抗氨芐青霉素的構(gòu)造及在大腸桿菌類的表達(dá)

1、抗氨芐青霉素的構(gòu)造及在大腸桿菌類的表達(dá)摘要：本實(shí)驗(yàn)利用 PCR技術(shù)在大腸桿菌中擴(kuò)增獲得了一段序列 ,并克隆至 p GEM-T -easy載體 ,獲得了重組質(zhì)粒。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳、序列測(cè)定及分析 ,重組質(zhì)粒的大小為4000 bp ,擴(kuò)增片段大小為950bp,當(dāng)重組質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)入大腸桿菌后，重組菌能在含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。關(guān)鍵詞;大腸桿菌 氨芐青霉素 PCR 1 材料和方法1.1試劑0.1mol/L CaCl溶液、LB液體培養(yǎng)基、氨芐青霉素、2.5 mmol/L dNTP混合物、Tap酶、引物對(duì)、LB固體培養(yǎng)基、大腸桿菌、PCR試劑盒、PCR試劑盒、PEGM-T-easy 載體系統(tǒng)、 D

2、NA Marker1.2器材超凈工作臺(tái)、恒溫?fù)u床、低溫離心機(jī)、恒溫水浴箱、瓊脂糖凝膠電泳系統(tǒng)、PCR熱循環(huán)儀、1. 3 PCR擴(kuò)增制PCR反應(yīng)體系（取 DNA 模板 1L ,上、下游引物各0.5L、dNTPs 2L、Taq 酶 0.5L ,加去離子水至 25L） ; PCR 循環(huán)參數(shù):94預(yù)變性1. 0min ,然后94 變性1. 0 min ,47 退火1. 0min ,72 延伸 1. 5 min 。共進(jìn)行 35個(gè)循環(huán) ,72 再延伸 10. 0 min ,4 保溫。取 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物 3L 瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳 ,觀察擴(kuò)增片段的大小。 1.4 PCR產(chǎn)物的回收將 PCR產(chǎn)物用苯酚2氯仿

3、混合物、氯仿各抽提 1次 ,無(wú)水乙醇沉淀 ,12 000 r/ min 離心 10 min ,棄上清 ,回收沉淀。1.5 基因重組將PCR 產(chǎn)物與 PGEM-T-easy載體系統(tǒng)以適宜比例混合 ,37 作用 3 h ,進(jìn)行純化，在連接體系14 水浴過(guò)夜。1.6 大腸桿菌感受態(tài)1.6.1從新活的大腸桿菌DH5菌板上挑取一單菌落，在LB培養(yǎng)基中37振蕩培養(yǎng)12h左右，對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)稀釋50-100倍振蕩擴(kuò)大培養(yǎng)，OD600,<0.5時(shí)停止培養(yǎng)。1.6.2 取培養(yǎng)液1.5ml轉(zhuǎn)入1.5 ml 離心管中冰上冷卻10-30min,4、40000r/min離心10min.1.6.3 倒盡上清液,用50

4、0（分三次200、 200、 100）ml氯化鈣（冷的0.1mol/l）懸浮細(xì)胞，4000r/min離心10min。1.6.4棄去上清液，加入100ul冷的0.1mol/LCaCl溶液，冰上放置片刻后，制成感受態(tài)細(xì)胞懸液1.7 細(xì)胞轉(zhuǎn)化1.7.1將制成感受態(tài)細(xì)胞及連接體系搖勻，冰上放置20-30min.1.7.2 于42水浴保溫90s.然后迅速冰上冷卻2min.立即向上述管分別加入0.8-0.9ml LB溶液培養(yǎng)基，使其體積到1ml。搖勻后37 震蕩培養(yǎng)45-60min.1.7.3取上步轉(zhuǎn)化細(xì)胞200l涂于LB固體培養(yǎng)基上37恒溫培養(yǎng)8-12h.1.8 質(zhì)粒DNA的提取挑取LB培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的單

5、菌落，經(jīng)2mlLB液體培養(yǎng)基（含相應(yīng)抗生素）37振蕩培養(yǎng)12h后，8000r/min離心2min.采用堿變性法提取質(zhì)粒DNA.（苯酚/氯仿/異戊醇1：1:1）400l預(yù)冷的70%乙醇洗滌2次，4離心(8000r/min、7min）棄上清，沉淀在室溫下晾干后再溶于20lTE中，37水浴30min,以降解RNA分子。1.9質(zhì)粒DNA水解及PCR擴(kuò)增分析將提取的質(zhì)粒取適量分別進(jìn)行47水浴過(guò)夜、PCR擴(kuò)增3 結(jié)果與分析3.1 PCR產(chǎn)物的鑒定由圖可知，再第6條泳帶上擴(kuò)增的大腸桿菌的基因片段為900bp，說(shuō)明擴(kuò)增成功。3.2 DNA重組大腸桿菌分析在含Amp的LB固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的為含為含PEGM-T-

6、easy質(zhì)粒的大腸桿菌菌落，并且此質(zhì)粒含有抗氨芐青霉素的基因。此平板涂布不均勻，單菌落較少，大部分成片生長(zhǎng)。3.3重組質(zhì)粒的PCR及酶解檢測(cè)質(zhì)粒經(jīng)過(guò)PCR擴(kuò)增及凝膠電泳分析，其分子量為950bp, 對(duì)各重組質(zhì)粒進(jìn)行酶切分析 ,酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析 ,在重組質(zhì)粒中均可獲得大小約為 750 bp 的片段 ,由質(zhì)粒電泳圖可看出在 Markker 2000下有亮帶，說(shuō)明質(zhì)粒提取成功，其分子量大約為4000.參考文獻(xiàn):【1】分子生物實(shí)驗(yàn)指導(dǎo) 魏瓊 高等教育出版社【2】大腸桿菌 F18菌毛 F亞單位基因的多樣性分析 成大榮 ,徐建生 中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào) 第27卷 第4期學(xué)號(hào)：091201221 分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)論文(