跨界正流行以定量pcr 來(lái)分析蛋白

1、 定量 PCR 能分析蛋白嗎?你肯定會(huì)說(shuō),開玩笑。不過(guò)這是千真萬(wàn)確的,一向以創(chuàng)新著稱的美國(guó)應(yīng) 用生物系統(tǒng)公司剛剛推出了 TaqMan Protein Expression Assays,首次應(yīng)用 TaqMan 分析與實(shí)時(shí)定 量 PCR 來(lái)定量蛋白表達(dá),能對(duì)有限數(shù)量的人胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)物中的多能標(biāo)志物進(jìn)行快速輕松的鑒定及 相對(duì)定量。細(xì)胞的鑒定是一個(gè)新興的領(lǐng)域, 直到現(xiàn)在,TaqMan 5這個(gè)試劑盒究竟是如何定量的。 其實(shí)它是基于一項(xiàng)新穎的檢測(cè)方法,稱為 PLA - Proximity Ligation Assay技術(shù)。 PLA 利用親和 系統(tǒng)來(lái)定量檢測(cè)蛋白的 存在,適用于含 10-500(就 是帶

2、了一段 oligo 尾巴的抗體共同孵育。每個(gè)蛋 白設(shè)計(jì)有兩個(gè)探針 A 和 B 。之后用 DNA 連接酶將 兩段 oligo 連接起來(lái), 如圖 1所示。 經(jīng)過(guò)酶的滅活, 就能夠進(jìn)行實(shí)時(shí)定量 PCR 了。沒有洗 滌步驟,所需的細(xì)胞量比 western blot方法低 100-500倍。與傳統(tǒng)的 基因表達(dá)分析一 樣, TaqMan 蛋白表達(dá)分析所得的數(shù)據(jù)很容易進(jìn) 行相驟, 能釋放所有類型的蛋白, 此 步驟與 TaqMan試劑結(jié)合,創(chuàng)造出高度靈敏而特 異的過(guò)程, 來(lái)測(cè)定少量樣品中的蛋白表達(dá)。 整個(gè)實(shí) 驗(yàn)過(guò)人胚胎干研究人員還需要使用頗費(fèi)勞力的蛋白分析技 術(shù), 如流式細(xì)胞術(shù)、 免疫染色及 western

3、blot分析。 這些方法不夠靈敏,本身也很難定量。 TaqMan 蛋白表達(dá)分析則采用一步法裂解樣品及簡(jiǎn)化的實(shí) 時(shí)定量 PCR 流程, 3.5小時(shí)就能從樣品中獲得數(shù) 據(jù),而所需樣品量只有其他方法的 1/100-1/10。TaqMan 蛋 白 表 達(dá) 分 析 利 用 金 標(biāo) 準(zhǔn) 的 核酸酶試劑來(lái)定量蛋白表達(dá), 其工作 流程和樣品量與普通的 mRNA 及 microRNA 分析 相似。由于蛋白表達(dá)結(jié)果是來(lái)自相同的分析平臺(tái), 那么這些創(chuàng)新的分析能夠?qū)?mRNA 和 /或 miRNA 的表達(dá)與蛋白表達(dá)直接關(guān)聯(lián)。 其它任一種蛋白定量 分析方法都不具備這個(gè)能力。新穎的原理你一定很納悶純 化的抗體和實(shí)時(shí)定量

4、PCR個(gè)細(xì)胞的裂解液。首先將細(xì)胞裂解,然后與抗體 -oligo-探針這些預(yù)先設(shè)計(jì)的分析非常簡(jiǎn)單且可靠, TaqMan對(duì)定量, 且極其適合多能和分化干細(xì)胞中的標(biāo) 志物相對(duì)定量。簡(jiǎn)化的流程TaqMan 蛋白表達(dá)分析流程運(yùn)用了簡(jiǎn)單的 一步法樣品裂解步程, 從樣品到數(shù)據(jù), 在 3.5小時(shí)內(nèi)就能完成 (圖 2,操作時(shí)間僅為 1.5小時(shí)。所有試劑都已為分 析細(xì)胞培養(yǎng)物中的蛋白而優(yōu)化。樣品制備過(guò)程溫 和, 一步法細(xì)胞裂解用的是非離子型去污劑。 隨后 樣品能與任何蛋白表達(dá)分析試劑盒的分析探針混 合,而分析探針的結(jié)合需要 60分鐘。然后加入連 接酶將寡核苷酸連接起來(lái),接著是 15分鐘的滅活 或純化步驟, 來(lái)消化

5、所有蛋白。 再通過(guò)單次的板轉(zhuǎn) 第 12 頁(yè),共 22 頁(yè) 下一頁(yè) 返回 移將試劑轉(zhuǎn)移到 PCR 平板上,進(jìn)行快速實(shí)時(shí)定量 PCR 。圖 2. TaqMan蛋白表達(dá)分析的詳細(xì)流程。每反應(yīng)分而開發(fā),包括 hICAM1、 hCSTB 、 hOCT3/4、 hNANOG 、 hSOX2和 hLIN28,再加 上支持試劑來(lái)監(jiān)測(cè)人胚胎干細(xì)胞的相對(duì)蛋白水平。 TaqPCR能 夠 在 Applied Bios 速實(shí)時(shí)定量 系統(tǒng)上進(jìn) 小時(shí)內(nèi)得到實(shí)時(shí)定量的實(shí)時(shí)定量讓實(shí)時(shí) 定量 比以往更容易開展。 有了新一代軟件, 這 些 系 統(tǒng) 簡(jiǎn) 單 , 當(dāng) 然 , 它 們 還 有 著無(wú)人可比的性能、 質(zhì)量以及長(zhǎng)期可靠性 關(guān)于

6、我們快速實(shí)時(shí)定量 系統(tǒng) 的 完 整 產(chǎn) 品 信 息 , 請(qǐng) 登 陸個(gè)反應(yīng)孔只需要 2 uL起始樣品(10-500個(gè)細(xì)胞 /uL。對(duì)于 TaqMan分析的步驟 4, 10 uL連接 樣品再加上混合液, 構(gòu)成了 20 uL的實(shí)時(shí)定量 PCR 終體積。便利易用的 析預(yù)先設(shè)計(jì)的 TaqMan 蛋白表達(dá)分析是專為 一些人蛋白靶點(diǎn)Man 蛋白表達(dá)分析產(chǎn)品線還包括核心試劑 盒、 陽(yáng)性與陰性對(duì)照樣品細(xì)胞裂解液試劑盒, 以及 免費(fèi)的數(shù)據(jù)分析軟件。 核心試劑盒中包含分析運(yùn)行 所需的所有試劑,包括連接體寡核苷酸、連接酶、 通用的 TaqMan分析、 新的 TaqMan 蛋白表達(dá) 快速混合液, 需要與每個(gè)蛋白表達(dá)分析

7、試劑盒一起 運(yùn)行分析。可靠的實(shí)時(shí)定量 平臺(tái)TaqMan 蛋 白 表 達(dá) 分 析ystems 的任一臺(tái)快 PCR行,并在一 PCR 的結(jié)果。 Applied BiosystemsPCR 系統(tǒng)提供了 強(qiáng)大的解決方案來(lái)滿足任何實(shí)驗(yàn)室的需求, PCR使 用 Applied Biosystems的記錄作為支持。 PCR 。s 實(shí)時(shí)定量 PCR 系統(tǒng) 所提供的精密軟件包有助于實(shí)驗(yàn)設(shè)定、分析性能測(cè)試。 免費(fèi)的 TaqMan 蛋白表達(dá)分析數(shù) 據(jù)分析軟件工具可在直觀的數(shù)據(jù)分析軟件所有 Applied Biosystem數(shù)據(jù)收集和 下過(guò) 分 析 設(shè) 計(jì) 的 創(chuàng) 新 改 變 , Applied Biosystems品, 盡在 2009十大創(chuàng)新產(chǎn)品評(píng)選, 歡 載。通將 TaqMan分