 miRNA 檢測(cè)方法示意圖 6小結(jié)熒光定量 PCR 的發(fā)明,使得

28、實(shí)時(shí)檢測(cè) PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物成為了可能,實(shí)現(xiàn) 了從粗略定量、半定量到相對(duì)定量、絕對(duì)定量的跨越。通過設(shè)計(jì)針對(duì)目的 基因的特異性引物和探針 并優(yōu)化反應(yīng)體系和控制反應(yīng)條件 可以成功地建 立快速靈敏特異的熒光定量 PCR 檢測(cè)方法實(shí)現(xiàn)大樣本同時(shí)檢測(cè),節(jié)省大量 的時(shí)間和反應(yīng)成本。目前, miBase 數(shù)據(jù)庫公布了近 15000條 miRNA 序列, 但多數(shù) miRNAs 參與生命活動(dòng)的分子機(jī)制還有待研究。近年來 , 人們把研究 的重點(diǎn)越來越多地放到了 miRNAs 參與基因表達(dá)調(diào)控的分子機(jī)制上。因此, 了解和掌握 miRNAs 的定量檢測(cè)技術(shù)對(duì)研究其具體生命活動(dòng)過程中得表達(dá)量 進(jìn)行檢測(cè),成為研究 miRN

29、As 作用機(jī)制的基礎(chǔ)。熒光定量 PCR 成為了此方面 研究的重要工具。參考文獻(xiàn)1趙煥英 , 包金風(fēng) . 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 技術(shù)的原理及其應(yīng)用研究進(jìn)展 J.中國 組織化學(xué)與細(xì)胞化學(xué)雜志 ,2007,16(4:492-497.2 Wheeler BM, Heimberg AM, Moy VN, et al The deep evolution of metazoan microRNAs. Evol Dev, 2009,11:50-68.3 SunkarR, Jagadeeswaran G. In silico identification of conserved microRNAs in l

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