2012cb g微生物藥物創(chuàng)新與優(yōu)產(chǎn)的人工合成體系

1、問題。2. 微生物優(yōu)質(zhì)底盤細(xì)胞的構(gòu)建原理微生物底盤細(xì)胞的設(shè)計是人工體系發(fā)揮作用的基礎(chǔ)。生命的本質(zhì)是由基因編碼的蛋白決定的，一個生物體的基因組序列攜帶了和維持其生命活動所需要的全部。從細(xì)胞功能必需性的角度可以將基因分為三類：1.維持細(xì)胞基礎(chǔ)代謝和執(zhí)行基本生命活動的必需基因；2.在特定生境下，克服某些環(huán)境壓力，強(qiáng)化生存的條件必需基因；3.非必需基因。鏈霉菌作為產(chǎn)生天然最大的類群，其線性結(jié)構(gòu)具有必需區(qū)和柔性可變區(qū)，是作為微生物底盤細(xì)胞的最佳選擇。為建立優(yōu)質(zhì)的微生物底盤，首先應(yīng)用比較基因組學(xué)底盤鏈霉菌的必需區(qū)和柔性可變區(qū)，從后者中進(jìn)行連續(xù)的大片段缺失，使染色體結(jié)構(gòu)更為；從前者中去除可能的次級代謝基因簇

2、以及平行轉(zhuǎn)移獲得的可移動，使簡化的底盤細(xì)胞進(jìn)行基本生命活動所需能量更小，生活周期更短。另外一方面，強(qiáng)化或加載一些天然的共同前體物基因，菌體生長性狀及抵抗發(fā)酵過程噬菌體污染的限制-修飾基因，使優(yōu)質(zhì)化底盤細(xì)胞獲得新的生命優(yōu)勢，實現(xiàn)底盤細(xì)胞的遺傳性和普適性，為微生物的高效提供平臺。3. 工程化設(shè)計生物體系的適配性機(jī)制在對微生物及調(diào)控機(jī)理理解的基礎(chǔ)上，應(yīng)用計算生物學(xué)構(gòu)建特定構(gòu)效的生物及途徑，經(jīng)熱力學(xué)評價和動力學(xué)模擬，為人工體系提供理論指導(dǎo)。以工程學(xué)的原理對途徑進(jìn)行設(shè)計，最終在底盤細(xì)胞上組裝生產(chǎn)線，需要解決途徑中各間、路徑與底盤之間的適配性這個科學(xué)問題。為探索適配性機(jī)制，可以在體外及體內(nèi)兩個層面上進(jìn)行。

3、在體外對途徑進(jìn)行檢驗和優(yōu)化可以絕緣胞內(nèi)其它因素的干擾，即根據(jù)的結(jié)構(gòu)特征，設(shè)計或構(gòu)建的新途徑應(yīng)該滿足反應(yīng)熱力學(xué)基本原理，再根據(jù)途徑中的各反應(yīng)類型，從功能庫中挑選適宜的進(jìn)行體外組合或裝配，模擬計算途徑的反應(yīng)進(jìn)程，檢測反應(yīng)物的流量變化，確定途徑中的節(jié)點(diǎn)，對其進(jìn)行設(shè)計和優(yōu)化，以及環(huán)境因子對人工途徑的影響。在體內(nèi)需要解決途徑與底盤細(xì)胞其它代謝途徑的適配性問題。在封閉的細(xì)胞內(nèi)，其適配性問題主要反映在物質(zhì)與能量的動態(tài)平衡，即結(jié)構(gòu)性物質(zhì)的流向和的傳遞?；诘妆P鏈霉菌基因組的，模擬人工途徑在代謝網(wǎng)絡(luò)中的運(yùn)行，檢驗代謝流，設(shè)計與重新組裝調(diào)控，調(diào)節(jié)人工途徑與底盤的適配程度是構(gòu)建人工生物體系進(jìn)行的必然過程。4. 人工

4、生物體系對環(huán)境的應(yīng)答機(jī)制在底盤細(xì)胞基礎(chǔ)上人為構(gòu)建途徑，必然會對整個調(diào)控網(wǎng)絡(luò)帶來影響，也反映在人工生物體系的生理指標(biāo)方面。因而實現(xiàn)的高產(chǎn)量、低成本生產(chǎn)，還取決于人工生物體系對外界環(huán)境的應(yīng)答機(jī)制，主要抗逆、與胞外的物質(zhì)交換和對特定激活信號的響應(yīng)。由于對復(fù)雜生命系統(tǒng)工作原理的了解還太多的盲區(qū)，因而在基因及基因組的組成與結(jié)構(gòu)水平上研究其抵御生物、物理和化學(xué)等因素破壞作用的機(jī)制；揭示重要物質(zhì)的跨膜機(jī)理；在調(diào)控網(wǎng)絡(luò)、細(xì)胞及細(xì)胞群的層面分析人工生物體系對胞外物理化學(xué)信號的響應(yīng)機(jī)制。這些都有助于我們深入認(rèn)識生命規(guī)律，所獲得的科學(xué)認(rèn)識還為我們在途徑、調(diào)控、代謝網(wǎng)絡(luò)的設(shè)計與組裝等方面提供理論支撐。（二） 主要研究

5、內(nèi)容1. （科學(xué)問題1）生物挖掘與人造功能器件的。微生物生物過程中前體（初級代謝），（次級代謝）和轉(zhuǎn)運(yùn)等步驟中涉及到的功能和調(diào)控進(jìn)行挖掘、定義以及在放線菌底盤生物（鏈霉菌FR-008）進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。著重于如聚酮類（紅霉素、菌素等）、C7N氨基環(huán)醇類（列波糖等）、-內(nèi)酰胺類（頭霉素、酸等）等途徑的挖掘，從深海環(huán)境和近海紅樹林環(huán)境中獲取上述生物的以及應(yīng)對復(fù)雜環(huán)境應(yīng)答的調(diào)控；對具有新型糖基化修飾功能和調(diào)控功能的生物進(jìn)行挖掘，并對其功能和適用范圍加以；利用蛋白納米纖維和蛋白骨架自組裝的有序特性和特殊的空間結(jié)構(gòu)，構(gòu)建功能化人工蛋白“腳手架”，實現(xiàn)對功能的逐級組裝和按設(shè)計比例組裝，使其發(fā)揮最大功能。2.（科

6、學(xué)問題 3）生物、路徑和網(wǎng)絡(luò)的模擬與設(shè)計。摸索出一套具有高模塊性和通用性的調(diào)控設(shè)計與構(gòu)建、代謝網(wǎng)絡(luò)功能控制模塊識別和設(shè)計方面的計算生物學(xué)和計算-實驗結(jié)合技術(shù)，構(gòu)建基于簡化氨基酸的隨機(jī)肽和功能酶庫；蛋白質(zhì)改造與設(shè)計，提出和發(fā)展具有構(gòu)象和環(huán)境依性的新型可極化分子力場以及與之相應(yīng)的可極化溶劑化模型，最終獲得一套嶄新的蛋白質(zhì)改造與設(shè)計的理論計算和計算程序;設(shè)計完成自動獲取代謝反應(yīng)轉(zhuǎn)換模式以及構(gòu)建基于代謝網(wǎng)絡(luò)的生物途徑設(shè)計相關(guān)的技術(shù)，構(gòu)建基于基因組規(guī)模代謝網(wǎng)絡(luò)的生物途徑設(shè)計化平臺;在放線菌底盤（鏈霉菌 FR008）中井岡霉素等微生物基因簇，研究放線菌底盤通過 SOS 反應(yīng)和毒素-抗毒素系統(tǒng)維持外源遺傳的

7、調(diào)控機(jī)制。3. （科學(xué)問題 1）催化體系優(yōu)化與人工組裝。面對人工體系的需求，開展酶催化模塊的理性設(shè)計、定向進(jìn)化及人工組裝工作。從不同結(jié)構(gòu)層次蛋白質(zhì)的模塊性，建立重要蛋白質(zhì)中與底物識別、熱性、催化效率等性質(zhì)相關(guān)的模塊集，并進(jìn)行功能域/結(jié)構(gòu)模塊的設(shè)計、替換與優(yōu)化，獲得高度模塊化的人工酶；在此基礎(chǔ)上應(yīng)用定向進(jìn)化技術(shù)對關(guān)鍵酶進(jìn)行性質(zhì)優(yōu)化；設(shè)計前體人工途徑，從生物庫中募集不同來源的催化，構(gòu)建體外多酶耦合體系，對催化進(jìn)行優(yōu)化組合，獲得反應(yīng)效率最大化的體外多酶耦合體系。4. （科學(xué)問題 2）微生物的放線菌底盤。選擇微生物中產(chǎn)天然最多、遺傳操作最為成熟的鏈霉菌為操作平臺，利用生物學(xué)與高通量實驗相結(jié)合，對鏈霉菌

8、 FR008 基因組進(jìn)行設(shè)計、改造，建立最簡（優(yōu)）化的放線菌底盤生物；并在此基礎(chǔ)上對其進(jìn)行硫化修飾，賦予其抗酶解等多種生命優(yōu)勢，為發(fā)酵過程中的噬菌體污染提供解決之道；建立不同硫化序列和豐度的資源庫，通過對硫化功能和調(diào)節(jié)的定向設(shè)計和改造，實現(xiàn)對硫化修飾的人工調(diào)控，進(jìn)一步優(yōu)化天然的硫化放線菌底盤，實現(xiàn)抗生素的高效。5.（科學(xué)問題 1 和 3）途徑與優(yōu)化。以聚酮類（紅霉素、菌素等）、C7N 氨基環(huán)醇類（列波糖等）、-內(nèi)酰胺類（頭霉素、酸等）等典型微生物為研究對象，充分利用其基因組生物研究基礎(chǔ)，通過計算生物計算化學(xué)系統(tǒng)揭示其生物中的限速步驟及其相關(guān)的前體、關(guān)鍵生物催化功能大分子（酶）的構(gòu)效，判定活性中

9、心結(jié)構(gòu)的分子基礎(chǔ)和物理化學(xué)特性,建立并利用相關(guān)的催化與調(diào)控的/模塊，在原產(chǎn)生菌或底盤鏈霉菌中實現(xiàn)代謝途徑的定向設(shè)計和優(yōu)化，建立上述典型微生物分子的生物學(xué)改造策略。6.（科學(xué)問題 4）新結(jié)構(gòu)代謝物的高效。在生物元/器件、網(wǎng)絡(luò)設(shè)計、酶催化體系、底盤細(xì)胞和途徑等不同生物學(xué)層面研究基礎(chǔ)上，以放線菌為研究對象，從以下四方面來構(gòu)建藥物結(jié)構(gòu)和調(diào)控的改造體系：聚酮后修飾模塊的替換與導(dǎo)入、生物模塊的人工改造、生物模塊的組裝及優(yōu)化和全局轉(zhuǎn)錄調(diào)控模塊作用機(jī)制，研究新結(jié)構(gòu)活性代謝產(chǎn)物途徑重構(gòu)的基本問題。在基因轉(zhuǎn)錄、蛋白質(zhì)表達(dá)、中間代謝物三個尺度對具有不同功能模塊組合的工程菌進(jìn)行分析，研究基因和細(xì)胞兩種不同尺度網(wǎng)絡(luò)之間

10、的相互作用和耦合，實現(xiàn)人工生物體系的多尺度優(yōu)化，最終實現(xiàn)新結(jié)構(gòu)代謝物的高效。二、預(yù)期目標(biāo)(一)總體目標(biāo)：以建立微生物品種創(chuàng)新和性能優(yōu)化的創(chuàng)新模式為目標(biāo)，揭示重要的高效生物與調(diào)控機(jī)理、優(yōu)質(zhì)底盤構(gòu)建原理、人工體系的適配機(jī)制及對環(huán)境的應(yīng)答機(jī)制，發(fā)展微生物生物學(xué)的理論和；構(gòu)建重要微生物的功能庫、底盤生物和人工生物體系，建立重要微生物品種創(chuàng)制和性能優(yōu)化的創(chuàng)新模式，建立微生物高效生物途徑，使我國的生物學(xué)研究整體水平進(jìn)入國際前沿，在新型抗生素、抗癌等創(chuàng)制和人工設(shè)計生物體系等基礎(chǔ)研究方面起到國際引領(lǐng)作用，某些方面凸顯我國的優(yōu)勢和特色。為提高我國人民健康水平，轉(zhuǎn)變增長模式作出積極的貢獻(xiàn)。（二）五年預(yù)期目標(biāo)：1.

11、闡明結(jié)構(gòu)和生物活性特征最具有代表性的抗生素及抗癌，如聚酮類（紅霉素、菌素等）、C7N氨基環(huán)醇類（列波糖等）、-內(nèi)酰胺類（頭霉素、酸等）等的及調(diào)控機(jī)理，建立相關(guān)結(jié)構(gòu)域/蛋白和調(diào)控的元件/模塊庫，完成生物途徑中關(guān)鍵模塊（起始單元、生物、后修飾、全局轉(zhuǎn)錄調(diào)控）的構(gòu)建。2.實現(xiàn)基因組水平上導(dǎo)向的生物途徑和代謝網(wǎng)絡(luò)設(shè)計；分析鏈霉菌功能底盤與引入的生物基因簇的互作，以設(shè)計外源遺傳的人工系統(tǒng)。3.發(fā)展蛋白質(zhì)模塊重組的新理論與新技術(shù)，搭建高通量定向進(jìn)化平臺，實現(xiàn)生物、模塊的設(shè)計和優(yōu)化；提供2-3個可以將多個功能進(jìn)行有序組裝以提高整體反應(yīng)效率的蛋白質(zhì)納米人造功能器件；構(gòu)建體外多酶耦合體系。4.完成小型基因組的設(shè)

12、計與刪減，建立最簡化鏈霉菌底盤；硫化鏈霉菌底盤細(xì)胞，獲得遺傳、抗噬菌體污染的人工體系，為天然產(chǎn)物的高效奠定基礎(chǔ)；5.建立新結(jié)構(gòu)微生物的生物途徑，建立人工體系多尺度優(yōu)化的基本策略，實現(xiàn)10種以上微生物的高效。6.在國內(nèi)外發(fā)表 200 篇以上，其中 SCI 收錄120 篇以上；申請或獲得國內(nèi)外發(fā)明專利 40 項以上。三、研究方案（一） 學(xué)術(shù)思路本項目面向我國產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整和國民健康水平提升的需求，擬選擇行業(yè)中市場價值大、最具代表性的微生物為研究對象，開展微生物相關(guān)天然生物的挖掘、標(biāo)準(zhǔn)化與最優(yōu)化，人工途徑設(shè)計，體外多酶體系耦合等一系列基礎(chǔ)工作；通過基因組最小化和引入特殊抗逆機(jī)制，構(gòu)建微生物的、具有知識

13、產(chǎn)權(quán)的鏈霉菌底盤生物；在前面基礎(chǔ)上，將構(gòu)建的分子人工體系與底盤細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行整合，建立重要微生物的高效途徑；通過對人工生的多尺度調(diào)控和優(yōu)化，實現(xiàn)微生物的高效生物制造，促進(jìn)我國生物及相關(guān)產(chǎn)業(yè)的升級和發(fā)展。這里，如果我們把在生物學(xué)層面上展開的微生物創(chuàng)制與優(yōu)產(chǎn)的工程化設(shè)計看作是在利用“拼圖技術(shù)”拼接模擬天然生物途徑所預(yù)設(shè)的一幅幅可能是候選化合物的“藍(lán)圖”的話，本項目的總體學(xué)術(shù)設(shè)計及“藍(lán)圖”思路可以簡略概括如下：本項目總體學(xué)術(shù)思路示意圖。（二）技術(shù)途徑綜合應(yīng)用多學(xué)科先進(jìn)技術(shù)，注重工程化及理性化的研究是生物學(xué)研究的精髓，因此本項目重視各個研究環(huán)節(jié)技術(shù)途徑的先進(jìn)性和協(xié)調(diào)性，以提高研究的高效性和準(zhǔn)確性。項目總體

14、技術(shù)途徑及具體實施方案如下：1、生物挖掘與人造功能器件的設(shè)計系列分子探深海環(huán)境以及近海紅樹林環(huán)境的微生物基因組和環(huán)境宏基因組文庫進(jìn)行優(yōu)選，通過序列分析和功能注釋深度挖掘海洋微生物中潛在的天然活性化合物生物基因，豐富生物制藥生物學(xué)研究所需的功能元件和調(diào)控庫；利用生物化學(xué)等建外反應(yīng)體系，對生物功能進(jìn)行分析、鑒定、以及標(biāo)準(zhǔn)化；通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)，在擬采用的微生物底盤生物鏈霉菌 FR-008 中測試上述生物的性能，并依據(jù)底盤生物基因表達(dá)調(diào)控特點(diǎn)對進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化；底盤生物鏈霉菌建立高效遺傳學(xué)，將功能在底盤生物中進(jìn)行高效替換和組裝；利用三級串聯(lián)四級桿液質(zhì)聯(lián)用儀和高分辨質(zhì)譜以及氣質(zhì)聯(lián)用質(zhì)譜對結(jié)果進(jìn)行快速定性定量檢測

15、。利用基因工程技術(shù)將功能加上接口，并與加有相應(yīng)接口的蛋白納米纖維和蛋白骨架等人造功能進(jìn)行共表達(dá)，利用蛋白純化技術(shù)得到其組裝單元，利用原子力顯微鏡和顯微鏡和對其裝配情況進(jìn)行觀察和表征，并在體外建立快速酶活測定對新復(fù)合體進(jìn)行檢測，最終實現(xiàn)多個功能的合理化組裝。2、生物、路徑和網(wǎng)絡(luò)的模擬與設(shè)計對基因組規(guī)模的微生物代謝網(wǎng)絡(luò)的相關(guān)先導(dǎo)化合物、代謝反應(yīng)、代謝酶、代謝途徑、以及相關(guān)的基因等數(shù)據(jù)進(jìn)行整合和數(shù)據(jù)挖掘，構(gòu)建基于基因組規(guī)模的生物途徑設(shè)計化平臺和，提取生物所需的各種生物學(xué)組件，如基因序列組件、酶序列組件、反應(yīng)模式組件等，設(shè)計反應(yīng)、代謝物、代謝途徑以及代謝酶。用代謝衡分析等模擬路徑、網(wǎng)絡(luò)的流分布狀況，發(fā)

16、現(xiàn)關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)和模塊，為生物學(xué)提供候選生物路徑和代謝網(wǎng)絡(luò)。發(fā)展新型可極化分子力場等計算，建立基于機(jī)器學(xué)習(xí)的 ProSAR 驅(qū)動的蛋白質(zhì)/酶定向進(jìn)化技術(shù)平臺和分子模擬技術(shù)，生的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)進(jìn)行理性改造與設(shè)計，通過改變生物（蛋白質(zhì)）本身以及它們之間相互作用的特異性和強(qiáng)度，合理地生物通路的流向、流速，進(jìn)而定向改造整個生的動力學(xué)行為和功能。以導(dǎo)向途徑設(shè)計策略，構(gòu)建鏈霉菌 FR008 基因組底盤的代謝調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，識別各種已知鏈霉菌應(yīng)急反應(yīng)的調(diào)控通路。構(gòu)建攜帶整合酶基因、att 位點(diǎn)、藥物基因簇和 phd-doc毒素-抗毒素基因座位的人工島，特異性鏈霉菌 FR008，模擬復(fù)雜系統(tǒng)中底盤對導(dǎo)入的調(diào)控機(jī)制。在多次傳代和

17、發(fā)酵過程，用 real-time qPCR 定量測定島的環(huán)出頻率，比較整合酶、SOS阻遏因子 LexA 和毒素-抗毒素等相關(guān)蛋白質(zhì)表達(dá)水平，建立底盤對外源的調(diào)控模型, 設(shè)計遺傳的人工系統(tǒng)。3、催化體系優(yōu)化與人工組裝應(yīng)用生物學(xué)尋找微生物中相關(guān)先導(dǎo)化合物及次級代謝產(chǎn)物中重要聚酮合酶（PKS）、非核糖體肽酶（NRPS）、纖維素酶、糖基轉(zhuǎn)移酶等分子內(nèi)部的模塊屬性，進(jìn)行基于關(guān)鍵基序（Key motif）指導(dǎo)下的模塊重組；建立不同酶的催化模型，依據(jù)底物特征與反應(yīng)環(huán)境的要求，定向設(shè)計構(gòu)建人工嵌合酶，完能上“躍遷式”進(jìn)化；或者同源模建蛋白質(zhì)生物的結(jié)構(gòu)，進(jìn)行分子對接、分子動力量子力學(xué)等方面的計算生物學(xué)研究，分析

18、蛋白-蛋白、酶-底物之間的相互作用，建立蛋白質(zhì)構(gòu)-效，指導(dǎo)生物功能的理性設(shè)計與改造，建立生物功能的理性設(shè)計策略。非理性設(shè)計建立的功能突變庫，建立基于流式細(xì)胞儀熒光激活細(xì)胞分選（FACS）、微流控、遺傳選擇系統(tǒng)的超高通量篩選技術(shù)，獲得性質(zhì)優(yōu)異的生物；體外構(gòu)建多酶耦合體系，分析程序催化中的節(jié)點(diǎn)和限速，對多酶耦合體系進(jìn)行優(yōu)化設(shè)計。4、微生物的放線菌底盤選擇優(yōu)選的特色菌株、多烯大環(huán)內(nèi)酯類抗生素殺念菌素產(chǎn)生菌灰色鏈霉菌FR-008作為底盤，通過種內(nèi)基因組比較、同源序列比對、功能基因組分析來鑒定維持鏈霉菌生命活動的必需基因以及條件必需基因，利用連續(xù)大片段染色體敲除基本生理代謝中的非必需基因獲得基因組最簡化

19、鏈霉菌；利親本結(jié)合在FR-008中導(dǎo)入抗生素前體物相關(guān)基因，在沒有冗余代謝途徑干擾的情實現(xiàn)天然高效；發(fā)展DNA硫化修飾功能和調(diào)節(jié)的催化機(jī)理，利用高效基因點(diǎn)突變以及高通量串聯(lián)四級桿液質(zhì)聯(lián)用儀檢測，定位硫化系統(tǒng)中決定靶標(biāo)序列、硫化豐度的功能和調(diào)控，采用理性設(shè)計的策略，從基因水平上對進(jìn)行定向改造獲得硫化資源庫，并在底盤FR-008中人工導(dǎo)入優(yōu)化設(shè)計后的硫化對鏈霉菌底盤FR-008的進(jìn)行可調(diào)控硫化修飾增強(qiáng)抗逆性，建立對天然優(yōu)質(zhì)化、遺傳的特色微生物底盤。5、途徑與優(yōu)化C7N 氨基環(huán)醇類、聚酮類、-內(nèi)酰胺類，根據(jù)子偏等原則構(gòu)建與調(diào)控的功能/模塊；通過各催化蛋白的超量表達(dá)，并利用大腸桿菌無細(xì)胞體系建外酶促系

20、統(tǒng)，或直接以產(chǎn)生菌建立靜息細(xì)胞體系，通過前體物的添加和喂養(yǎng)考察主要限制因子；以催化反應(yīng)為，通過小分子底物與生物催化分子（酶）的共價對接、蛋白分子對反應(yīng)途徑的調(diào)控模擬等手段，分析及后修飾過程的關(guān)鍵步驟，確定酶結(jié)構(gòu)改變策略和影響因素降低/消除策略；利用多位點(diǎn)定點(diǎn)突變技術(shù)，優(yōu)化酶的結(jié)構(gòu)及其催化功能；以工業(yè)高產(chǎn)菌為基礎(chǔ)，并根據(jù)催化反應(yīng)影響因素降低/消除策略，有效引入與前體物和輔因子供給、抗性提高、產(chǎn)物外運(yùn)、表達(dá)調(diào)控等相關(guān)的/模塊，同時將優(yōu)化基因替換原有拷貝，實現(xiàn)典型微生物的高產(chǎn)。6、新結(jié)構(gòu)代謝物的高效應(yīng)用發(fā)酵條件變換、啟動子置換和生物學(xué)等發(fā)現(xiàn)生物功能分子的單元的基因或基因簇，以及編碼蛋白。應(yīng)用途徑雜合

21、、基因敲除、模塊置換、定向進(jìn)化等使產(chǎn)生新的結(jié)構(gòu)代謝物，建立細(xì)胞水平的活性篩選平臺，發(fā)現(xiàn)活性先導(dǎo)化合物。將優(yōu)化的突變體基因拼接到生物基因簇中，將整個基因簇整合到宿主中，優(yōu)化關(guān)鍵功能模塊和模塊之間的耦合過程，實現(xiàn)新結(jié)構(gòu)代謝物定向、高效的生產(chǎn)。本項目充分考慮到了研究的系統(tǒng)性和環(huán)節(jié)，提出了合理的應(yīng)對方案，對均有較為充分的前期研究。已初步建立了重要微生物生物的菌種、化合物和基因資源庫以及功能分析技術(shù)平臺，形成了次級代謝過程對發(fā)酵環(huán)境的應(yīng)答等代謝調(diào)控技術(shù)體系，深入了鏈霉菌形態(tài)分化機(jī)制和次級代謝調(diào)控機(jī)制，建立了生物大分子結(jié)構(gòu)動態(tài)模擬、客體分子與受體結(jié)構(gòu)對接等計算機(jī)模擬技術(shù)支撐體系，為構(gòu)建高效微生物本項目匯集

22、了國內(nèi)相關(guān)領(lǐng)域的主要優(yōu)勢途徑奠定了良好基礎(chǔ)。，依托 6 個，5工作個部門開放條件。（三）創(chuàng)新點(diǎn)，具有承擔(dān)研究項目的先進(jìn)的研究設(shè)施和良1.微生物特有生物庫的建立微生物相關(guān)的生物種類的匱乏和缺乏標(biāo)準(zhǔn)化是人工體系構(gòu)建的限速步驟。將微生物生物過程最重要和最具有代表性的關(guān)鍵模塊（起始單元、生物、后修飾、全局轉(zhuǎn)錄調(diào)控）分別進(jìn)行挖掘、定義，進(jìn)而建立全面化、性能標(biāo)準(zhǔn)化的微生物生物庫。本項目組在已有我國特有的、豐富的微生物產(chǎn)生菌基礎(chǔ)上，將深入表征與代謝相關(guān)的催化及調(diào)控，使其標(biāo)準(zhǔn)化；還將對特殊生境豐富生物資源（深海放線菌資源及紅樹林放線菌菌株資源等）進(jìn)行研究，為微生物生物提供了大量的具有優(yōu)良性能的生物，為能建能全

23、面化、性能標(biāo)準(zhǔn)化的生物庫提供了重要保障。2.體外人工代謝途徑的構(gòu)建常規(guī)生物學(xué)研究僅強(qiáng)調(diào)在底盤生物體內(nèi)構(gòu)建代謝途徑，但由于基因網(wǎng)絡(luò)難以、不兼容、以及底盤生物自身噪音等不利影響，造成人工生物體系組裝的率低，而且在取得一定進(jìn)展后很難。本項目擬在體行多酶耦合體系的構(gòu)建。由于避開了細(xì)胞內(nèi)的復(fù)雜環(huán)境，體外多酶耦合體系可極大地降低體系復(fù)雜度，為合理量化的建內(nèi)多酶耦合體系提供量化的數(shù)據(jù)；同時由于體系相對簡單，也可成為微生物產(chǎn)物的一種新型方式。3.納米級人工生物器件及生物串聯(lián)綁定人工代謝通路效率不高的之一是各個功能在體系中分散度過大，造成中間產(chǎn)物的流失和濃度的稀釋而導(dǎo)致的。為這一限制，本項目擬應(yīng)用蛋白納米纖維和

24、顆粒包裝蛋白構(gòu)建新的通用型、納米尺度、串聯(lián)的“蛋白腳手架”，對人工途徑中的催化進(jìn)行有序“鉚定”，以降低酶及底物在反應(yīng)體系中的分散度，建立高效的催化系統(tǒng)。4.微生物生產(chǎn)用放線菌底盤生物的創(chuàng)建常規(guī)生物學(xué)研究常使用大腸桿菌、酵母、假單胞菌等通用宿主作為底盤細(xì)胞，但由于這些細(xì)胞自身生物活性的種類非常有限，尤其是缺乏一些的輔助生物組件，導(dǎo)致即使導(dǎo)入基因，也無法完成生物合成途徑得到最終產(chǎn)物。這種情況，本項目擬選擇目前微生物生產(chǎn)中應(yīng)用最廣泛的放線菌作為操作平臺，以我國篩選的特色鏈霉菌FR-008為研究對象進(jìn)行人工體系的組裝。該菌株本身具有生長快、產(chǎn)胞性能好、遺傳系統(tǒng)通用簡便、背景比較清楚等優(yōu)良特點(diǎn)。所構(gòu)建的

25、高產(chǎn)菌株可直接與目前的微生物生產(chǎn)工藝銜接，有利于研究成果迅速向應(yīng)用轉(zhuǎn)化。5.DNA硫修飾體系為底盤生物引入新型抗逆機(jī)制DNA硫修飾系統(tǒng)是我國科學(xué)家在微生物代謝領(lǐng)域的性發(fā)現(xiàn)，在微生物底盤生物中人工構(gòu)建“硫基”生命體系，有望賦予其天然生命所不具備的生命優(yōu)勢，為、抗逆生命體的創(chuàng)建奠定遺傳基礎(chǔ)。本項目擬在對鏈霉菌底盤進(jìn)行基因組最小化的基礎(chǔ)上整合DNA硫化修飾體系，建立代謝速率高、抗逆性好的通用性微生物生產(chǎn)底盤細(xì)胞。6.多層次、多尺度改造微生物生產(chǎn)菌株傳統(tǒng)微生物菌株改良技術(shù)主要通過敲除、過表達(dá)等遺傳操作技術(shù)對細(xì)胞代謝途徑進(jìn)行改造，以達(dá)到強(qiáng)化目標(biāo)途徑的目的，不僅效率較低，而且獲得的程度也很有限。本項目將在

26、充分理解微生物生物機(jī)理的基礎(chǔ)上，綜合利用優(yōu)化、功能器件集成、途徑設(shè)計、網(wǎng)絡(luò)重構(gòu)等不同層面對微生物生產(chǎn)體系進(jìn)行系統(tǒng)優(yōu)化，不僅可以提高微生物產(chǎn)量、降低生產(chǎn)成本、降低能耗及污染，并且還可以在現(xiàn)有基礎(chǔ)上高效新的，為微生物藥物生產(chǎn)菌株的生物學(xué)改造提供新的技術(shù)支撐體系。（四）課題設(shè)置本項目面對我國微生物技術(shù)創(chuàng)新的需求，集成多學(xué)科先進(jìn)技術(shù)，擬解決的四個關(guān)鍵科學(xué)問題和研究目標(biāo)共設(shè)置了6個研究課題：（1）生物元件挖掘與人造功能器件的；（2）生物、路徑和網(wǎng)絡(luò)的模擬與設(shè)計；（3）催化體系優(yōu)化與人工組裝；（4）微生物的放線菌底盤；（5）途徑與優(yōu)化；（6）新結(jié)構(gòu)代謝物的高效。課題一、生物挖掘與人造功能器件的1. 主要研

27、究內(nèi)容：生物是人工體系的基本，它主要分為功能和調(diào)控兩大類型。本課題將微生物生物過程最重要和最具有代表性的關(guān)鍵模塊（起始單元、生物、后修飾、全局轉(zhuǎn)錄調(diào)控）分別進(jìn)行挖掘、定義，并在放線菌底盤生物（鏈霉菌 FR-008）中進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，建立催化與調(diào)控庫和模塊庫；蛋白質(zhì)骨架系統(tǒng)的人工器件，實現(xiàn)有序的生物組裝體，為人工體系進(jìn)行微生物的高效提供工具基礎(chǔ)。（1）重要微生物功能庫聚酮類、C7N 氨基環(huán)醇類、-內(nèi)酰胺類等生物中參與起始單元、生物、后修飾、全局轉(zhuǎn)錄調(diào)控等步驟的催化和調(diào)控功能為對象，從前期積累的近岸紅樹林及深海熱液口等海洋環(huán)境特有的菌株庫和環(huán)境宏基因組文庫中挖掘的生物，建立微生物的、性狀豐富的催化庫；

28、篩選與生物工藝中溫度、酸堿調(diào)節(jié)及溶媒抽提等環(huán)節(jié)相適應(yīng)的特殊調(diào)控，如特殊 TCS 和 sigma 因子等，挖掘復(fù)雜環(huán)境應(yīng)答的調(diào)控，過改變環(huán)境因子實現(xiàn)代謝途徑的切換提供基因調(diào)控開關(guān)。一些重要萜類（如紫杉醇等）的未知生物途徑，從自然界尋找與其對應(yīng)的功能并確定該功能的特定催化功能，為人工體系提供具有新型催化活性的功能庫，以提高目前庫催化能力的全面性；生物生物過程中進(jìn)行修飾并賦予其新活性的功能為對象，糖基化、甲基化、鹵素化等后修飾功能進(jìn)行挖掘，以及對功能進(jìn)行鑒定，并對其進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，為人工體系提供具有拓展性的功能。在微生物底盤生物鏈霉菌 FR-008 中，對所收集的功能和調(diào)控進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，建立微生物的催化與

29、調(diào)控庫和模塊庫。（2）人造功能器件的建立基于蛋白納米纖維和蛋白骨架的功能“鉚定”體系，研究多酶體系中各個功能之間的相互作用，并在此基礎(chǔ)上優(yōu)化多酶體系反應(yīng)效率；通過對蛋白納米纖維和蛋白骨架等的研究，利用其自組裝的有序特性和特殊的空間結(jié)構(gòu)，構(gòu)建功能化人工蛋白“腳手架”，結(jié)合上述多酶體系，實現(xiàn)對其能的逐級組裝，比例組裝。根據(jù)不同酶體系的作用原理對不同多酶體系按照設(shè)計程序進(jìn)行組裝，使其發(fā)揮最大功能。通過人造功能器件發(fā)展多酶反應(yīng)體系逐級有序組裝和功能集成的模式，獲得功能完備的納米級生物反應(yīng)鏈。2研究目標(biāo)代表性微生物中的關(guān)鍵進(jìn)行挖掘，建立微生物的全面功能庫和調(diào)控庫；納米蛋白質(zhì)人造功能器件，發(fā)展多酶體系順序

30、組裝和功能集成技術(shù)，為人工生物體系與生物提供支撐。挖掘出 20 種以上具有優(yōu)良性狀（性高、適用性寬等）的調(diào)控和功能組合；發(fā)現(xiàn)并標(biāo)準(zhǔn)化 20 種以上具有全新催化功能的功能；對已有的調(diào)控和功能進(jìn)行和標(biāo)準(zhǔn)化，為課題五、六的人工體系提供材料上的支撐；利用糖基化等新型功能按照人工設(shè)計組裝出新型分子；利用人造功能器件對一種或多種多酶反應(yīng)體系進(jìn)行定向組裝和集成，使反應(yīng)效率和轉(zhuǎn)化效率有一個質(zhì)的提升；在 SCI 期刊上發(fā)表25 篇，申請國內(nèi)外專利 8-10 項，培養(yǎng)碩、博士研究生 24 名以上。3. 承擔(dān)：大學(xué)、南開大學(xué)、上海交通大學(xué)、科學(xué)院研究所4. 課題及主要學(xué)術(shù)骨干：劉天罡主要學(xué)術(shù)骨干：，冷艷5經(jīng)費(fèi)比例：

31、 17課題二、生物、路徑和網(wǎng)絡(luò)的模擬與設(shè)計1. 主要研究內(nèi)容：本課題應(yīng)用計算生物學(xué)理論和，開展高模塊性和通用性的調(diào)控設(shè)計與構(gòu)建、代謝網(wǎng)絡(luò)功能模塊識別和設(shè)計工作，發(fā)展相關(guān)的計算生物學(xué)，為人工體系的理性設(shè)計提供指導(dǎo)，為實驗科學(xué)奠定基礎(chǔ)。（1）生物和功能模塊設(shè)計與改造生物和功能模塊的挖掘與設(shè)計方面的研究，首先在對多種數(shù)據(jù)庫挖掘和相關(guān)文獻(xiàn)的收，探索更高效和準(zhǔn)確的數(shù)據(jù)挖掘技術(shù)，并構(gòu)建目標(biāo)酶的序列和結(jié)構(gòu)方面的庫，為構(gòu)建理論模型提供支持。其次在利用分子模擬技術(shù)，分析與目標(biāo)酶特性相對應(yīng)的功能的過程中，有性的提出和發(fā)展適合于目標(biāo)酶蛋白的、基于精確量子力學(xué)計算得到的、具有構(gòu)象和環(huán)境依性、并且計算速度可以滿足實際應(yīng)

32、用需求的新型可極化分子力場；同時，改進(jìn)已有的隱式溶劑化模型，使之與我們新發(fā)展的、更準(zhǔn)確的可極化分子力場相匹配，進(jìn)而能夠更加準(zhǔn)確地描述蛋白質(zhì)的溶劑化效應(yīng)；并結(jié)合不同的全局最優(yōu)搜索方案，利用大量實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行檢驗和優(yōu)化，最終實現(xiàn)和優(yōu)選出一套更為準(zhǔn)確的蛋白質(zhì)改造與設(shè)計理論計算。然后將模擬得到的生物與功能模塊整合到基礎(chǔ)模型中，從而得到在酶的催化活性、底物特異性、選擇性和熱性等方面更加突出的新型高效的目標(biāo)酶。再通過 mRNA 展示和 Microbead 展示技術(shù)平臺和利用 ProSAR 算法驅(qū)動的蛋白質(zhì)/酶定向進(jìn)化策略等實驗技術(shù)，篩選得到新型酶蛋白。最終構(gòu)建目標(biāo)酶功能網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)，從宏觀角度認(rèn)識和改造目標(biāo)酶的

33、各種功能。利用本項目提出的新理論計算，通過改變生物本身以及它們之間相互作用的特異性和強(qiáng)度，合理地生物通路的流向、流速，為達(dá)到我們定向改造整個生動力學(xué)行為和功能的目的提供新方案。（2）導(dǎo)向生物途徑設(shè)計建立基于鏈霉菌基因組規(guī)模代謝網(wǎng)絡(luò)的相關(guān)先導(dǎo)化合物、代謝反應(yīng)、代謝酶、代謝途徑等數(shù)據(jù)的整合和挖掘平臺；從海量數(shù)據(jù)中提取生物所需的各種組件，如結(jié)構(gòu)基因、調(diào)控因子、反應(yīng)模式組件等來設(shè)計反應(yīng)、代謝物、代謝途徑以及代謝酶；基于自動獲取的代謝反應(yīng)轉(zhuǎn)換模式，應(yīng)用逆向途徑來設(shè)計生物途徑。（3）底盤對外源遺傳的調(diào)控在簡化的鏈霉菌 FR008 基因組構(gòu)建生物功能底盤中,引入攜帶合成基因簇的人工島，通過定量分析 SOS

34、和毒素-抗毒素等與細(xì)菌應(yīng)急反應(yīng)相關(guān)的系統(tǒng)對島從環(huán)出頻率的影響，模擬復(fù)雜系統(tǒng)中“底盤”對上新導(dǎo)入模塊遺傳的調(diào)控機(jī)制。2研究目標(biāo)建立具有構(gòu)象和環(huán)境依性的可極化分子力場及溶劑化模型以改造與設(shè)計蛋白質(zhì)，搭建基于隨機(jī)肽庫的酶定向進(jìn)化高通量平臺；實現(xiàn)鏈霉菌基因組水平上導(dǎo)向的生物途徑和代謝網(wǎng)絡(luò)設(shè)計；闡明 SOS 和毒素-抗毒素系統(tǒng)等鏈霉菌應(yīng)急反應(yīng)系統(tǒng)與外源基因的互作機(jī)制，設(shè)計出生物遺傳的人工系統(tǒng)。建立在生物、網(wǎng)絡(luò)和系統(tǒng)三個不同層次的計算和實驗技術(shù)平臺，為課題四構(gòu)建放線菌底盤、課題成新結(jié)構(gòu)提供理論和計算支撐。發(fā)表SCI收錄25篇以上，其中影響因子大于5的5篇以上；培養(yǎng)碩、博士研究生20名以上。3. 承擔(dān)：華中

35、農(nóng)業(yè)大學(xué)、科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所、上海交通大學(xué)、大學(xué)4. 課題及主要學(xué)術(shù)骨干：雨主要學(xué)術(shù)骨干：,魏冬青,，5經(jīng)費(fèi)比例： 12課題三、催化體系優(yōu)化與人工組裝1. 主要研究內(nèi)容：酶蛋白質(zhì)組合形成的各種裝置和作用網(wǎng)絡(luò)是生物代謝功能的最終執(zhí)行者，但由于天然催化生物對非天然底物催化效率低、跨物種匹配性差等缺點(diǎn)，必須進(jìn)行人工重新設(shè)計和再進(jìn)化，以實現(xiàn)人工代謝通路的最優(yōu)化。因此，發(fā)展酶功能快速優(yōu)化的策略、對酶蛋白質(zhì)的模塊性進(jìn)行識別、拆分和重組，將提升獲得新功能酶的效率，有利于構(gòu)建高效人工體系；構(gòu)建體外多酶耦合體系可以避開底盤細(xì)胞內(nèi)復(fù)雜環(huán)境的影響，降低人工代謝通路組裝與功能測試的難度，極大地提高了人工代謝途徑

36、的設(shè)計效率，也為構(gòu)建體內(nèi)高效代謝通路提供了指導(dǎo)。本課題將以參與微生物代謝途徑中的關(guān)鍵酶為研究目標(biāo)，合成人工代謝系統(tǒng)的實際需求，設(shè)計高度模塊化的人工酶及體外多酶耦合體系，并發(fā)展蛋白質(zhì)改造與模塊組裝的新技術(shù)與新理論。（1）酶的理性設(shè)計和人工組裝以微生物生物過程中參與能量提供(纖維素酶系、半纖維素酶系等)、前體（脂肪酶、羥基化酶、腈水解酶、腈水合酶等）、結(jié)構(gòu)修飾（糖基轉(zhuǎn)移酶、?；?去酰化酶等）關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)酶為目標(biāo)，通過酶催化動力學(xué)研究和晶體結(jié)構(gòu)，揭示其催化和活性調(diào)控機(jī)理，從結(jié)構(gòu)域、二級結(jié)構(gòu)片段、motif 等層次解析蛋白質(zhì)模塊在底物識別、催化效率等方面的作用；在此基礎(chǔ)上，人工代謝系統(tǒng)的實際需求，進(jìn)行功能

37、域/結(jié)構(gòu)模塊的設(shè)計、改造與替換，獲得高度模塊化的人工酶；發(fā)展以關(guān)鍵基序為指導(dǎo)的模塊重組策略，低同源性蛋白質(zhì)模塊組裝率低的瓶頸，實現(xiàn)酶功能的躍遷式優(yōu)化，進(jìn)一步利用計算生物學(xué)與酶定向進(jìn)化等對人工酶的局部精細(xì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行優(yōu)化，獲得性質(zhì)優(yōu)良的人工酶催化。（2）生物催化的非理性設(shè)計為拓展蛋白質(zhì)序列空間，應(yīng)用非合理設(shè)計策略建立定向進(jìn)化突變庫，發(fā)展通用性超高通量篩選，從而大幅度降低酶定向進(jìn)化中篩選所需的時間及成本；建立局部序列的高質(zhì)量隨機(jī)突變庫，提高陽性突變體性質(zhì)的幅度；應(yīng)用蛋白質(zhì)進(jìn)化原理，對關(guān)鍵酶分子建立中性漂移突變庫，提高獲得陽性突變體的比例。從而實現(xiàn)酶功能的快速進(jìn)化，滿足優(yōu)化人工代謝系統(tǒng)的需求，并通過對突

38、變體進(jìn)行構(gòu)效，闡明關(guān)鍵位點(diǎn)、區(qū)域與功能之間的。（3）體外多酶耦合體系的構(gòu)建與優(yōu)化以重要為目標(biāo)，通過反應(yīng)途徑設(shè)計和熱力學(xué)計算，建立人工途徑的模式系統(tǒng)；從生物庫中募集不同來源的催化構(gòu)建體外多酶耦合體系，在比例、類型等方面進(jìn)行組合設(shè)計，打破物種的進(jìn)化屏障；建立快速有效的檢測及評價，對體系中的限速步驟和蛋白水平的調(diào)控因子進(jìn)行再設(shè)計和進(jìn)化，最終獲得反應(yīng)效率最大化的體外多酶耦合體系。2研究目標(biāo)發(fā)展體外多酶耦合體系設(shè)計的理論和技術(shù)，揭示微生物中重要酶序列、結(jié)構(gòu)及功能的相關(guān)性，發(fā)展蛋白質(zhì)理性設(shè)計的新，為人工生物體系提供技術(shù)和數(shù)據(jù)支撐；創(chuàng)建2條以上高效生產(chǎn)重要的體外多酶耦合體系，10種酶蛋白晶體結(jié)構(gòu)，建立2種以

39、上新型高通量篩選，獲得多種性質(zhì)顯著的突變酶，并通過模塊組裝設(shè)計出5種以上具有全新催化特征的人工酶。在SCI雜志上發(fā)表20篇以上高水平學(xué)術(shù)，申請專利10項以上，培養(yǎng)碩、博士研究生20名以上。3. 承擔(dān)：上海交通大學(xué)、理工大學(xué)、科學(xué)院研究所、吉林大學(xué)、華東理工大學(xué)4. 課題及主要學(xué)術(shù)骨干：主要學(xué)術(shù)骨干：生，萍，5. 經(jīng)費(fèi)比例： 20課題四、微生物1. 主要研究內(nèi)容：的放線菌底盤作為天然的主要來源菌，鏈霉菌的生長、代謝直接影響抗生素的產(chǎn)生和產(chǎn)量，其多樣性更是直接影響了后期的發(fā)酵工藝、流程以及效率。因此利用生物學(xué)構(gòu)建遺傳、高效和有應(yīng)用價值的通用鏈霉菌工廠至關(guān)重要，為此我們選擇我國優(yōu)選的遺傳背景清晰、操

40、作簡單、生長周期短的鏈霉菌 FR-008，并結(jié)合硫化修飾的生命優(yōu)勢展開研究。（1）鏈霉菌 FR-008 底盤細(xì)胞最小基因組的設(shè)計通過比較基因組功能基因組學(xué)分析不同種屬鏈霉菌基因組的共性和差異，建立必需基因和非必需基因文庫，確定能進(jìn)行基礎(chǔ)生理代謝和遺傳的鏈霉菌 FR-008 的最小功能基因組，對非必需基因庫進(jìn)行系統(tǒng)歸類，決定對非必需基因刪除的先后順序，為建立最簡化鏈霉菌 FR-008 底盤細(xì)胞奠定基礎(chǔ)。（2）構(gòu)建基因組最簡化底盤鏈霉菌用于高效天然基于最小功能基因組的，在不影響底盤生物正常生長的情形下，建立高效連續(xù)刪除片斷的新，得到最簡化的底盤鏈霉菌 FR-008；在此基礎(chǔ)上，人工裝載天然前體物供

41、應(yīng)及的關(guān)鍵基因，以及鏈霉菌發(fā)酵過程溶氧和決定外排直接相關(guān)的基因，實現(xiàn)利用底盤鏈霉菌對天然的高效合成。（3）人工硫化底盤鏈霉菌通過引入硫化限制-修飾基因，對底盤鏈霉菌 FR-008 進(jìn)行硫化來實現(xiàn)其抗酶解活性，結(jié)合 DNA 硫化修飾匹配的兩套限制系統(tǒng)，使其成為遺傳更加的底盤細(xì)胞，同時能夠抵抗大規(guī)模工業(yè)發(fā)酵過程的噬菌體污染。（4）優(yōu)化設(shè)計的硫化體系并應(yīng)用于底盤鏈霉菌次級代謝表觀調(diào)控利用高效基因點(diǎn)突變以及高通量硫化檢測技術(shù)，定位硫化系統(tǒng)中決定靶標(biāo)序列、硫化豐度的功能和調(diào)控。采用理性設(shè)計的策略，從基因水平上對元件進(jìn)行定向改造，建立資源庫，實現(xiàn)對硫化體系的序列、豐度的精確調(diào)控。考察基因組上不同豐度及不同

42、靶標(biāo)序列的硫化修飾對底盤鏈霉菌表觀遺傳的影響，篩選能夠提高菌株生長速度，產(chǎn)率并且能遺傳的硫基細(xì)胞。2. 研究目標(biāo)：完成具有知識產(chǎn)權(quán)的重要天然產(chǎn)生鏈霉菌 FR-008 最小基因組的設(shè)計，獲得最簡化鏈霉菌底盤，為天然的高效建立特色的工廠；通過硫化修飾獲得具有遺傳、抗噬菌體污染生命優(yōu)勢的鏈霉菌底盤，建立硫修飾功能和條件資源庫，實現(xiàn)對 FR-008 以及天然基因的可調(diào)控人工硫化，為天然提供理想底盤細(xì)胞并實現(xiàn)多樣化天然的最優(yōu)化。在 SCI 收錄發(fā)表研究25 篇以上；申請或獲得發(fā)明專利 8-10 項；培養(yǎng) 20 名左右研究生。3.承擔(dān)：大學(xué)，上海交通大學(xué)4.課題及主要學(xué)術(shù)骨干：榮 教授（大學(xué)）主要學(xué)術(shù)骨干

43、：，義，汪志軍，由5.經(jīng)費(fèi)比例：17課題五、途徑與優(yōu)化1. 主要研究內(nèi)容：依托微生物及其基因資源，發(fā)展生物學(xué)技術(shù)和策略，強(qiáng)化生物學(xué)理念，通過生物途徑的、設(shè)計與重構(gòu)，顯著提高途徑整體的表達(dá)水平、絕緣性和轉(zhuǎn)化效率，是有效提高重要微生物產(chǎn)量和質(zhì)量、實現(xiàn)節(jié)能降耗減排的重要。本課題以 C7N 氨基環(huán)醇類、聚酮類、-內(nèi)酰胺類典型微生物為研究對象，充分利用其基因組生物研究基礎(chǔ)，展開生物學(xué)研究，系統(tǒng)分析其生物中的限速步驟及其相關(guān)的前體、關(guān)鍵生物催化功能大分子（酶）的構(gòu)效，判定活性中心結(jié)構(gòu)的分子基礎(chǔ)和物理化學(xué)特性,進(jìn)行定向設(shè)計和改造，并指導(dǎo)若干微生物工業(yè)產(chǎn)生菌的遺傳育種和發(fā)酵工藝優(yōu)化。（1）C7N 環(huán)醇類途徑與

44、優(yōu)化井岡霉素等抗真菌抗生素和治療糖等數(shù)十種微生物，其衍生產(chǎn)物列波糖也是重要的良藥，而且其他多種衍生產(chǎn)物也是重要的糖苷水解酶抑制劑。C7N 環(huán)醇類的起始于 7-磷酸景天庚酮糖的環(huán)化，而且共享多步 C7N 結(jié)構(gòu)單元的步驟，成為研究和應(yīng)用生物學(xué)的良好材料。具體研究內(nèi)容建立井岡霉素和糖的體外酶促系統(tǒng)或靜息細(xì)胞體系，高效地考察其過程的主要限制因子；同時開展以生物多酶體系催化反應(yīng)為的量子力分子力學(xué)的描述以及計算機(jī)虛擬突變分析，并結(jié)合定點(diǎn)突變實驗技術(shù)，從酶催化和酶結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)變化層面進(jìn)行優(yōu)化；結(jié)合井岡霉素產(chǎn)生菌的全基因組，構(gòu)建以井岡霉素工業(yè)高產(chǎn)菌為基礎(chǔ)的特定底盤產(chǎn)生菌，實現(xiàn)井岡霉素的高產(chǎn)和工藝優(yōu)化，并通過糖生

45、物基因簇在井岡霉素高產(chǎn)菌株中的重構(gòu)實現(xiàn)糖的高產(chǎn)。（2）聚酮類途徑與優(yōu)化抗紅霉素、抗腫瘤菌素、抗真菌納他霉素、免疫抑制劑他克莫司等 I 型聚酮和阿克拉霉素等 II 型聚酮類種類繁多（多烯、聚醚、類、聚酮-多肽類、四環(huán)素類等），生物活性多樣（抗細(xì)菌、抗真菌、抗腫瘤、免疫抑制劑等），其聚酮鏈的生物由多功能多肽或多酶復(fù)合物催化形成，同時具有多種聚酮后修飾，這是生物活性和結(jié)構(gòu)多樣性的基礎(chǔ)。研究內(nèi)容：構(gòu)建聚酮合酶各結(jié)構(gòu)域或催化蛋白的功能和催化模塊，同時建立聚酮的體外酶促系統(tǒng)或靜息細(xì)胞體系，高效考察各功能和催化模塊的功能；通過計算生物分子生物學(xué)分析聚酮過程中的各個關(guān)鍵步驟，在計算機(jī)中重現(xiàn)聚酮中與碳鏈增長相關(guān)

46、的生物大分子（酶）幾何結(jié)構(gòu)和結(jié)構(gòu)變化的生物學(xué)分子基礎(chǔ)；分析聚酮各個后修飾反應(yīng)的特征，尋找影響催化效率的關(guān)鍵因子，結(jié)合定點(diǎn)突變實現(xiàn)重要酶的定向人工改造，優(yōu)化聚酮類的產(chǎn)生效率和優(yōu)化發(fā)酵工藝。（3）-內(nèi)酰胺類途徑與優(yōu)化由棒狀鏈霉菌產(chǎn)生的頭霉素和酸是重要的抗，本質(zhì)上講它們是結(jié)構(gòu)相對簡單的非核糖體肽類，其生物是由多結(jié)構(gòu)域組成的非核糖體肽合酶催化完成的，同時也具有多種多肽后修飾反應(yīng)。研究內(nèi)容：構(gòu)建肽合酶各結(jié)構(gòu)域或后修飾蛋白的功能和催化模塊，同時建立-內(nèi)酰胺類藥物的體外酶促系統(tǒng)或靜息細(xì)胞體系，高效考察各功能和催化模塊的功能；通過分析多肽過程中的關(guān)鍵步驟，分子水平深入揭示多肽生物合成中前體的生物化學(xué)活化的分子

47、機(jī)制；通過蛋白結(jié)構(gòu)模擬和分子對接，分析多肽各個后修飾反應(yīng)的特征，尋找催化效率和活化位點(diǎn)的作用因子，結(jié)合定點(diǎn)突變實驗實現(xiàn)酶的定向改造，優(yōu)化-內(nèi)酰胺類的生物和發(fā)酵工藝。（4）生物途徑的調(diào)控機(jī)制根據(jù)重要微生物生產(chǎn)菌的全基因組序列，利用 Microarray 技術(shù)和蛋白組學(xué)分析，結(jié)合生物學(xué)分析，發(fā)掘和鑒定影響生物途徑的主要調(diào)控；通過不同阻斷突變株遺傳互補(bǔ)來確定調(diào)控基因間的相互，分析各突變株基因表達(dá)強(qiáng)度、蛋白與 mRNA性，闡明這些調(diào)控的結(jié)構(gòu)與功能；通過 S1 核酸酶作圖分析或采用 EMSA、DNaseI footprinting 確定其調(diào)控的下游靶基因及順式作用，同時分析調(diào)控因子與靶基因啟動子結(jié)合情況

48、以及在微生物過程中的體內(nèi)結(jié)合強(qiáng)度變化，揭示這些調(diào)控因子對微生物次級代謝過程的調(diào)控機(jī)制。（5）與調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的模擬與重建次級代謝網(wǎng)絡(luò)的模擬和重構(gòu)分為靜態(tài)和動態(tài)兩個層次。靜態(tài)分析采用衡分析、代謝調(diào)節(jié)最小化等多種物質(zhì)流網(wǎng)絡(luò)分析，而動態(tài)分析采用廣義代謝流分析法模擬實際發(fā)酵過程。具體的生物計算將根據(jù)每個反應(yīng)的物質(zhì)和化學(xué)計量系數(shù)，列出所有代謝物的質(zhì)量守恒方程，形成常微分方程組。通過實驗測定部分物質(zhì)轉(zhuǎn)化流速度，定義另一些物質(zhì)轉(zhuǎn)化流的約束條件（如最大代謝能力等），解出平衡狀態(tài)下各種物質(zhì)相互轉(zhuǎn)化的狀態(tài)。在不同的理論假設(shè)下，通過線性規(guī)劃（如衡分析）或二次規(guī)劃（如代謝調(diào)節(jié)最小化分析）等不同的流網(wǎng)絡(luò)優(yōu)化，最優(yōu)化特定次級代

49、謝網(wǎng)絡(luò)的改造方案。通過比較模型與實際觀察，反復(fù)優(yōu)化理論代謝流模型，形成基于實驗理論計算模型關(guān)聯(lián)機(jī)制的合成與調(diào)控網(wǎng)絡(luò)逐步重構(gòu)流程，最終實現(xiàn)微生物生物途徑的工程化設(shè)計。2研究目標(biāo)通過計算生物學(xué)揭示井岡霉素、糖、紅霉素、菌素、阿克拉霉素、頭霉素和酸等微生物的限制因素；從計算生物計算化學(xué)角度深入揭示 C7N 環(huán)醇類、聚酮類、-內(nèi)酰胺類微生物的機(jī)理，指導(dǎo)蛋白結(jié)構(gòu)的定向改造和生物途徑的優(yōu)化；構(gòu)建以鏈霉菌底盤為基礎(chǔ)的井岡霉素工業(yè)高產(chǎn)菌株，實現(xiàn)井岡霉素的高產(chǎn)和工藝優(yōu)化。在SCI源雜志上發(fā)表30篇以上高水平學(xué)術(shù)，影響因子大于5的5篇以上；構(gòu)建15株高產(chǎn)工程菌，申請或獲得國內(nèi)外專利10項以上；培養(yǎng)并建立一支微生物

50、生物學(xué)研究隊伍，培養(yǎng)研究生15名，博士研究生15名。3. 承擔(dān)：上海交通大學(xué)、山東大學(xué)、大學(xué)、浙江大學(xué)4. 課題及主要學(xué)術(shù)骨干：泉主要學(xué)術(shù)骨干：，洪5. 經(jīng)費(fèi)比例： 17課題六、新結(jié)構(gòu)代謝物的高效1. 主要研究內(nèi)容本課題將組裝新的人工體系，并對其進(jìn)行優(yōu)化，為生物學(xué)在開發(fā)領(lǐng)域中的系統(tǒng)化研究建立基礎(chǔ)。對獲得的新的人工體系，通過其對環(huán)境應(yīng)答機(jī)理的研究，對表達(dá)新型結(jié)構(gòu)代謝物的生物體系進(jìn)行系統(tǒng)優(yōu)化并實現(xiàn)理性放大。（1）后修飾模塊的替換與導(dǎo)入后修飾基因?qū)τ诳股氐纳锘钚跃哂兄匾饬x。在抗生素中，多烯類化合物的后修飾過程獨(dú)具特色，因此，計劃以殺念菌素為多烯類化合物的代表，進(jìn)行如下研究：1) 組合不同來源于不同抗生素基因簇的糖基酶及糖基轉(zhuǎn)移酶基因?qū)胱陨硖腔D(zhuǎn)移酶缺失的殺念菌素產(chǎn)生菌中，獲得攜帶新型糖基的衍生殺念菌素；2) 將負(fù)責(zé)多烯抗生素羥基化/環(huán)氧化的P450氧化酶導(dǎo)入殺念菌素產(chǎn)生菌中，對殺念菌素的內(nèi)環(huán)羥基化/環(huán)氧化，以獲得溶解性優(yōu)化的殺念菌素衍生物；3) 將醛基生成P450單氧化酶導(dǎo)入脫羧殺念菌素產(chǎn)生菌中以獲得側(cè)鏈醛化殺念菌素衍生物；4) 將來源不同的起始酶導(dǎo)入殺念菌素自身起始基因缺失的突變株中，形成新型起始的殺念菌素衍生物。（2）生物模塊的人工改造從聚酮延伸單元數(shù)目的角度看，霉素不像其