端粒、端粒酶

1、 端粒與端粒酶端粒與端粒酶Telomere and Telomerase端端 粒粒 端粒端粒 是位于真核細胞線性染色體末端的是位于真核細胞線性染色體末端的特殊結構特殊結構, ,由一段重復串聯(lián)的由一段重復串聯(lián)的DNADNA序列與端序列與端粒結合蛋白構成；粒結合蛋白構成； 端粒端粒具有穩(wěn)定染色體具有穩(wěn)定染色體, ,防止末端降解和融合防止末端降解和融合的功能；的功能； 端粒的平均長度隨細胞分裂次數(shù)的增多及端粒的平均長度隨細胞分裂次數(shù)的增多及年齡的增長而變短年齡的增長而變短, ,端粒端粒DNADNA逐漸變短而消逐漸變短而消失失, ,可導可導 致染色體穩(wěn)定性下降并導致衰老致染色體穩(wěn)定性下降并導致衰老。

2、端粒與端粒酶是當今生物學研究的熱點。端粒與端粒酶是當今生物學研究的熱點。 端粒是位于真核細胞染色體末端的核酸蛋白端粒是位于真核細胞染色體末端的核酸蛋白復合體復合體,其功能在于維持染色體的穩(wěn)定性和完整性。其功能在于維持染色體的穩(wěn)定性和完整性。 端粒酶是一種核酸核蛋白酶端粒酶是一種核酸核蛋白酶,能以自身的能以自身的RNA為模板合成端粒的重復序列為模板合成端粒的重復序列,以維持端粒長度的穩(wěn)以維持端粒長度的穩(wěn)定性。定性。 許多研究表明許多研究表明,端粒、端粒酶的功能失調(diào)將影端粒、端粒酶的功能失調(diào)將影響細胞的生物學行為，包括細胞周期的穩(wěn)定性、細響細胞的生物學行為，包括細胞周期的穩(wěn)定性、細胞增殖、癌變、凋

3、亡、衰老。胞增殖、癌變、凋亡、衰老。 端粒的發(fā)現(xiàn)端粒的發(fā)現(xiàn) 1938 Muller X-ray Drosophila 末端極少發(fā)生缺失和倒位末端極少發(fā)生缺失和倒位推測染色體兩端存在特殊結推測染色體兩端存在特殊結構，使染色體趨于穩(wěn)定構，使染色體趨于穩(wěn)定.并定名為并定名為Telomere 1938 B.McClintock 頂端缺失染色體易于融合，而正常染色體不易連接。頂端缺失染色體易于融合，而正常染色體不易連接。 推測染色體末端具有特殊端粒結構。推測染色體末端具有特殊端粒結構。七十年代七十年代 端粒分子組成確定端粒分子組成確定八十年代八十年代 端粒酶的發(fā)現(xiàn)端粒酶的發(fā)現(xiàn)九十年代九十年代 端粒酶與細

4、胞衰老、癌癥的關系端粒酶與細胞衰老、癌癥的關系二零零九年二零零九年 諾貝爾獎諾貝爾獎 伊麗莎白伊麗莎白布蘭克波恩、卡羅爾布蘭克波恩、卡羅爾格雷德、格雷德、 杰克杰克紹斯塔紹斯塔端粒的結構與功能端粒的結構與功能ChromosomeDNAGene 1Gene 2TelomeresTelomeresTTAGGG 1. 1.端粒的組成端粒的組成 端粒端粒DNADNA與端粒結合蛋白與端粒結合蛋白 端粒端粒DNADNA 重復重復: : 端粒端粒DNADNA由高度重復短核苷酸序列組成。由高度重復短核苷酸序列組成。 人：人：-TTAGGG-TTAGGG-重復序列重復序列 保守：保守： 為不含功能基因的簡單、高

5、度重復序列為不含功能基因的簡單、高度重復序列, 在生物進化過程中具有高度保守性。在生物進化過程中具有高度保守性。 不同物種的端粒不同物種的端粒DNA 序列存在差異序列存在差異。 人類及其它脊椎動物染色體端粒的結構是5TTAGGG3的重復序列。體細胞的端粒有限長度（telomere restriction fragments TRFS）大多數(shù)明顯短于生殖細胞，青年人的TRFs又顯著長于年長者，提示TRFs隨著細胞分裂或衰老，在不斷變短，主要是由于DNA聚合酶不能完成復制成線性DNA末端所致。 端粒端粒DNA由兩條互相配對的由兩條互相配對的DNA 單鏈組成單鏈組成, 其其雙鏈部分通過與端粒結合蛋白

6、質(zhì)雙鏈部分通過與端粒結合蛋白質(zhì)TRF1和和TRF2 結合結合共同組成共同組成t環(huán)環(huán)(t loops)。這種。這種t 環(huán)特殊結構可維持染色環(huán)特殊結構可維持染色體末端的穩(wěn)定體末端的穩(wěn)定,保持染色體及其內(nèi)部基因的完整性保持染色體及其內(nèi)部基因的完整性,從從而使遺傳物質(zhì)得以完整復制。缺少端粒的染色體不而使遺傳物質(zhì)得以完整復制。缺少端粒的染色體不能穩(wěn)定存在。能穩(wěn)定存在。 端粒端粒DNA與結構蛋白形成的復合物如同染色體與結構蛋白形成的復合物如同染色體的一頂?shù)囊豁敗懊弊用弊印?，它既可保護染色體不被降解，又，它既可保護染色體不被降解，又避免了端粒對端融合（避免了端粒對端融合（end-end fusion）以及染

7、色體）以及染色體的喪失，同時端粒能幫助細胞識別完整染色體和受的喪失，同時端粒能幫助細胞識別完整染色體和受損染色體。在生理情況下，端粒作為細胞損染色體。在生理情況下，端粒作為細胞“分裂時分裂時鐘鐘”能縮短，最終導致細胞脫離細胞周期。能縮短，最終導致細胞脫離細胞周期。 端粒端粒DNA的長度的長度： 端粒端粒DNADNA的平均長度因物種而異。的平均長度因物種而異。 端粒端粒DNADNA的長度總是波動變化，隨遺傳或營養(yǎng)狀態(tài)而改變。的長度總是波動變化，隨遺傳或營養(yǎng)狀態(tài)而改變。人體中，隨細胞分裂，會緩慢縮短。人體中，隨細胞分裂，會緩慢縮短。Telomere length端粒端粒DNA重復重復序列序列T四膜

8、蟲，四膜蟲，酵母，酵母，植物，植物，蠶，蠶，人人 端粒結合蛋白端粒結合蛋白 與端粒與端粒DNADNA上的特異序列相結合的蛋白上的特異序列相結合的蛋白質(zhì)稱為端粒結合蛋白。質(zhì)稱為端粒結合蛋白。 人端粒重復序列結合因子人端粒重復序列結合因子(Telomeric(Telomeric repeat factorrepeat factor，TRF)TRF)，包括，包括TRF1TRF1和和TRF2TRF2。 TRF1TRF1通過負反饋機制抑制端粒增長，通過負反饋機制抑制端粒增長，穩(wěn)定端粒長度，其并不抑制端粒酶穩(wěn)定端粒長度，其并不抑制端粒酶(telomerase)(telomerase)的表達而是抑制它在端粒

9、末的表達而是抑制它在端粒末端的行為端的行為 TRF1 TRF1，是一個是一個60 kD60 kD的蛋白，結合同的蛋白，結合同源二聚體雙鏈源二聚體雙鏈TTAGGGTTAGGG重復序列，包含重復序列，包含一個一個C C端螺旋端螺旋- -轉折轉折- -螺旋區(qū)和一個螺旋區(qū)和一個DNADNA結合折疊同源區(qū)，結合折疊同源區(qū)，N N端是酸性區(qū)。端是酸性區(qū)。 TRF2TRF2，與與TRF1TRF1相似，但相似，但N N端堿性強。可端堿性強?？梢苑乐谷旧w末端相互融合。以防止染色體末端相互融合。 兩種蛋白在體外都專一與雙鏈兩種蛋白在體外都專一與雙鏈TTAGGGTTAGGG重復序列結合，在體內(nèi)則位于端粒。重復序列

10、結合，在體內(nèi)則位于端粒。 人該環(huán)人該環(huán)DNA DNA 與與TRF1TRF1、TRF2TRF2結合，結合，TRF2TRF2參與參與T T環(huán)形成。環(huán)形成?！癟 T環(huán)環(huán)”保護保護33端對端對抗雙鏈破壞的核酸酶作用。）抗雙鏈破壞的核酸酶作用。）Telomere T-loop2. 2.端粒的功能端粒的功能端粒酶的結構與功能端粒酶的結構與功能端粒酶端粒酶是一種是一種RNA-RNA-蛋白質(zhì)復合物，蛋白質(zhì)復合物， 在端粒被發(fā)現(xiàn)以前，人們就推測生殖細胞之所在端粒被發(fā)現(xiàn)以前，人們就推測生殖細胞之所以能世代相傳，其中可能存在一種維持端粒長度的以能世代相傳，其中可能存在一種維持端粒長度的特殊機制，體細胞可能正是由于缺

11、乏這種機制，它特殊機制，體細胞可能正是由于缺乏這種機制，它的染色體末端才面臨著致死性缺失（的染色體末端才面臨著致死性缺失（deletion）的危）的危險 。 因 此 在 正 常 人 體 細 胞 間 永 生 化 細 胞險 。 因 此 在 正 常 人 體 細 胞 間 永 生 化 細 胞（immortalized cells）及腫瘤細胞的轉化過程中可）及腫瘤細胞的轉化過程中可能也存在著與生殖細胞類似的機制。這些細胞怎樣能也存在著與生殖細胞類似的機制。這些細胞怎樣保持細胞具有繼續(xù)分裂或長期分裂的能力呢？科學保持細胞具有繼續(xù)分裂或長期分裂的能力呢？科學家們發(fā)現(xiàn)端粒確實隨著每次分裂而縮短，但也會被家們發(fā)現(xiàn)

12、端粒確實隨著每次分裂而縮短，但也會被新合成的端粒片斷再延長。科學家們懷疑，可能尚新合成的端粒片斷再延長?？茖W家們懷疑，可能尚有末被發(fā)現(xiàn)的酶，該酶具有標準的有末被發(fā)現(xiàn)的酶，該酶具有標準的DNA多聚酶所不多聚酶所不具備的功能，能使已縮短的端粒延長，使科學家們具備的功能，能使已縮短的端粒延長，使科學家們興奮的是到興奮的是到1984年首先在四膜蟲中證實了這種能使年首先在四膜蟲中證實了這種能使端粒延長的酶端粒延長的酶端粒酶的存在。端粒酶的存在。 端粒酶的結構端粒酶的結構 端粒酶在結構上為一核糖核蛋白復合體端粒酶在結構上為一核糖核蛋白復合體, ,由由RNA RNA 和結合的蛋白質(zhì)組成和結合的蛋白質(zhì)組成,

13、,是是RNARNA依賴的依賴的DNA DNA 聚合酶。它是聚合酶。它是一種特殊的能合成端粒一種特殊的能合成端粒DNADNA的酶的酶, ,通過明顯的模板依賴通過明顯的模板依賴方式每次添加一個核苷酸。方式每次添加一個核苷酸。 端粒酶實質(zhì)上是一種特殊的逆轉錄酶端粒酶實質(zhì)上是一種特殊的逆轉錄酶 端粒酶端粒酶RNA(hTRRNA(hTR) ) 端粒酶逆轉錄酶（端粒酶逆轉錄酶（TERTTERT） 端粒酶結合蛋白端粒酶結合蛋白（TEP） 1 1、端粒酶、端粒酶RNA(hTERTRNA(hTERT) ) 哺乳動物端粒酶哺乳動物端粒酶RNAs(hTRRNAs(hTR) )在許多組織的不同發(fā)育階段在許多組織的不同

14、發(fā)育階段, ,甚至那些沒有端粒酶活性的組織中廣泛表達。甚至那些沒有端粒酶活性的組織中廣泛表達。 體內(nèi)端粒酶體內(nèi)端粒酶RNARNA的存在對端粒酶功能至關重要，影響到的存在對端粒酶功能至關重要，影響到端粒酶端粒酶RNARNA的穩(wěn)定性與突變的穩(wěn)定性與突變, ,也可改變體內(nèi)端粒長度，并可通也可改變體內(nèi)端粒長度，并可通過改變端粒完整性或端粒結合因子的末端結合位點致細胞核過改變端粒完整性或端粒結合因子的末端結合位點致細胞核分裂后期細胞死亡分裂后期細胞死亡 。端粒酶端粒酶RNARNA轉錄模板轉錄模板 遠端區(qū)遠端區(qū): :參與和底物的結合。參與和底物的結合。 近端區(qū)近端區(qū): :能添加特定的核苷酸能添加特定的核苷

15、酸, ,對底物識別并不重要。對底物識別并不重要。 模板邊界區(qū)模板邊界區(qū): :與端粒酶催化亞基與端粒酶催化亞基TERTTERT結合結合, ,也與端粒酶相關也與端粒酶相關因子因子Est1pEst1p和和Ku Ku 結合。結合。Telomerase RNA The template region Main TERT-binding region Template boundary element(TBE) TRE, Template recognition element Low affinity TERT binding sites Annu.Rev.Biochem 2006, 75:493-51

16、72 2、端粒酶逆轉錄酶、端粒酶逆轉錄酶(Telomerase reverse (Telomerase reverse transcriptase,TERTtranscriptase,TERT) ) 幾乎所有存在端粒酶的機體均含有一單獨的幾乎所有存在端粒酶的機體均含有一單獨的TERT TERT 基因基因, , 哺乳動物哺乳動物TERT TERT 的轉錄由許多轉錄因的轉錄由許多轉錄因子、激素和細胞外信號嚴格控制子、激素和細胞外信號嚴格控制。不同的轉錄因不同的轉錄因子調(diào)節(jié)子調(diào)節(jié)hTERThTERT在不同的細胞內(nèi)含物中的表達。癌基在不同的細胞內(nèi)含物中的表達。癌基因因c-mycc-myc是一個受特殊信

17、號調(diào)節(jié)的可誘導癌基因是一個受特殊信號調(diào)節(jié)的可誘導癌基因, , 并可與并可與H HRasRas、N NRasRas、多瘤病毒多瘤病毒MTMT、LT LT 等癌基等癌基因協(xié)同作用因協(xié)同作用, , 促進細胞無限增殖促進細胞無限增殖, , 獲得永生化并獲得永生化并發(fā)生癌變。發(fā)生癌變。 人端粒酶逆轉錄酶人端粒酶逆轉錄酶 （human Telomerase Reverse Transcriptase (TERT),） TERT gene : 3396bp, protein: 1131 氨基酸殘基Crystal Structure of the Essential N-terminalof the telo

18、merase reverse transcriptase (TEN) C-terminal domain of TERTNature structureal & molecular biology 2006, 13: 218-225 c-mycc-myc 與與hTERThTERT Fujimoto Fujimoto等用等用c-mycc-myc 反義寡核甘酸轉染白血病反義寡核甘酸轉染白血病細胞細胞后后, , 這些細胞這些細胞中中端粒酶活性均能被下調(diào)端粒酶活性均能被下調(diào), , 而而c-c-mycmyc 正義寡核甘酸無此作用。正義寡核甘酸無此作用。 Wang Wang等研究發(fā)現(xiàn)等研究發(fā)現(xiàn)c-

19、mycc-myc在正常人乳腺上皮細胞和在正常人乳腺上皮細胞和二二倍體成纖維細胞中誘導端粒酶活性倍體成纖維細胞中誘導端粒酶活性, , 并能延長并能延長這些這些細胞細胞的壽命。因此認為的壽命。因此認為癌基因癌基因c-mycc-myc為一重要的端粒為一重要的端粒酶激活劑酶激活劑。 存在于存在于hTERThTERT核心啟動子中有兩個重要的核心啟動子中有兩個重要的c-mycc-myc 結合位點結合位點(CACGTG,(CACGTG,亦被稱為亦被稱為E E 盒盒) )。c-mycc-myc 誘導的誘導的hTERThTERT 表達起始速度快表達起始速度快, ,不受細胞增殖或額外的蛋白不受細胞增殖或額外的蛋白

20、合成的影響合成的影響, ,與與c-mycc-myc 引起的直接的轉錄激活一致。引起的直接的轉錄激活一致。但癌基因但癌基因c-mycc-myc 不是唯一與不是唯一與hTERThTERT基因調(diào)節(jié)有關的轉基因調(diào)節(jié)有關的轉錄因子。錄因子。 近期研究表明近期研究表明,Sp1 ,Sp1 協(xié)同協(xié)同c-mycc-myc 激活激活hTERThTERT的轉錄的轉錄, ,可能還有其他因子可能還有其他因子, ,如如Bcl-2 Bcl-2 抗凋亡基因、抗凋亡基因、E6HPV16 E6HPV16 型型蛋白蛋白，以及經(jīng)過以及經(jīng)過一些一些蛋白激酶的磷酸化使蛋白激酶的磷酸化使hTERThTERT 上調(diào)。上調(diào)。但在諸多不同類型的

21、瘤細胞中但在諸多不同類型的瘤細胞中, ,致致hTERThTERT上調(diào)的基本激活上調(diào)的基本激活劑是劑是c-mycc-myc。 TERTTERT內(nèi)的內(nèi)的N-N-殘基對多種功能是重要的殘基對多種功能是重要的, , 包括與端粒包括與端粒酶酶RNARNA結合、端粒酶結合、端粒酶RNA RNA 裝配和催化作用、與裝配和催化作用、與p53 p53 的相的相互作用和細胞永生化?；プ饔煤图毎郎?。 TERTTERT的的C-C-殘基也在人類原始纖維母細胞的永生化、殘基也在人類原始纖維母細胞的永生化、端粒組裝的競爭、核仁內(nèi)定位、引物結合和漸進性延長端粒組裝的競爭、核仁內(nèi)定位、引物結合和漸進性延長等方面起重要作用。

22、等方面起重要作用。 3、端粒酶相關蛋白、端粒酶相關蛋白(TEP) 端粒酶相關蛋白端粒酶相關蛋白-1(TEP1)-1(TEP1)是一多功能的是一多功能的RNA RNA 結合蛋白，結合蛋白，TEP1 TEP1 缺失導致缺失導致rRNArRNA 水平的顯著降低以及水平的顯著降低以及TEP1 TEP1 和和rRNArRNA 的丟失的丟失, ,但不導致端粒酶活性或端粒長度的紊亂。但不導致端粒酶活性或端粒長度的紊亂。 生存動力神經(jīng)細胞基因生存動力神經(jīng)細胞基因(SMN) (SMN) 產(chǎn)物產(chǎn)物熱休克蛋白（熱休克蛋白（hsphsp）90 90 、其他涉及到其他涉及到TERTTERT轉錄后修飾的轉錄后修飾的蛋白包

23、括磷酸酶蛋白包括磷酸酶-A-A、Akt Akt 、cAblcAbl 、p53 p53 和和PARPPARP。PinX1 PinX1 與人與人TERTTERT體外共表達時抑制人端粒酶活性。體外共表達時抑制人端粒酶活性。 芽殖酵母蛋白芽殖酵母蛋白Est1p Est1p 和和Est3p Est3p 這兩個蛋白與體內(nèi)端這兩個蛋白與體內(nèi)端粒酶的功能有關。粒酶的功能有關。Est1p Est1p 足以使端粒延長。但是足以使端粒延長。但是, ,在無在無Est1pEst1p存在的情況下存在的情況下Est2p-Cdc13pDBD融合也足以維持融合也足以維持端粒長度。端粒長度。人端粒酶人端粒酶RNA( human

24、Telomerase RNA (hTR or TERC). hTR : 451 nt, Telomerase is composed of both RNA and proteinTelomerase Telomerase is a specialized reverse transcriptase, contains both RNA and ProteinScience 1997, 276: 561-567端粒酶端粒酶RNA(hTRRNA(hTR) )端粒酶逆轉錄酶（端粒酶逆轉錄酶（TERTTERT）端粒酶結合蛋白（端粒酶結合蛋白（TEP）端粒酶端粒酶RNARNA是第一個被克隆的端粒酶是第

25、一個被克隆的端粒酶組分。組分。端粒酶端粒酶RNARNA含有與同源端粒含有與同源端粒DNADNA序列序列TTAGGGTTAGGG的互補序列的互補序列, ,核糖核酸酶核糖核酸酶H H切割此模板區(qū)切割此模板區(qū), ,能使體外消除端粒酶能使體外消除端粒酶延長端粒的功能。延長端粒的功能。人類人類TERTTERT（hTERThTERT）基因為一單拷貝基因）基因為一單拷貝基因, ,定位于定位于5p15. 33 ,5p15. 33 ,具有具有7 7個保守序列結構域單元和端粒酶特異性結構域單元個保守序列結構域單元和端粒酶特異性結構域單元T T。破壞破壞TERT TERT 將消除端粒酶活性并致端?？s短。將消除端粒酶

26、活性并致端粒縮短。TEP1TEP1、生存動力神經(jīng)細胞基因生存動力神經(jīng)細胞基因(SMN) (SMN) 產(chǎn)物產(chǎn)物、 hsp90hsp90 、 PinX1PinX1、 Est1p Est1p 和和Est3pEst3p THE END REPLICATION PROBLEM TELOMERASEIf cells dont have telomerase, what happens with telomeres after many cells divisions?端粒酶延長端粒端粒酶延長端粒DNA Inchworn modelTelomere T-loopTelomeres are packaged

27、into a unique structure - a T-loopGreen = Telomere-specific proteinsT-loop seenin the electronmicroscopeTelomeresStructural elements of a eukaryotic chromosome(5)(TxGy)n (3)(AxCy)nThe TxGy strand in telomeres folds back upon itself, forming G quadruplexes.Metal ion (K+) binding is required to form a

28、 stable structure.TelomeresStructural elements of a eukaryotic chromosome(5)(TxGy)n (3)(AxCy)nJ. Mol Biol. (2002), 320, 911-924TelomeresJ. Mol Biol. (2002), 320, 911-924 端粒酶活性的測定端粒酶活性的測定 端粒酶的特殊性使端粒酶端粒酶的特殊性使端粒酶活性的測定在研究中顯得尤為重要?；緶y定方法是活性的測定在研究中顯得尤為重要。基本測定方法是通過測定細胞提取物將端粒重復片段加到一個合成的通過測定細胞提取物將端粒重復片段加到一個合成

29、的寡聚脫氧核苷酸引物寡聚脫氧核苷酸引物33端的能力進行的。端的能力進行的。（1 1）TRAPTRAP法法模擬端粒結構設計單鏈模擬端粒結構設計單鏈DNADNA引物引物TSTS，端粒酶催化加上，端粒酶催化加上6 6核苷酸重復序列，然后用重復序列互補引物核苷酸重復序列，然后用重復序列互補引物CXCX對合成對合成產(chǎn)物產(chǎn)物PCRPCR擴增，電泳差擴增，電泳差6ntDNA6ntDNA條帶。早期方法，只能定條帶。早期方法，只能定性。性。（2 2）TRAP-TRAP-同位素圖譜同位素圖譜 上述反應體系加入上述反應體系加入32P32P標記標記ATPATP，32P-TS32P-TS引物，引物，PCRPCR擴增后電

30、泳，放射自顯影，掃描定量擴增后電泳，放射自顯影，掃描定量。（3 3）TRAP-TRAP-非同位素圖譜非同位素圖譜組織裂解液稀釋，組織裂解液稀釋，TRAPTRAP法分析，溴乙錠染色根據(jù)法分析，溴乙錠染色根據(jù)6bp6bp梯形條帶在梯形條帶在高低濃度出現(xiàn)，半定量分析。高低濃度出現(xiàn)，半定量分析。 （4 4）PCR-ELISAPCR-ELISA法法 按按TRAPTRAP法延伸引物，法延伸引物，PCRPCR擴增，與地高辛標記重復序列探針擴增，與地高辛標記重復序列探針雜交，雜交產(chǎn)物通過生物素標記引物固定于抗生物素包被微孔雜交，雜交產(chǎn)物通過生物素標記引物固定于抗生物素包被微孔板上，過氧化酶結合地高辛抗體檢測板

31、上，過氧化酶結合地高辛抗體檢測PCRPCR產(chǎn)物。產(chǎn)生有色產(chǎn)物，產(chǎn)物。產(chǎn)生有色產(chǎn)物，定量。定量。（5 5）PCR-PCR-熒光法熒光法 用熒光標記引物用熒光標記引物TSTS和和CXCX，進行，進行TRAPTRAP延伸、延伸、PCRPCR、電泳。熒光、電泳。熒光分析定量。進行分析定量。進行TRAPTRAP延伸、延伸、PCRPCR，擴增產(chǎn)物結合能選擇結合雙鏈，擴增產(chǎn)物結合能選擇結合雙鏈DNADNA的超敏熒光染料，測定電泳熒光強度，分析產(chǎn)生的超敏熒光染料，測定電泳熒光強度，分析產(chǎn)生DNADNA量與端量與端粒酶活性正比。半定量。粒酶活性正比。半定量。 端粒及端粒酶端粒及端粒酶 與衰老的關系與衰老的關系

32、端?？s短是觸發(fā)衰老的分子鐘。端?？s短是觸發(fā)衰老的分子鐘。 大多數(shù)正大多數(shù)正常體細胞中不能檢測到端粒酶的活性。端粒隨常體細胞中不能檢測到端粒酶的活性。端粒隨細胞分裂每次丟失細胞分裂每次丟失50-20050-200個堿基。個堿基。CookeCooke等認為，等認為，正常體細胞中端粒酶未被活化，導致端粒正常體細胞中端粒酶未被活化，導致端粒DNADNA縮縮短?？赡茏罱K制約細胞增殖能力。幾千個堿基短。可能最終制約細胞增殖能力。幾千個堿基的端粒的端粒DNADNA丟失后，細胞就停止分裂而衰老。最丟失后，細胞就停止分裂而衰老。最有力的證據(jù)是有力的證據(jù)是BodnarBodnar等的工作。將人端粒酶基等的工作。將

33、人端粒酶基因?qū)胝＜毎?，使端粒酶異常表達。端粒序因?qū)胝＜毎苟肆Ｃ府惓１磉_。端粒序列異常延長，細胞旺盛增殖，壽命大大延長。列異常延長，細胞旺盛增殖，壽命大大延長。 Telomere Length (humans)Number of Doublings2010Cellular (replicative) SenescenceNormal Somatic Cells(Telomerase Negative)Telomere also provide a means for counting cell division: telomeres shorten with each cycleTe

34、lomeres shorten from 10-15 kb(germ line) to 3-5 kb after 50-60 doublings(average lengths of TRFs)Cellular senescence is triggered whencells acquire one or a few critically short telomeres. 端?？s短可引發(fā)細胞老化的機制端?？s短可引發(fā)細胞老化的機制可能有可能有3種情況種情況 端粒端粒DNA的縮短釋放了端粒結合轉錄因子，的縮短釋放了端粒結合轉錄因子，該因子進而激活衰老誘導基因或滅活細胞該因子進而激活衰老誘導基因或

35、滅活細胞周期進行所必需的某些基因；周期進行所必需的某些基因； 誘導誘導DNA損傷的反應，導致細胞周期受損傷的反應，導致細胞周期受阻；阻； 端粒的縮短引起免疫功能下降，端粒的縮短引起免疫功能下降，Pommier” 早在早在1997年就觀察到，受年就觀察到，受HIV感染的高度免疫缺陷病人外周血單核細胞感染的高度免疫缺陷病人外周血單核細胞的端粒長度急劇縮短。的端粒長度急劇縮短。 大量的實驗數(shù)據(jù)證明，端粒、端粒酶與衰老之間存大量的實驗數(shù)據(jù)證明，端粒、端粒酶與衰老之間存在相關性。在相關性。在多數(shù)體細胞中，老年個體的端粒長度較年輕個體在多數(shù)體細胞中，老年個體的端粒長度較年輕個體短的多，某些細胞如短的多，某

36、些細胞如T、B淋巴細胞中的端粒酶活性淋巴細胞中的端粒酶活性隨年齡的增加而下降隨年齡的增加而下降 。年輕個體細胞中端粒酶活性隨年齡的增長而下降年輕個體細胞中端粒酶活性隨年齡的增長而下降 。 需要無限分裂能力的譜系細胞、干細胞的端粒長度需要無限分裂能力的譜系細胞、干細胞的端粒長度較長，且具有較高的端粒酶活性；而大多數(shù)具有有較長，且具有較高的端粒酶活性；而大多數(shù)具有有限增生能力的體細胞的端粒較短，不表達活性僅低限增生能力的體細胞的端粒較短，不表達活性僅低度表達端粒酶活性度表達端粒酶活性 。增生能力強的細胞及永生細胞表達端粒酶活性，即增生能力強的細胞及永生細胞表達端粒酶活性，即使同一組織的不同部分，其

37、分裂能力也與端粒酶的使同一組織的不同部分，其分裂能力也與端粒酶的活性呈正比?；钚猿收?。 端粒酶陰性的細胞在引入端粒酶后，可維持端粒的端粒酶陰性的細胞在引入端粒酶后，可維持端粒的長度，細胞增生能力加強，甚至細胞永生化長度，細胞增生能力加強，甚至細胞永生化 Telomere Length Declines035651,5003,0008,000Age (years)Telomere length in base pairs(human white blood cells)Telomerase activity is repressed in somatic cells of Telomerase

38、 activity is repressed in somatic cells of multicelluarmulticelluar organisms resulting in a gradual organisms resulting in a gradual shortening of the chromosome with each cell shortening of the chromosome with each cell generation. As this shortening reaches informational generation. As this short

39、ening reaches informational DNA, the cells senesce and die. DNA, the cells senesce and die. 細胞分裂細胞分裂端粒閾值端粒閾值 長 短細胞分裂次數(shù)與端粒長短呈正比細胞分裂次數(shù)與端粒長短呈正比細胞分裂細胞分裂端粒閾值端粒閾值端粒長短端粒長短端粒酶活端粒酶活 Harley (1989)端粒的重復片段為探針檢測端粒的重復片段為探針檢測 胎兒細胞株胎兒細胞株嬰兒細胞株嬰兒細胞株青年細胞株青年細胞株老年細胞株老年細胞株年齡年齡小 大端粒長度端粒長度早老性侏儒癥的端粒明顯較正常人短早老性侏儒癥的端粒明顯較正常人短“多

40、莉多莉”的衰老的衰老研究端粒（記時器）丟失的速率研究端粒（記時器）丟失的速率/ 年，預測人類的壽命年，預測人類的壽命 XX XY why?XX XY why?PCDPCD機制、癌細胞的無限繁殖機制、癌細胞的無限繁殖In most somatic tissues, telomerase is expressed at verylow levels or not at all - as cells divide, telomeres shortenTelomerase and SenescenceShort telomeres may be a signal for cells to senesc

41、e (stop dividing) 在早老患者中有一個過早的端?？s短，進而在早老患者中有一個過早的端?？s短，進而縮短的端粒允許染色體融合，這些現(xiàn)象與年老患縮短的端粒允許染色體融合，這些現(xiàn)象與年老患者的細胞中或培養(yǎng)的老化細胞中染色體組型衰老者的細胞中或培養(yǎng)的老化細胞中染色體組型衰老異常的高發(fā)生率密切相關。既然端粒酶活性表達異常的高發(fā)生率密切相關。既然端粒酶活性表達能穩(wěn)定端粒的長度，使端粒在細胞復制過程中不能穩(wěn)定端粒的長度，使端粒在細胞復制過程中不會丟失，細胞衰老的進程也能被阻止，從而壽命會丟失，細胞衰老的進程也能被阻止，從而壽命延長延長這正是人們研究的端粒酶與抗衰老關系這正是人們研究的端粒酶與抗

42、衰老關系的新熱點。的新熱點。 端粒酶延長端粒長度以減慢細胞衰老最早的證據(jù)端粒酶延長端粒長度以減慢細胞衰老最早的證據(jù)來自來自BodnarBodnar等的研究，等的研究，19981998年其在年其在ScienceScience上刊文報道：上刊文報道：將人的端粒酶基因?qū)攵肆Ｃ戈幮缘恼Ｈ梭w細胞中將人的端粒酶基因?qū)攵肆Ｃ戈幮缘恼Ｈ梭w細胞中激活其表達并培養(yǎng)細胞，然后與未導入該基因的細胞激活其表達并培養(yǎng)細胞，然后與未導入該基因的細胞比較，發(fā)現(xiàn)前者端粒明顯增長，細胞分裂旺盛，細胞比較，發(fā)現(xiàn)前者端粒明顯增長，細胞分裂旺盛，細胞壽命比后者大大延長，更令人關注的是細胞并無腫瘤壽命比后者大大延長，更令人關注的

43、是細胞并無腫瘤樣改變。樣改變。KudoKudo等報道端粒酶活性和細胞凋亡可作為伴等報道端粒酶活性和細胞凋亡可作為伴有或不伴有子宮內(nèi)發(fā)育延遲的胎盤衰老的標志有或不伴有子宮內(nèi)發(fā)育延遲的胎盤衰老的標志。 MattsonMattson等亦認為在研究神經(jīng)細胞分化和存活中等亦認為在研究神經(jīng)細胞分化和存活中激活端粒酶與激活端粒酶與TERTTERT功能，能較好地避免神經(jīng)細胞死功能，能較好地避免神經(jīng)細胞死亡，還可以促進神經(jīng)細胞在各種神經(jīng)元退化性病變亡，還可以促進神經(jīng)細胞在各種神經(jīng)元退化性病變條件下的恢復。條件下的恢復。 阿爾茨海默?。ò柎暮Ｄ。ˋlzheimers diseaseAlzheimers dis

44、ease，ADAD）是）是一種常見于老年人的神經(jīng)系統(tǒng)退化性疾病，其患者一種常見于老年人的神經(jīng)系統(tǒng)退化性疾病，其患者的腦血管壁中可分離出致的腦血管壁中可分離出致ADAD神經(jīng)元退行性病變的神經(jīng)元退行性病變的-淀粉樣蛋白。淀粉樣蛋白。 ZhuZhu等利用反義技術和端粒酶抑制劑引發(fā)胎鼠海等利用反義技術和端粒酶抑制劑引發(fā)胎鼠海馬區(qū)神經(jīng)細胞中馬區(qū)神經(jīng)細胞中TERTTERT的功能抑制，發(fā)現(xiàn)顯著增加了的功能抑制，發(fā)現(xiàn)顯著增加了由由-淀粉樣蛋白肽引起的細胞凋亡；淀粉樣蛋白肽引起的細胞凋亡； 嗜鉻細胞瘤細胞中嗜鉻細胞瘤細胞中TERTTERT的過量表達會降低此種的過量表達會降低此種細胞凋亡。細胞凋亡。 其原因是其原

45、因是TERTTERT功能降低的神經(jīng)細胞在暴露于功能降低的神經(jīng)細胞在暴露于-淀淀粉蛋白中能增強其氧化性并使線粒體功能發(fā)生障粉蛋白中能增強其氧化性并使線粒體功能發(fā)生障礙，因而引起細胞凋亡。礙，因而引起細胞凋亡。TERTTERT在神經(jīng)退行性病變在神經(jīng)退行性病變實驗模型中展現(xiàn)出有神經(jīng)保護性功能，提示在神實驗模型中展現(xiàn)出有神經(jīng)保護性功能，提示在神經(jīng)細胞中若能提高端粒酶的活性可能會抑制與衰經(jīng)細胞中若能提高端粒酶的活性可能會抑制與衰老相關的神經(jīng)退行性病變，如老相關的神經(jīng)退行性病變，如ADAD和腦老化的發(fā)生和腦老化的發(fā)生等。等。 端粒縮短加快可在許多病變中觀察到端?？s短加快可在許多病變中觀察到: :如如Dow

46、n Down 綜合征、綜合征、Werner Werner 綜合征、毛細管擴張失調(diào)綜合征、毛細管擴張失調(diào)癥癥 、先天性角化不良等、先天性角化不良等, ,雖然有些遺傳異常和端雖然有些遺傳異常和端粒缺陷的關系還不清楚粒缺陷的關系還不清楚, ,但可能的原因有但可能的原因有: : 端粒核酸外切酶活性和端粒核酸外切酶活性和( (或或) )有效利用的增加。有效利用的增加。端粒過度丟失。端粒過度丟失。在發(fā)育或出生后端粒補償機制的不足在發(fā)育或出生后端粒補償機制的不足( (端粒酶端粒酶或正性或正性ALTALT樣功能樣功能) )。 端?？s短加速可由于環(huán)境的應急介導的端?？s短加速可由于環(huán)境的應急介導的DNA DNA

47、損損害或?qū)@些損害敏感度增加所致。不管何種原因害或?qū)@些損害敏感度增加所致。不管何種原因, ,端?？s短速率增加可致增殖組織的早衰特征端?？s短速率增加可致增殖組織的早衰特征, ,但但也促進由于致瘤突變而獲得增殖活性提高的克隆也促進由于致瘤突變而獲得增殖活性提高的克隆過分生長。過分生長。 細胞的死亡過程分為兩個階段細胞的死亡過程分為兩個階段, , 當端?？s短至一關鍵性當端?？s短至一關鍵性長度長度2-4kb2-4kb時時, ,染色體的穩(wěn)定性就會遭到破壞染色體的穩(wěn)定性就會遭到破壞, ,細胞開始衰老細胞開始衰老進入進入M M1期（期（mortality stage1 M M1）。在）。在M1期細胞對生長

48、因子等期細胞對生長因子等失去反應，產(chǎn)生失去反應，產(chǎn)生DNA合成蛋白抑制因子，細胞周期檢查點合成蛋白抑制因子，細胞周期檢查點（cell cycle checkpoints）發(fā)送周期停止信號，）發(fā)送周期停止信號，DNA合成停止，合成停止，DNA DNA 斷裂斷裂, ,活化活化p53 p53 依賴或非依賴或非p53 p53 依賴的依賴的DNA DNA 損傷途徑。并損傷途徑。并誘導誘導CDKCDK抑制物如抑制物如p21 ,p27p21 ,p27產(chǎn)生產(chǎn)生, ,導致細胞導致細胞G1G1期生長停滯期生長停滯, ,最最終走向死亡。如果這一過程中一些癌基因終走向死亡。如果這一過程中一些癌基因SV40T抗原、抗原

49、、PRB ,PRB ,或或p53 ,p16 p53 ,p16 等抑癌基因失活等抑癌基因失活, ,喪失正常功能喪失正常功能, , 均能使均能使M1期的期的機制被抑制使細胞逃逸機制被抑制使細胞逃逸M1期，繼續(xù)生長獲得額外的增殖能力，期，繼續(xù)生長獲得額外的增殖能力，此時端粒酶仍為陰性，端粒繼續(xù)縮短，經(jīng)過此時端粒酶仍為陰性，端粒繼續(xù)縮短，經(jīng)過20-30次分裂后，次分裂后，最終到達最終到達M2期。細胞由于端粒過短期。細胞由于端粒過短, ,基因不穩(wěn)定基因不穩(wěn)定, ,絕大多數(shù)細絕大多數(shù)細胞死亡胞死亡, ,只有極少數(shù)細胞由于端粒酶活性的上調(diào)或重新激活只有極少數(shù)細胞由于端粒酶活性的上調(diào)或重新激活, ,端粒的功能

50、得到恢復端粒的功能得到恢復, ,基因重獲穩(wěn)定基因重獲穩(wěn)定, ,使細胞超越使細胞超越M M2期期, ,成為成為永生化細胞。永生化細胞。 端粒酶被抑制端粒酶被抑制 正常人體細胞正常人體細胞 端粒丟失端粒丟失 M1期阻滯期阻滯 SV40T抗原抗原 細胞分裂停止細胞分裂停止 Rb、P53與病毒蛋白結合、突變與病毒蛋白結合、突變 M1M2期間隔期間隔 永生化永生化 雙著絲粒形成雙著絲粒形成 M2期退化期退化 染色體失穩(wěn)染色體失穩(wěn) 端粒酶被激活端粒酶被激活 細胞凋亡細胞凋亡 端粒酶在人體細胞永生性轉化中端粒酶在人體細胞永生性轉化中端粒、端粒酶與腫瘤 端粒酶活化是腫瘤的顯著特征端粒酶活化是腫瘤的顯著特征 盡

51、管有研究認為端粒長度維持還可以借助于非盡管有研究認為端粒長度維持還可以借助于非端粒酶依賴模式，即端粒替代延長（端粒酶依賴模式，即端粒替代延長（altematirealtematire Lengthening of telomere ALTLengthening of telomere ALT）機制，但其存在）機制，但其存在上并不能否認永生化細胞中端粒酶的重要作用。自上并不能否認永生化細胞中端粒酶的重要作用。自從從19941994年年KimKim等創(chuàng)立等創(chuàng)立TRAPTRAP法檢測端粒酶活性以來，法檢測端粒酶活性以來，越來越多的文獻證明端粒酶活性在大多數(shù)人類原發(fā)越來越多的文獻證明端粒酶活性在大多數(shù)

52、人類原發(fā)性腫瘤標本及腫瘤衍生細胞系中可被檢測到。美國性腫瘤標本及腫瘤衍生細胞系中可被檢測到。美國學者在學者在400多例來源于多例來源于12 種不同組織的原發(fā)腫瘤病種不同組織的原發(fā)腫瘤病例中，腫瘤組織的端粒酶陽性率高達例中，腫瘤組織的端粒酶陽性率高達84.8，而腫，而腫瘤周圍組織或良性病變中陽性率僅為瘤周圍組織或良性病變中陽性率僅為4.4。 附表附表 人體組織中端粒酶活性人體組織中端粒酶活性 腫瘤部位/類型 與腫瘤鄰近正常組織/良性病變 腫瘤組織（%）肺3/68（4.4%）109/136（80.1%）乳腺2/28（7.1%）19/24（79.6%）前列腺1/18（5.6%）23/27（85.1%

53、）結腸0/45（0）22/23（95.6%）肝1/1（100%）卵巢0/8（0）7/7（100%）腎0/55（0）40/55（72.7%）神經(jīng)母細胞瘤 0/17（0）94/100（94%）血液（淋巴瘤，CLL ALL） 21/23（91.3%）腦6/8（75%）其它（頭頂部，Wilms瘤） 8/93（8.6%） 24/26 (92.3) 合計 14/332 （4.2%） 365/430 (84.8) ShayShay等報道了幾年不同學者對腫瘤端粒酶探討的等報道了幾年不同學者對腫瘤端粒酶探討的檢測結果，總結了正常組織（檢測結果，總結了正常組織（196196例），原位癌（例），原位癌（410410

54、例），惡性腫瘤（例），惡性腫瘤（20312031例）和癌旁組織（例）和癌旁組織（690690例）的例）的端粒酶的陽性率，它們分別是端粒酶的陽性率，它們分別是0.5%0.5%、30%30%、85%85%和和11%11%。在前列腺癌、乳腺、胰腺、肺、肝的早期癌中端粒酶在前列腺癌、乳腺、胰腺、肺、肝的早期癌中端粒酶的陽性率為的陽性率為85.0%85.0%95.0%95.0%，而對應的癌旁或良性病變，而對應的癌旁或良性病變組織中，端粒酶基本上不能檢出或活性極微弱。組織中，端粒酶基本上不能檢出或活性極微弱。SumidaSumida等的研究結果表明等的研究結果表明, ,端粒酶在各種腫瘤中的陽端粒酶在各種腫

55、瘤中的陽性率分別為性率分別為: :口腔鱗狀細胞癌口腔鱗狀細胞癌80 %80 %90%,90%,食道癌食道癌87%,87%,胃癌胃癌85%,85%,肺癌肺癌80.1%,80.1%,肝癌肝癌85%,85%,乳腺癌乳腺癌85%,85%,腎癌腎癌71%,71%,胰胰腺癌腺癌95%,95%,端粒酶陽性率與腫瘤發(fā)生之間表現(xiàn)出良好的端粒酶陽性率與腫瘤發(fā)生之間表現(xiàn)出良好的相關性。相關性。 Orlando 等對泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤進行了深入的等對泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤進行了深入的流行病學調(diào)查流行病學調(diào)查,結果發(fā)現(xiàn)腎癌組織中端粒酶陽性率結果發(fā)現(xiàn)腎癌組織中端粒酶陽性率為為69%(345/497),正常腎組織為正常腎組織為2%

56、(7/344);膀胱癌組膀胱癌組織中端粒酶陽性率為織中端粒酶陽性率為90%(342/381),正常組織為正常組織為27% (36/134);膀胱癌患者尿液中端粒酶陽性率為膀胱癌患者尿液中端粒酶陽性率為65%(436/675) ,膀胱灌洗液中端粒酶陽性率為膀胱灌洗液中端粒酶陽性率為72 %(131/182) ,而正常人為而正常人為9%(47/ 486);前列腺癌組織前列腺癌組織中端粒酶陽性率為中端粒酶陽性率為80%(266/332),鄰近組織為鄰近組織為38%(32/83) ,前列腺上皮瘤為前列腺上皮瘤為16%(4/25) ,良性前列良性前列腺肥大為腺肥大為8%(11/129) 。 85%90%

57、的人腫瘤細胞中可以檢測到端粒的人腫瘤細胞中可以檢測到端粒酶活性酶活性,而正常細胞中卻沒有或活性很低。人們推而正常細胞中卻沒有或活性很低。人們推測腫瘤細胞逃避衰老持續(xù)增殖是端粒酶激活或端測腫瘤細胞逃避衰老持續(xù)增殖是端粒酶激活或端粒維持機制改變的結果。粒維持機制改變的結果。 一般認為一般認為,端粒酶的激活是惡性腫瘤發(fā)生過程中端粒酶的激活是惡性腫瘤發(fā)生過程中的一個后期事件的一個后期事件,使腫瘤細胞的端粒不再進行性縮使腫瘤細胞的端粒不再進行性縮短而得以維持短而得以維持,避免了細胞正常的復制避免了細胞正常的復制-衰亡機制衰亡機制的制約而獲得永生性的制約而獲得永生性,這是惡性腫瘤細胞顯著的生這是惡性腫瘤細

58、胞顯著的生物學特征之一物學特征之一,是癌變機制中一個十分重要的環(huán)節(jié)是癌變機制中一個十分重要的環(huán)節(jié)。 對細胞端粒功能的觀察和推測的最顯著的特征對細胞端粒功能的觀察和推測的最顯著的特征是發(fā)生端粒長度的維持是發(fā)生端粒長度的維持,甚至在離開常規(guī)的激活時甚至在離開常規(guī)的激活時端粒長度維持機制端粒長度維持機制(TMM)的延長的延長,使初期細胞突破使初期細胞突破衰老屏障后癌變。發(fā)生的原因衰老屏障后癌變。發(fā)生的原因,最可能為過度的端最可能為過度的端粒酶激活在細胞癌變中端粒長度的保留或增加粒酶激活在細胞癌變中端粒長度的保留或增加,允允許在致瘤突變發(fā)生時異?？寺〉臄U展。許在致瘤突變發(fā)生時異?？寺〉臄U展。 一些端粒

59、酶陰性的癌癥通過一種或幾種一些端粒酶陰性的癌癥通過一種或幾種ALT途途經(jīng)維持端粒的長度。端粒酶或經(jīng)維持端粒的長度。端粒酶或ALT機制存在于絕大機制存在于絕大多數(shù)腫瘤細胞中以通過添加端粒重復序列而維持端多數(shù)腫瘤細胞中以通過添加端粒重復序列而維持端粒的長度。粒的長度。 在一些腫瘤中也觀察到一些端?？s短的現(xiàn)象，在一些腫瘤中也觀察到一些端?？s短的現(xiàn)象，可能的機制是由于細胞分裂的增加端?？s短，導致可能的機制是由于細胞分裂的增加端?？s短，導致異常修復事件使染色體發(fā)生端端融合。端端融合的異常修復事件使染色體發(fā)生端端融合。端端融合的后果是在隨后的細胞分裂過程中發(fā)生染色體斷裂后果是在隨后的細胞分裂過程中發(fā)生染色

60、體斷裂, ,進而導致遺傳不穩(wěn)定和腫瘤易感性。進而導致遺傳不穩(wěn)定和腫瘤易感性。 以端粒酶為靶標的抗癌藥物研究以端粒酶為靶標的抗癌藥物研究 在在85%85%以上的腫瘤細胞和組織中高度表達端粒酶，以上的腫瘤細胞和組織中高度表達端粒酶，因此端粒酶是一個較理想的抗腫瘤藥物靶標。因此端粒酶是一個較理想的抗腫瘤藥物靶標。(1)(1)使用端粒酶抑制劑后使用端粒酶抑制劑后, ,腫瘤細胞端?？s短直至足腫瘤細胞端粒縮短直至足以對增殖產(chǎn)生負面效應以對增殖產(chǎn)生負面效應, ,這種時間上的滯后與起始端這種時間上的滯后與起始端粒的長度有關；粒的長度有關；(2)(2)至少在理論上腫瘤細胞存在抗端粒酶抑制劑或不至少在理論上腫瘤細胞存在抗