熒光定量RT-PCR對水稻條紋病毒在水稻懸浮細(xì)胞內(nèi)的基因表達(dá)分析

1、熒光定量RT-PCR 對水稻條紋病毒在水稻懸浮細(xì)胞內(nèi)的基因表達(dá)分析1楊金廣，郭利娟，李冠義，吳祖建，謝聯(lián)輝福建省植物病毒學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建農(nóng)林大學(xué)植物病毒研究所，福州（350002）E-mail ：摘 要：根據(jù)GenBank 中已有的水稻條紋病毒（Rice stripe virus, RSV）序列，設(shè)計(jì)了RSV 編碼的7個(gè)基因的特異性引物，應(yīng)用熒光定量RT-PCR 對RSV 7個(gè)基因在水稻懸浮細(xì)胞內(nèi)的RNA 表達(dá)水平的變化進(jìn)行了分析。結(jié)果表明在RSV 侵染水稻懸浮細(xì)胞后0 h、12 h、24 h、36 h、48 h和60 h均能檢測到RSV 7個(gè)基因的存在。其中RdRp 基因的RNA 表達(dá)量在

2、RSV 侵染水稻懸浮細(xì)胞后12 h達(dá)到高峰，其表達(dá)量為侵染初期的45.07倍，與其它6個(gè)基因的RNA 表達(dá)量的變化顯著不同。其它6個(gè)基因（NS2、NSvc2、NS3、CP 、SP 和NSvc4）的RNA 表達(dá)量均在RSV 侵染后48 h達(dá)到表達(dá)高峰，其RNA 表達(dá)量分別是侵染初期的21.08、10.92、11.99、140.14、50.19和1.54倍。上述表明RSV 侵染水稻懸浮細(xì)胞后48 h達(dá)到復(fù)制高峰。采用t -test 對RSV 7個(gè)基因在水稻懸浮細(xì)胞內(nèi)病毒侵染復(fù)制過程中的RNA 表達(dá)量變化的差異顯著性進(jìn)行分析，結(jié)果顯示RdRp 基因RNA 表達(dá)量的變化最顯著，其t 值為2.67（P=

3、0.050.025）。CP 基因的RNA 表達(dá)量變化最穩(wěn)定，其t 值為1.35（P=0.400.20）。 關(guān)鍵詞：水稻條紋病毒；水稻懸浮細(xì)胞；基因表達(dá)；熒光定量PCR 中圖分類號(hào)：S435.111.49水稻條紋葉枯病是東亞稻區(qū)主要的病毒病, 在我國溫帶和亞熱帶稻區(qū)發(fā)病尤為嚴(yán)重1-2，至今仍在江蘇、河南、安徽、山東、遼寧、云南、北京和浙江等地嚴(yán)重危害。引起該病的水稻條紋病毒（Rice stripe virus, RSV）是纖細(xì)病毒屬（Tenuivirus ）的代表種，是由灰飛虱（Laodelphax striatellus）傳播的，具有雙義編碼策略的負(fù)單鏈RNA 植物病毒。其基因組由4條RNA

4、組成，可編碼7個(gè)蛋白，除RNA1負(fù)義編碼337 kDa的RNA 依賴的RNA 聚合酶（RNA-dependent RNA polymerase, RdRp）外3，RNA2、RNA3和RNA4均為雙義編碼，即在正義鏈和負(fù)義鏈各編碼一個(gè)蛋白。RNA2正義鏈和負(fù)義鏈分別編碼22.8 kDa的NS2蛋白和94 kDa的NSvc2蛋白4。RNA3正義鏈編碼一個(gè)23.9 kDa的NS3蛋白，負(fù)義鏈編碼一個(gè)35 kDa的核衣殼蛋白（coat protein, CP）5。RNA4正義鏈和負(fù)義鏈分別編碼20 kDa的病害特異性蛋白（disease-specific protein, SP）和32 kDa的蛋白N

5、Svc46-7。目前, 只有RdRp 、CP 和SP 3個(gè)基因功能初步確定 1，8-9，其它基因功能尚不明確。當(dāng)前，關(guān)于RSV 在水稻細(xì)胞內(nèi)復(fù)制的研究僅限于Yang et al. 10通過間接ELISA 對RSV CP 蛋白在水稻原生質(zhì)體內(nèi)的表達(dá)進(jìn)行了檢測。為了深入探討RSV 在水稻細(xì)胞內(nèi)的增值和基因表達(dá)的情況，我們應(yīng)用較ELISA 更準(zhǔn)確、精密和特異性的技術(shù)熒光定量RT-PCR ，對RSV 的7個(gè)基因在水稻懸浮細(xì)胞內(nèi)的RNA 表達(dá)量的變化進(jìn)行了研究，以期能夠更加深入地揭示RSV 在水稻懸浮細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制變化，為進(jìn)一步研究RSV 復(fù)制、病毒粒體裝配以及基因功能提供科學(xué)依據(jù)。1材料與方法1.1 植

6、物材料、病毒毒源和試劑1本課題得到國家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究規(guī)劃項(xiàng)目（973） （2006CB100203）、教育部博士點(diǎn)專項(xiàng)科研基金(20040389002； 20050389006；國家自然科學(xué)基金(30671357的資助。粳稻品種日本晴（Oryza sativa L. subsp. japonica cv. Nipponbare）為本研究所保存。病毒毒源采自江蘇洪澤水稻田間呈典型水稻條紋葉枯病癥狀的病株，經(jīng)RT-PCR 鑒定，分離純化后，經(jīng)灰飛虱傳毒并保存于水稻植株中（臺(tái)中1號(hào)）。發(fā)病病株用于RSV 提純11。RNA 提取試劑盒Trizol Reagent為美國Invitrogen 公司產(chǎn)品；Ta

7、KaRa EXScriptTM RT-PCR Kit購于大連寶生物生物工程有限公司；熒光定量PCR 儀MiniOpticon TM System系統(tǒng)為美國Bio-Rad 產(chǎn)品。1.2 水稻懸浮細(xì)胞培養(yǎng)與RSV 侵染水稻懸浮細(xì)胞培養(yǎng)與RSV 侵染參照Yang et al. 的方法10。RSV 侵染水稻懸浮細(xì)胞后0 h、12 h、24 h、36 h、48 h和60 h取樣，置于80條件下保存?zhèn)溆没蛘咧苯舆M(jìn)行總RNA 提取。1.3 引物設(shè)計(jì)應(yīng)用PerlPrimer 軟件對RSV 7個(gè)基因的特異性引物進(jìn)行設(shè)計(jì)12。為保證所設(shè)計(jì)引物的特異性，所選引物均在GenBank 數(shù)據(jù)庫Blast 程序下進(jìn)行比較分

8、析，以避免與水稻基因組任何序列同源。RSV 7個(gè)基因和內(nèi)參基因水稻UBQ5基因的引物序列詳見表1。表1 引物序列及預(yù)測片段大小Table 1 Primers and predicted amplification sizeGene Forward sequence(53 Reverse sequence(53 size/bpNS2 GAGCCTACTACAAGCCACATCAGCCAACCAAGACATAGTCATCACTARG 132 NSvc2 CATCCTTCTTTCTCTAAGTTCGGTCTCAACAGCATACACTATTCCCA 194 NS3 CATCGTCTGTGGGTTCT

9、GTG ATGCTCATCAATGGARGGGT 157 CP RTTGACAGACATACCAGCCAG CATCA TTCACTCCTTCCAAATAACY 243 SP TTGTCACTCMTTCCTATCTCAC TCTTCCACACTTTCTCATACTC 235 NSvc4 CAACCTCTCACYCATTACCC CGGACACTTGAAGATTATGCT 234UBQ513 ACCACTTCGACCGCCACTACTACGCCTAAGCCTGCTGGTT 69 R represent A or G；Y represent C or T；M represent A or C1.4

10、 總RNA 提取與real-time RT-PCR檢測取植物樣品0.1 g，于1 mL Trizol試劑中研磨，然后提取總RNA ，方法按公司提供的產(chǎn)品說明進(jìn)行。20 l 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系中含：總RNA 1 g 、3端引物（10 pmol） 1 l 、5ExscriptTM Buffer 4 l 、dNTP Mixture (各10 mmol/L 1 l 、Exscript TM RTase (200 U/l 0.5 l 、RNase Inhibitor (40 U/l 0.5 l ，最后用RNase Free dH2O 補(bǔ)足20 l 。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件為：42反應(yīng)15 min，95滅活2 min

11、。取1 l cDNA溶液加入以下試劑：2Premix Ex TaqTM 25 l 、3端引物和5端引物（10 pmol）各1 l 和dH 2O 22 l 。real-time PCR在50 l 反應(yīng)體系中，于48孔MiniOpticon TM System系統(tǒng)中進(jìn)行以下反應(yīng)。95預(yù)變性10 s后，進(jìn)行45個(gè)循環(huán)。每個(gè)循環(huán)為95變性6 s，62退火20 s。然后進(jìn)行融解曲線制作，Real-time RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性均通過1瓊脂糖凝膠電泳和每個(gè)基因的融解曲線進(jìn)行鑒定。用 EASY Dilution 將cDNA 溶液按40、41、42、43和44梯度稀釋后，各取1l 稀釋后的cDNA 作

12、為模板進(jìn)行real-time PCR靈敏性檢測和標(biāo)準(zhǔn)曲線構(gòu)建。1.5 數(shù)據(jù)分析根據(jù)內(nèi)參基因的mRNA 的含量對所有樣品進(jìn)行歸一化處理（初始RNA 量校正），然后確定每個(gè)目的基因在不同樣品中的RNA 表達(dá)量。每個(gè)試驗(yàn)樣品重復(fù)檢測3次，并至少進(jìn)行2次生物實(shí)驗(yàn)重復(fù)。利用t -test 對RSV 7個(gè)基因在RSV 侵染水稻懸浮細(xì)胞后0 h、12 h、24 h、36 h、48 h和60 h的RNA 表達(dá)量變化的差異顯著性進(jìn)行分析。2結(jié)果分析2.1 RSV 7個(gè)基因的擴(kuò)增及其引物特異性的分析通過real-time RT-PCR對RSV 侵染后水稻懸浮細(xì)胞內(nèi)的RSV 7個(gè)基因進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示從侵染初期的0

13、 h到侵染后60 h均能檢測到RSV 7個(gè)基因的存在。其中RdRp 片段為124 bp, NS2片段為132 bp，NSvc2片段為194 bp，NS3片段為157 bp，CP 片段為243 bp，SP 片段為235 bp，NSvc4片段為234 bp，內(nèi)參基因UBQ5片段69 bp，片段大小均與預(yù)期設(shè)計(jì)相符，電泳條帶單一（圖1）。并且這些基因的溶解曲線峰值單一（結(jié)果未顯示）。這些特征表明，該研究中所應(yīng)用的RSV 7個(gè)基因和內(nèi)參基因的引物均符合基于SYBR Green I染料法的熒光定量PCR 檢測的標(biāo)準(zhǔn)。2.2 RSV 基因在水稻懸浮細(xì)胞內(nèi)的RNA 表達(dá)量的變化應(yīng)用real-time RT-

14、PCR對RSV 7個(gè)基因在RSV 侵染水稻懸浮細(xì)胞后0 h、12 h、24 h、36 h、48 h和60 h的RNA 表達(dá)量進(jìn)行實(shí)時(shí)定量分析。得到不同樣品每個(gè)基因到達(dá)典型擴(kuò)增的循環(huán)數(shù)C(T,根據(jù)每個(gè)基因標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖2A H ）和內(nèi)參基因mRNA 的含量對不同樣品進(jìn)行歸一化處理。結(jié)果表明，RdRp 基因的RNA 表達(dá)量在RSV 侵染水稻懸浮細(xì)胞12 h后達(dá)到最高值，其RNA 表達(dá)量為侵染初期的45.07倍，隨后急劇下降（圖3A ）。RSV 其它6個(gè)基因（NS2、NSvc2、NS3、CP 、SP 和NSvc4）的RNA 表達(dá)量均在RSV 侵染后48 h達(dá)到表達(dá)高峰值，分別為侵染初期的21.08、1

15、0.92、11.99、140.14、50.19和1.54倍，隨后表達(dá)量一直呈下降趨勢(圖3B G 。其中NS2、NSvc2、NS3、CP 和SP 這5個(gè)基因的相對含量在048 h內(nèi)，除個(gè)別時(shí)間段出現(xiàn)較小的下降外，總體均呈現(xiàn)上升趨勢(圖3B F 。而NSvc4基因RNA 含量在侵染后的1236 h內(nèi)，均低于侵染初期的，在侵染后48 h發(fā)生較小的上調(diào)（圖3G ）。以上結(jié)果表明RSV 侵染水稻懸浮細(xì)胞48 h后達(dá)到第一輪的復(fù)制高峰。M 12345678 1000500100300bp圖1 RSV基因和內(nèi)參基因UBQ5的real-time RT-PCR產(chǎn)物Fig.1 The amplicons of

16、RSV genes and internal control UBQ5 gene via real-time RT-PCR. M: 100 bp DNA ladder; 18: The amplicons of RdRp、NS2、NSvc2、NS3、CP 、SP 、NSvc4 and UBQ5 genes by real-timeRT-PCR in succession. 圖8 RSV基因和內(nèi)參基因UBQ5的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.8 The standard curves of RSV genes and UBQ5 gene. A: RdRp; B: NS2; C: NSvc2; D: NS3; E

17、: CP; F: SP; G:NSvc4; H: UBQ5 圖8 RSV基因在病毒侵染后不同時(shí)間RNA 相對表達(dá)水平Fig.8 The variances of RNA expression for RSV genes at different time post-infection. A: RdRp; B: NS2; C:NSvc2; D: NS3; E: CP; F: SP; G: NSvc4.2.3 RSV基因在水稻懸浮細(xì)胞內(nèi)的RNA 表達(dá)量變化顯著性分析利用t -test 對RSV 7個(gè)基因在RSV 侵染水稻懸浮細(xì)胞后0 h、12 h、24 h、36 h、48 h和60 h表達(dá)變化的差

18、異顯著性進(jìn)行分析。由表2可以看出，CP 基因的RNA 表達(dá)量變化是整個(gè)RSV 侵染復(fù)制過程中最穩(wěn)定的，其t 值為1.35（P=0.400.20）。而RdRp 基因的RNA 表達(dá)量的變化最顯著，其t 值為2.67（P=0.050.025）。NSvc2基因的RNA 表達(dá)量變化的顯著性次之，t 值為2.27。而NSvc4、SP 、NS3和NS2基因在變化顯著性上依次減小，其t 值分別為2.04、1.71、1.56和1.43。表2 RSV基因在病毒復(fù)制過程中變化的差異顯著性Table 2 The different significances of RSV genesGene t P RdRp 0.0

19、50.025 NS2 1.43 0.400.20 NSvc2 2.27 0.100.05 NS3 1.56 0.200.10 CP 1.35 0.400.20 SP 1.71 0.200.10 NSvc42.040.100.053討論在RSV 侵染水稻懸浮細(xì)胞的60 h內(nèi)，除RdRp 的RNA 表達(dá)量在侵染后12 h達(dá)到表達(dá)高峰外，其它6個(gè)基因均在侵染后的48 h達(dá)到表達(dá)量的最大值。這與Yang et al.10報(bào)道的RSV 侵染水稻原生質(zhì)體后20 h達(dá)到表達(dá)高峰稍有差異，推測這可能與RSV 侵染的水稻品種不同和水稻細(xì)胞形態(tài)存在差異以及侵染細(xì)胞的毒源不同有關(guān)。同時(shí)，表明RSV 進(jìn)入細(xì)胞后，首先

20、利用寄主成分合成病毒轉(zhuǎn)化的聚合酶RdRp ，其它基因則依賴RdRp 進(jìn)行合成，推測RdRp 在 RSV 的復(fù)制過程中是至關(guān)重要的。 已有研究表明 RdRp 可在體外轉(zhuǎn)錄出 RSV 每條 RNA N 端和 C 端非編碼區(qū)的保守序列9， 這也為以后制定抗 RSV 策略提供參考。 例如可以利用 RNA 介導(dǎo)技術(shù)對 RSV 的 RdRp 基因轉(zhuǎn)錄進(jìn)行抑制， 這樣可以從根本上抑制病毒在細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制， 從而達(dá)到抗病的目的。 RSV 是負(fù)單鏈 RNA 病毒，并具有雙義編碼策略。純病毒的 RNA 提取物中含有 4 條 ssRNA 和 4 條 dsRNA, dsRNA 由 ssRNA 與它的互補(bǔ) RNA 雜交退

21、火而形成的14。因此，病 毒脫殼后， 母代 RNA 中存在 ssRNA 和負(fù)鏈 RNA， 同一條 RNA 正鏈和負(fù)鏈分別編碼的兩個(gè) 基因可以同時(shí)復(fù)制子代 RNA。我們的研究結(jié)果也表明，除 RdRP 外，RSV 其它 6 個(gè)基因在 達(dá)到表達(dá)高峰值的時(shí)間沒有差異，特別是同一條 RNA 上正鏈和負(fù)鏈編碼的兩個(gè)基因均是在 病毒侵染后 48 h 達(dá)到高峰， 推測 RSV 這 6 個(gè)基因可能是作為一個(gè)整體在水稻細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行復(fù) 制表達(dá)。 Liang et al.通過體外核酸結(jié)合試驗(yàn)的研究推測 NSvc4 蛋白為 RSV 的運(yùn)動(dòng)蛋白 （movement protein, MP）15。本研究結(jié)果也進(jìn)一步證明了該推

22、測。NSvc4 基因的 RNA 表達(dá)量在侵染初 期與高峰期之間的變化最小，其表達(dá)高峰期的含量僅為侵染初期的 1.54 倍，并且在病毒復(fù) 制過程中，NSvc4 基因在侵染后的 36 h 內(nèi)，其 RNA 表達(dá)量一直低于侵染初期，在 48 h 升 高，隨后又急劇下降。推測由于水稻懸浮細(xì)胞在液體培養(yǎng)基中處于游離狀態(tài)，病毒難以在細(xì) 胞之間進(jìn)行移動(dòng)，作為運(yùn)動(dòng)蛋白基因的功能可能減弱，導(dǎo)致表達(dá)量減少。同時(shí)，這一結(jié)果還 與我們已有的研究結(jié)果存在一定的相關(guān)性。我們檢測了不同傳毒效率的灰飛虱體內(nèi) RSV 7 個(gè)基因的表達(dá)差異，顯示 NSvc4 基因的 RNA 表達(dá)量與介體傳毒能力呈正相關(guān)，而其它基因 的 RNA 表

23、達(dá)量變化與介體的傳毒能力沒有明顯相關(guān)性（結(jié)果未發(fā)表） 。在 RSV 侵染水稻懸 浮細(xì)胞過程中，是通過 PEG 介導(dǎo)的方式，使病毒黏附和進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，在此過程中，沒有經(jīng) 過蟲傳途徑，推測蟲傳相關(guān)蛋白的功能可能減弱或喪失。因此，推測 NSvc4 基因可能與灰 飛虱的傳毒相關(guān)。 對 RSV 7 個(gè)基因在病毒侵染復(fù)制過程中進(jìn)行差異顯著性分析， 正義鏈編碼的基因 （NS2、 NS3 和 SP） 變化的差異顯著性均較小， CP 基因外， 除 RSV 其他 3 個(gè)負(fù)義編碼的基因 （RdRp、 NSvc2 和 NSvc4）變化的差異顯著性均較大。其中 RdRp 基因變化的差異顯著性最大，而 CP 基因變化的差異

24、顯著性卻是 7 個(gè)基因中最小，表明 CP 基因在病毒復(fù)制過程中能夠穩(wěn)定 表達(dá)，并且 CP 還是病毒裝配的核外殼蛋白，是病毒粒體的主要成分，因此，CP 基因可以 作為定量檢測 RSV 的分子標(biāo)記。 RSV 在自然界的傳播途徑是通過帶毒灰飛虱刺吸水稻植株傳播，在實(shí)驗(yàn)室的條件下， 灰飛虱的獲毒能力和傳毒能力較低，發(fā)病率一般低于 5。因此，在研究 RSV 與寄主互作 中，需要準(zhǔn)備大量的實(shí)驗(yàn)材料。并且 RSV 侵染寄主后，其潛育期較長，需要 1030 天才能 表現(xiàn)癥狀。從病原物與寄主互作角度分析，待癥狀呈現(xiàn)時(shí)，RSV 與寄主在轉(zhuǎn)錄水平、蛋白 水平和代謝水平的互作均已近末期。本研究結(jié)果表明，在研究 RSV

25、 與寄主互作時(shí)，病毒侵 染后 48 h 病毒復(fù)制已達(dá)高峰，理論上也是病毒與寄主互作最激烈的階段。因此，在以后利 用水稻懸浮細(xì)胞來研究 RSV 與水稻的互作中， 研究者可選擇在病毒侵染 48h 時(shí)進(jìn)行取樣。這 為研究 RSV 與水稻的互作提供了基本的研究數(shù)據(jù)。 本研究利用 real-time RT-PCR 技術(shù)對 RSV 7 個(gè)基因在病毒侵染后 060 h 內(nèi)的 RNA 表 達(dá)量變化進(jìn)行了檢測，揭示了 RSV 7 個(gè)基因在水稻懸浮細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)變化趨勢，這些結(jié)果 為進(jìn)一步研究 RSV 的復(fù)制與病毒粒體的裝配以及 RSV 與寄主互作奠定了研究基礎(chǔ)。但是， 只對 RSV 7 個(gè)基因進(jìn)行了相對定量，不能

26、確定每個(gè)基因的拷貝數(shù)，因此同一時(shí)間點(diǎn) RSV 基 -6- 因之間表達(dá)量的差異就很難確定。 需要構(gòu)建每個(gè)基因的重組質(zhì)粒， 利用不同濃度梯度的線性 重組質(zhì)粒為模板進(jìn)行 real-time PCR， 制作可以精確拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。 這樣才能確定每個(gè)細(xì) 胞內(nèi)不同基因的拷貝數(shù)。同時(shí)，本研究也沒有對 RSV 7 個(gè)蛋白進(jìn)行實(shí)時(shí)定量檢測。這些均 需要以后進(jìn)行補(bǔ)充研究。 參考文獻(xiàn) 1 Toriyama S. Rice stripe virus: prototype of a new group of viruses that replicate in plants and insects. Biocontro

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35、t Virology， Fujian Agricultural and Forestry University，F(xiàn)uzhou (350002） Abstract In order to understand the variances of Rice stripe virus（RSV）coding genes (RdRp、NS2、NSvc2、 NS3、CP、SP and NSvc4 in RNA expression levels during the replication of the virus in rice suspension cells, seven specific prime

36、rs were designed based on all sequences of RSV in GenBank.The variances of RNA expression for 7 genes of RSV in rice suspension cells were investigated by reverse Foundation item: Major Project of Chinese National Programs for Fundamental Research and Development (2006CB100203; Doctoral Fund of Mini

37、stry of Education of China (20040389002; 20050389006; National Natural Science Foundation of China (30671357 -7- transcription real-time PCR. These 7 genes of RSV could be detected at various time (0 h、12 h、24 h、 36 h、48 h and 60 h post infection with RSV in rice suspension cells.The RNA expression of RdRp gene reached its peak at 12 h a