西番蓮葉有效成分及其非酶糖基化作用的研究

1、西番蓮葉有效成分及其非酶糖基化作用的研究(1)                    作者：劉紅，張彩平，魯團(tuán)偉，李麗，何文英，賈桂云，張連華【摘要】  目的研究西番蓮葉有效成分抑制其非酶糖基化作用。方法運(yùn)用GF254薄層層析，HPLC等對(duì)西番蓮葉石油醚部位進(jìn)行提取分離。結(jié)果石油醚部位的主要黃酮物質(zhì)為蕓香苷。結(jié)論蕓香苷為西番蓮葉石油醚部位抑制蛋白質(zhì)非酶糖基化作用的主要成分。 【關(guān)鍵詞】&

2、#160; 西番蓮； 蕓香苷； 非酶糖基化； 高效液相色譜； 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用西番蓮（Passiflora）是西番蓮科(Passifloraceae)西番蓮屬的多年生常綠藤本植物。西番蓮果大，可鮮食，其汁蛋黃色，尤其突出的是，其果汁所含的六十多種酯類(lèi)等香味成分使其具有強(qiáng)烈誘人的風(fēng)味和香氣，被譽(yù)為“百香果”1。    祖國(guó)醫(yī)學(xué)在治療糖尿病及其并發(fā)癥方面有悠久的歷史，如何從中草藥中尋找抑制蛋白質(zhì)糖基化的有效成分是一項(xiàng)非常有價(jià)值的工作，目前這方面的研究還不多。    蛋白質(zhì)非酶糖基化在糖尿病血管并發(fā)癥的發(fā)生中占有重要地位。蛋白質(zhì)與羰基化合

3、物(葡萄糖、果糖和乙二醛等)發(fā)生非酶糖基化反應(yīng)，最終可形成一系列不可逆的糖基化終產(chǎn)物AGEs。AGEs可與蛋白質(zhì)發(fā)生交聯(lián)，改變蛋白質(zhì)的生理活性，引起一系列病理生理改變。此外，AGEs與動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)2。因此，如何抑制蛋白質(zhì)的非酶糖基化是近年來(lái)國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。目前國(guó)外已證實(shí)，氨基胍,二甲雙胍可抑制蛋白質(zhì)的糖基化，并相繼開(kāi)發(fā)出一系列藥物3。    本文通過(guò)對(duì)西番蓮葉用95%乙醇浸泡 7 d4，用石油醚萃取分離，對(duì)乙醇和石油醚部分薄層分析、HPLC分析，并對(duì)提取物進(jìn)行了抑制糖基化作用的研究。1  儀器與材料1.1  儀器高效液相色譜

4、（日本島津公司)；pH-3C型酸度計(jì) ；熒光分析儀器（日本島津）；DHG-9246A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；FW-117中草藥粉碎機(jī)（天津泰斯特儀器有限公司）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀。1.2  試劑乙醇，醋酸乙酯，石油醚，正丁醇,乙二醛，磷酸二氫鈉，磷酸氫二鈉，葡萄糖，D-果糖，疊氮化鈉，牛血清白蛋白，鹽酸二甲雙胍，蕓香苷。2  方法2.1  提取與分離西番蓮葉樣品于2007-10晴天上午10時(shí)采自海南屯昌南坤，在65經(jīng)干燥箱干燥3 d，后經(jīng)粉碎制得。西番蓮葉粉碎后,用95%的乙醇浸泡7 d，然后用石油醚浸泡萃取，抽真空過(guò)濾，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀分離得到浸膏，

5、用石油醚-醋酸乙酯（829）做展開(kāi)劑，進(jìn)行薄層色譜，得到兩層，將第1層Rf=0.91用石油醚溶解，備用。2.2  鑒定HPLC的色譜條件：用2%的乙酸溶液和乙腈（2080）做流動(dòng)相，天津天和C18柱，250 mm×4.6 mm，波長(zhǎng) 337 nm,靈敏度0.01AuFs,柱溫30，流速0.8 ml/min，進(jìn)樣量20 l 5。蕓香苷和石油醚部位的薄層分析提取物的HPLC的色譜見(jiàn)圖12。    通過(guò)對(duì)上面HPLC譜圖分析可知，蕓香苷對(duì)照品的主峰出峰時(shí)間與西番蓮石油醚部位的主峰出峰時(shí)間相同，可以得出石油醚部位通過(guò)薄層色譜分離得到了蕓香苷。本篇論文由

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7、得的石油醚、醋酸乙酯、正丁醇、水層提取物質(zhì)量，每一層各取10 mg用無(wú)水乙醇溶解定容到50 ml備用。2.3.2   溶液配制pH=7.4磷酸鹽緩沖液（PBS）的配制7：精密稱(chēng)取Na2HPO4 7.163 5 g溶解至100 ml, NaH2PO4 0.936 8 g溶解至30 ml，配制成了0.2 mol/L的Na2HPO4 100 ml和0.2 mol/L的NaH2PO4 30 ml，然后按8119（體積比）配制成0.2 mol/l的磷酸鹽緩沖液100 ml。2.3.3   蛋白質(zhì)非酶糖基化反應(yīng)根據(jù)文獻(xiàn)，反應(yīng)液由12 mg/ml乙二醛，10 mg/m

8、l牛血清白蛋白和2 mg/ml疊氮化鈉在pH 7.4，0.2 mol/L的磷酸緩沖液，2 ml反應(yīng)液與2 ml水混合，于37恒溫水浴箱避光孵育，15 d測(cè)定熒光強(qiáng)度(熒光分光光度計(jì)，日本島津公司。測(cè)定條件:激發(fā)波長(zhǎng)370 nm，狹縫3 nm，發(fā)射波長(zhǎng)440 nm，狹縫3 nm)。2.3.4   藥物干預(yù)試驗(yàn)將2 ml提取液與2 ml pH 7.4的PBS 90下混合40 min，去除有機(jī)物，再加入2 ml反應(yīng)液，37恒溫水浴箱避光孵育。蕓香苷和二甲雙胍(100 mmol/L)溶液2 ml分別與2 ml反應(yīng)液作為陽(yáng)性藥物對(duì)照，2 ml水與2 ml反應(yīng)液混合作為對(duì)照組。2.3.

9、5   蛋白質(zhì)糖基化抑制率的測(cè)定 根據(jù)糖基化終產(chǎn)物有自發(fā)熒光的特性，采用熒光法測(cè)定熒光值(測(cè)定條件:激發(fā)波長(zhǎng)370 nm，狹縫3 nm，發(fā)射波長(zhǎng)440 nm，狹縫3 nm)。根據(jù)下列公式計(jì)算抑制率：    I=a-ba    式中，I為抑制率;a為對(duì)照，即不加樣品液的熒光強(qiáng)度;b為樣品熒光強(qiáng)度。2.3.6    數(shù)據(jù)處理采用方差分析檢驗(yàn)其顯著性，中藥抑制率指標(biāo)均以±s表示。3  結(jié)果    取定容于50ml的石油醚部位、醋酸乙

10、酯部位、正丁醇部位、水層部位各2 ml，分別加入2 ml反應(yīng)液混合。    取定容于50 ml的石油醚部位，精密量取2,1.6，1.2，0.8，0.4 ml分別與2 ml反應(yīng)液混合，分別命名為樣1，樣2，樣3，樣4，樣5。    西番蓮提取物的抑制率結(jié)果見(jiàn)圖3，西番蓮石油醚部位的熒光強(qiáng)度和抑制率見(jiàn)圖4。    通過(guò)圖3，可以得出蕓香苷的抑制率最強(qiáng)，其次為石油醚部位，而且石油醚部位的作用強(qiáng)于二甲雙胍，西番蓮抑制蛋白質(zhì)非酶糖基化的研究還是有一定的研究?jī)r(jià)值。通過(guò)圖4可知，西番蓮石油醚部位的抑制率是隨著濃度的減小

11、而減小。4  討論    本文通過(guò)對(duì)西番蓮葉的石油醚提取物進(jìn)行了薄層分析，得出石油醚部分含有蕓香苷，蕓香苷具有抑制蛋白質(zhì)非酶糖基化作用，比較了西番蓮的有效成分蕓香苷和二甲雙胍的作用效果，發(fā)現(xiàn)蕓香苷效果明顯強(qiáng)于二甲雙胍，可見(jiàn)西番蓮葉應(yīng)用可能會(huì)為糖尿病患者帶來(lái)福音?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】  1陳智毅,李升峰,吳繼軍，等.西番蓮的加工利用研究J.現(xiàn)代食品科技,2006,22(1）:186.2Vlassarah.Advanced glcoslation end-produtes and atherosclerosisJ.Ann Med,1996,28:419.3

12、陳睿杰.劉允堅(jiān).糖尿病治療藥物的研究現(xiàn)狀J.廣東藥學(xué)院學(xué)報(bào)，2001,17:131.4Martina Rudnicki，Marcos Roberto de Oliveira，Tiago da Veiga Pereira ,et al.Antioxidant and antiglycation properties of Passiflora alataand Passiflora edulis extractsJ.Food Chemistry，2007,100: 719.5Cíntia A. M. Pereira, Janete H. Yariwake, A HPTLC Densitometric Determination of Flavonoids from Passiflora alata, P. edulis,P. incarnata and P. caerulea and Co