實(shí)驗(yàn)一凝膠過(guò)濾層析分離蛋白質(zhì)

1、精選課件1生物化學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)生物化學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)帶教帶教: 張學(xué)禮、戴薇薇張學(xué)禮、戴薇薇 龔張斌、黎志萍龔張斌、黎志萍精選課件2實(shí)驗(yàn)課要求實(shí)驗(yàn)課要求 試劑用后及時(shí)歸位試劑用后及時(shí)歸位 及時(shí)記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果及時(shí)記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果 按時(shí)完成實(shí)驗(yàn)報(bào)告按時(shí)完成實(shí)驗(yàn)報(bào)告 離開(kāi)時(shí)做好清潔工作離開(kāi)時(shí)做好清潔工作精選課件3實(shí)驗(yàn)報(bào)告的書(shū)寫(xiě)實(shí)驗(yàn)報(bào)告的書(shū)寫(xiě)標(biāo)題日期標(biāo)題日期一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康囊?、?shí)驗(yàn)?zāi)康亩?、?shí)驗(yàn)原理二、實(shí)驗(yàn)原理三、操作步驟三、操作步驟四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果五、分析討論五、分析討論精選課件4實(shí)驗(yàn)基本操作實(shí)驗(yàn)基本操作一、玻璃儀器的洗滌一、玻璃儀器的洗滌二、吸量管及微量取樣器的使用二、吸量管及微量取樣器的使用三

2、、溶液的混勻三、溶液的混勻四、離心機(jī)的使用四、離心機(jī)的使用精選課件5實(shí)驗(yàn)一實(shí)驗(yàn)一 凝膠過(guò)濾層析法分離蛋白質(zhì)凝膠過(guò)濾層析法分離蛋白質(zhì)1.掌握凝膠過(guò)濾層析法的基本原理；掌握凝膠過(guò)濾層析法的基本原理；2.掌握凝膠過(guò)濾層析法分離蛋白質(zhì)的過(guò)程。掌握凝膠過(guò)濾層析法分離蛋白質(zhì)的過(guò)程。一、一、 實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶?shí)驗(yàn)?zāi)康木x課件6二、二、 實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)原理1. 常用生化實(shí)驗(yàn)技術(shù)常用生化實(shí)驗(yàn)技術(shù) 分光光度技術(shù)分光光度技術(shù)電泳技術(shù)電泳技術(shù)離心技術(shù)離心技術(shù)層析技術(shù)層析技術(shù)精選課件72. 層析技術(shù)（色譜技術(shù)）層析技術(shù)（色譜技術(shù)） 是利用混合物中各組分的理化性質(zhì)差異（吸附是利用混合物中各組分的理化性質(zhì)差異（吸附力、溶解度、分子形

3、狀和大小、分子極性、分子親力、溶解度、分子形狀和大小、分子極性、分子親和力等）建立起來(lái)的技術(shù)。和力等）建立起來(lái)的技術(shù)。精選課件8（1）層析系統(tǒng)的基本組成）層析系統(tǒng)的基本組成 固定相固定相 + 流動(dòng)相流動(dòng)相固體物質(zhì)固體物質(zhì) / 固定于固體物質(zhì)的成分固定于固體物質(zhì)的成分可以流動(dòng)的物質(zhì)：可以流動(dòng)的物質(zhì)：如水和各種溶媒如水和各種溶媒精選課件9待分離混合物（待分離混合物（A、B）隨流動(dòng)相通過(guò)固定相）隨流動(dòng)相通過(guò)固定相 由于理化性質(zhì)差異，與兩相發(fā)生相互作用（吸附、由于理化性質(zhì)差異，與兩相發(fā)生相互作用（吸附、溶解、結(jié)合等）的能力不同，在兩相中的分配（含溶解、結(jié)合等）的能力不同，在兩相中的分配（含量對(duì)比）不同

4、量對(duì)比）不同與固定相相互作用力與固定相相互作用力越弱越弱的組分，隨流動(dòng)相移動(dòng)時(shí)的組分，隨流動(dòng)相移動(dòng)時(shí) 受到的阻滯作用受到的阻滯作用小小，移動(dòng)，移動(dòng)速度快速度快分步收集流出液，可得到樣品中所含的各單一分步收集流出液，可得到樣品中所含的各單一組分，從而達(dá)到將各組分組分，從而達(dá)到將各組分分離分離的目的的目的精選課件10（2 2）層析法的分類(lèi)）層析法的分類(lèi) 按兩相所處狀態(tài)分類(lèi)按兩相所處狀態(tài)分類(lèi) 流動(dòng)相流動(dòng)相液體液體氣體氣體固定相固定相液體液體液液液層析法液層析法氣氣液層析法液層析法固體固體液液 固層析法固層析法氣氣 固層析法固層析法精選課件11 按層析原理分類(lèi)按層析原理分類(lèi) 名稱(chēng)名稱(chēng)原理原理吸附層析法

5、吸附層析法 固定相為固體吸附劑，利用各組分在吸附固定相為固體吸附劑，利用各組分在吸附劑表面吸附能力不同而分離劑表面吸附能力不同而分離分配層析法分配層析法 各組分在流動(dòng)相和固相中的分配系數(shù)不同各組分在流動(dòng)相和固相中的分配系數(shù)不同離子交換層離子交換層析法析法固定相是離子交換劑，各組分與離子交換固定相是離子交換劑，各組分與離子交換劑親和力不同而分離劑親和力不同而分離親和層析法親和層析法 固定相只能與一種待分離組分專(zhuān)一結(jié)合，固定相只能與一種待分離組分專(zhuān)一結(jié)合，以此和無(wú)親和力的其它組分分離以此和無(wú)親和力的其它組分分離凝膠層析法凝膠層析法 固定相是多孔凝膠，各組分的分子大小不固定相是多孔凝膠，各組分的分子

6、大小不同，因而在凝膠上受阻滯的程度不同同，因而在凝膠上受阻滯的程度不同精選課件12 按操作形式不同分類(lèi)按操作形式不同分類(lèi) 名稱(chēng)名稱(chēng)操作形式操作形式柱層析法柱層析法固定相裝于層析柱內(nèi)，使樣品沿著一個(gè)方固定相裝于層析柱內(nèi)，使樣品沿著一個(gè)方向前移而達(dá)分離的層析法，包括一般柱層向前移而達(dá)分離的層析法，包括一般柱層析法、毛細(xì)管層析法和微粒填充柱層析法析法、毛細(xì)管層析法和微粒填充柱層析法平面層析法平面層析法層析過(guò)程在固定相構(gòu)成的平面層內(nèi)進(jìn)行的層析過(guò)程在固定相構(gòu)成的平面層內(nèi)進(jìn)行的層析法，包括紙層析法、薄層層析法和薄層析法，包括紙層析法、薄層層析法和薄膜層析法膜層析法精選課件13（3 3）層析技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)）層析

7、技術(shù)的優(yōu)點(diǎn) 分離效率高分離效率高 分析速度快分析速度快 具有極高的靈敏度具有極高的靈敏度 應(yīng)用范圍廣應(yīng)用范圍廣適用：適用： 雜質(zhì)多、含量少的復(fù)雜樣品分析，尤其適用于生雜質(zhì)多、含量少的復(fù)雜樣品分析，尤其適用于生物樣品的分離分析物樣品的分離分析精選課件143. 凝膠過(guò)濾層析法凝膠過(guò)濾層析法（gel filtration chromatography）（1 1）原理：）原理： 根據(jù)分子大小的差別進(jìn)行分離。每個(gè)凝膠顆根據(jù)分子大小的差別進(jìn)行分離。每個(gè)凝膠顆粒好象一個(gè)篩子，小分子物質(zhì)可以進(jìn)入顆粒內(nèi)部，粒好象一個(gè)篩子，小分子物質(zhì)可以進(jìn)入顆粒內(nèi)部，大分子物質(zhì)被排阻在外。大分子物質(zhì)被排阻在外。 又名分子篩過(guò)濾，

8、排阻層析又名分子篩過(guò)濾，排阻層析精選課件15精選課件16（2 2）凝膠的特點(diǎn)）凝膠的特點(diǎn) 屬于惰性載體，不帶電荷，吸附力弱，操作條屬于惰性載體，不帶電荷，吸附力弱，操作條件較溫和，可在相當(dāng)廣的溫度范圍內(nèi)進(jìn)行，不需要件較溫和，可在相當(dāng)廣的溫度范圍內(nèi)進(jìn)行，不需要有機(jī)溶劑，對(duì)于高分子物質(zhì)有很好的分離效果有機(jī)溶劑，對(duì)于高分子物質(zhì)有很好的分離效果。 交聯(lián)葡聚糖凝膠交聯(lián)葡聚糖凝膠 聚丙烯酰胺凝膠聚丙烯酰胺凝膠 瓊脂糖凝膠瓊脂糖凝膠精選課件17（3 3）凝膠的選擇）凝膠的選擇葡聚糖凝膠葡聚糖凝膠 (商品名商品名: Sephadex，Dextran) 型號(hào)型號(hào): G-10 G-200多孔網(wǎng)孔結(jié)構(gòu)多孔網(wǎng)孔結(jié)構(gòu)數(shù)

9、字愈小數(shù)字愈小,交聯(lián)度越大交聯(lián)度越大,被篩分物質(zhì)的分子量也愈小被篩分物質(zhì)的分子量也愈小吸水能力，每吸水能力，每g干膠吸水量的干膠吸水量的10倍倍精選課件18Sephadex G-50： 對(duì)多肽及蛋白質(zhì)的篩分范圍對(duì)多肽及蛋白質(zhì)的篩分范圍(分子量分子量)為為: 1500 30000Sephadex G-200： 對(duì)多肽及蛋白質(zhì)的篩分范圍對(duì)多肽及蛋白質(zhì)的篩分范圍(分子量分子量)為為: 5000 80000例：例：精選課件19B. 瓊脂糖凝膠瓊脂糖凝膠 ( 商品名商品名: Sepharose , Bio- gel A ) 對(duì)實(shí)驗(yàn)條件要求高對(duì)實(shí)驗(yàn)條件要求高 ( 溫度溫度, pH ) 40 4.5- 9.

10、0 工作的下限是葡聚糖凝膠工作的上限工作的下限是葡聚糖凝膠工作的上限, 用于大分子物質(zhì)的分離用于大分子物質(zhì)的分離精選課件20C. 聚丙烯酰胺凝膠聚丙烯酰胺凝膠 商品名商品名: Bio gel P（生物膠（生物膠P）精選課件21三、實(shí)驗(yàn)操作三、實(shí)驗(yàn)操作1. 柱的選擇柱的選擇 直徑：直徑： 15 cm 一般長(zhǎng)度：直徑一般長(zhǎng)度：直徑 = 10：1 20：1 本實(shí)驗(yàn)玻柱：本實(shí)驗(yàn)玻柱： 直徑直徑0.8 1.5cm 長(zhǎng)度長(zhǎng)度 17 20cm精選課件222. 凝膠選擇、制備凝膠選擇、制備 血紅蛋白血紅蛋白 溶菌酶溶菌酶 分離分離 （64500） （11400） 選擇選擇 Sephadex G-50Sepha

11、dex G-50： 對(duì)多肽及蛋白質(zhì)的篩分范圍對(duì)多肽及蛋白質(zhì)的篩分范圍(分子量分子量)為為: 1500 30000精選課件23制備：制備： 將干膠顆粒懸浮于將干膠顆粒懸浮于5 10倍的蒸餾水或洗脫液中倍的蒸餾水或洗脫液中充分溶脹，溶脹之后將極細(xì)的小顆粒傾瀉出去充分溶脹，溶脹之后將極細(xì)的小顆粒傾瀉出去精選課件243. 凝膠裝柱凝膠裝柱柱固定于架子上，柱固定于架子上，垂直放置垂直放置，關(guān)住出口，關(guān)住出口自頂部緩緩加入葡聚糖懸液，使自頂部緩緩加入葡聚糖懸液，使G-50 開(kāi)始下沉，開(kāi)始下沉， 至至1 2cm時(shí)，打開(kāi)出口時(shí)，打開(kāi)出口凝膠逐層上升，至頂部凝膠逐層上升，至頂部 2-3cm時(shí)，關(guān)閉出口時(shí)，關(guān)閉出

12、口精選課件25注意點(diǎn)：注意點(diǎn)： 垂直放置垂直放置 防止氣泡產(chǎn)生防止氣泡產(chǎn)生 防止柱的分層防止柱的分層精選課件264. 平衡平衡放置一段時(shí)間，約放置一段時(shí)間，約40分鐘（使凝膠更好的壓實(shí)）分鐘（使凝膠更好的壓實(shí)）注意：注意：防止床面干涸，可適當(dāng)補(bǔ)充蒸餾水防止床面干涸，可適當(dāng)補(bǔ)充蒸餾水精選課件275. 加樣加樣 加樣前打開(kāi)出口，使床面的蒸餾水流出，正好露加樣前打開(kāi)出口，使床面的蒸餾水流出，正好露 出床面時(shí)，立即關(guān)閉出口出床面時(shí)，立即關(guān)閉出口（將干未干）（將干未干） 用滴管將混合樣品用滴管將混合樣品(0.6ml，即血紅蛋白和溶菌酶，即血紅蛋白和溶菌酶 各各0.3ml)緩緩沿柱內(nèi)壁小心加于床表面緩緩沿

13、柱內(nèi)壁小心加于床表面 打開(kāi)出口，使樣品進(jìn)入床內(nèi)，直到床面重新露出打開(kāi)出口，使樣品進(jìn)入床內(nèi)，直到床面重新露出, 立即加入立即加入12倍于樣品體積的蒸餾水倍于樣品體積的蒸餾水精選課件286. 洗脫洗脫當(dāng)此少量蒸餾水接近流干時(shí)，反復(fù)多次加入蒸當(dāng)此少量蒸餾水接近流干時(shí)，反復(fù)多次加入蒸 餾水，進(jìn)行洗脫，直到兩帶分開(kāi)餾水，進(jìn)行洗脫，直到兩帶分開(kāi)檢查檢查Hb在層析床中色帶位置，待在層析床中色帶位置，待Hb洗脫完后，洗脫完后， 用試管分步收集洗脫液用試管分步收集洗脫液 10d/管，每管加管，每管加NaOH 2d，CuSO4 2d 檢查溶菌酶洗脫情況，若為紫色，則為（檢查溶菌酶洗脫情況，若為紫色，則為（+）精選課件29C C