蛋白質(zhì)的化學(xué)組成

1、 第五章第五章 蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)v蛋白質(zhì)的化學(xué)組成v氨基酸v蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)v蛋白質(zhì)的性質(zhì)v蛋白質(zhì)在加工貯藏中的變化v蛋白質(zhì)的測(cè)定5.1蛋白質(zhì)的化學(xué)組成v組成蛋白質(zhì)的元素主要有組成蛋白質(zhì)的元素主要有C、H、O、N、S和和P ， 有些蛋白質(zhì)還含有微量金屬元素有些蛋白質(zhì)還含有微量金屬元素Fe、Cu、Zn、Mn、Co、Mo，個(gè)別蛋白質(zhì)還，個(gè)別蛋白質(zhì)還含有含有I 。v存在自然界中的氨基酸有存在自然界中的氨基酸有300余種，但組成人余種，但組成人體蛋白質(zhì)的氨基酸僅有體蛋白質(zhì)的氨基酸僅有20種，且均屬種，且均屬 L-氨基氨基酸酸（甘氨酸除外）。（甘氨酸除外）。 5.2氨基酸 1.構(gòu)成蛋白質(zhì)的構(gòu)成蛋白質(zhì)的20種氨基

2、酸種氨基酸氨基酸的結(jié)構(gòu)通式氨基酸的結(jié)構(gòu)通式C+NH3COO-HR氨基酸的分類氨基酸的分類v I 脂肪類氨基酸 vII 芳香族氨基酸vIII 雜環(huán)族氨基酸2.氨基酸的重要理化性質(zhì)氨基酸的重要理化性質(zhì) 物理性質(zhì)物理性質(zhì) (1)(1)溶解度：溶解度：各種氨基酸在水中的溶解度差別很大，并能溶解于稀酸或稀堿中，但不能溶解于有機(jī)溶劑。通常酒精能把氨基酸從其溶液中沉淀析出。 (2) (2) 熔點(diǎn)：熔點(diǎn)：氨基酸的熔點(diǎn)極高，一般在200以上。 (3) (3) 旋光性：旋光性：除甘氨酸外其他氨基酸分子內(nèi)至少有1 個(gè)不對(duì)稱碳原子，因此具有旋光性 (4) (4) 味感：味感：氨基酸味感與立體構(gòu)型有關(guān)，D-氨基酸多帶甜

3、味，D-色氨酸甜味最強(qiáng) 氨基酸的化學(xué)性質(zhì)氨基酸的化學(xué)性質(zhì)氨基酸是兩性電解質(zhì)，其解離程度取決于所處溶液的酸堿度。（1）等電點(diǎn)等電點(diǎn)(isoelectric point, pI(isoelectric point, pI) ) 在某一pH的溶液中，氨基酸解離成陽(yáng)離子和陰離子的趨勢(shì)及程度相等，成為兼性離子，呈電中性。此時(shí)溶液的pH值稱為該氨基酸的等電點(diǎn)。pH=pI+OH-pHpI+H+OH-+H+pHpI氨基酸的兼性離子氨基酸的兼性離子 陽(yáng)離子陽(yáng)離子陰離子陰離子CHNH2COOHR CHNH2COOHRCHNH3+COO-R CHNH3+COO-RCHNH2COO-R CHNH2COO-RCH CO

4、OHRNH3+CH COOHRNH3+氨基酸的化學(xué)性質(zhì)氨基酸的化學(xué)性質(zhì)v（2）與金屬離子的整合作用v（3）脫氨基、羧基反應(yīng)v（4）褐變反應(yīng)v（5）茚三酮反應(yīng) 在氨基酸分析中具有特殊意義的反應(yīng) 茚三酮反應(yīng) 茚三酮在弱酸性溶液中與-氨基酸共熱，氨基酸被氧化成醛、CO2和NH3，最后茚三酮與反應(yīng)產(chǎn)物氨和還原茚三酮發(fā)生作用，生成藍(lán)紫色化合物。 兩個(gè)亞氨基酸脯氨酸和羥脯氨酸與茚三酮反應(yīng)形成黃色化合物。HNCOHO脯氨酸ProOH羥NH3CO2 RCHO+還原性茚三酮還原性茚三酮+(弱酸弱酸)加熱加熱3H20氨基酸與茚三酮反應(yīng)氨基酸與茚三酮反應(yīng)水合性茚三酮水合性茚三酮+ 2NH3 +水合性茚三酮水合性茚三

5、酮還原性茚三酮還原性茚三酮藍(lán)紫色化合物藍(lán)紫色化合物 5.3蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)包括蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)包括 一級(jí)結(jié)構(gòu)一級(jí)結(jié)構(gòu)(primary structure)(primary structure)二級(jí)結(jié)構(gòu)二級(jí)結(jié)構(gòu)(secondary structure)(secondary structure)三級(jí)結(jié)構(gòu)三級(jí)結(jié)構(gòu)(tertiary structure)(tertiary structure)四級(jí)結(jié)構(gòu)四級(jí)結(jié)構(gòu)(quaternary structure)(quaternary structure)一級(jí)結(jié)構(gòu) 二級(jí)結(jié)構(gòu) 三級(jí)結(jié)構(gòu) 四級(jí)結(jié)構(gòu)1. 定義 1969年，國(guó)際純化學(xué)與應(yīng)用化學(xué)委員會(huì)（IUP

6、AC） 規(guī)定：蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)指蛋白質(zhì)多肽連中氨基酸的排列順序，包括二硫鍵的位置。主要的化學(xué)鍵肽鍵，有些蛋白質(zhì)還包括二硫鍵一、蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)一、蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)2.一級(jí)結(jié)構(gòu)的意義一級(jí)結(jié)構(gòu)是蛋白質(zhì)空間構(gòu)象和特異生物學(xué)一級(jí)結(jié)構(gòu)是蛋白質(zhì)空間構(gòu)象和特異生物學(xué)功能的基礎(chǔ)。功能的基礎(chǔ)。目目 錄錄二、蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)二、蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)分子中某一段肽鏈的局部空間蛋白質(zhì)分子中某一段肽鏈的局部空間結(jié)構(gòu)，即該段肽鏈主鏈骨架原子的相對(duì)空結(jié)構(gòu)，即該段肽鏈主鏈骨架原子的相對(duì)空間位置，并不涉及氨基酸殘基側(cè)鏈的構(gòu)象間位置，并不涉及氨基酸殘基側(cè)鏈的構(gòu)象 。定義定義 主要的化學(xué)鍵主要的化學(xué)鍵： 氫鍵氫鍵 蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)

7、的主要形式蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的主要形式 - -螺旋螺旋 ( ( -helix ) -helix ) - -折疊折疊 ( ( -pleated sheet )-pleated sheet ) - -轉(zhuǎn)角轉(zhuǎn)角 ( ( -turn )-turn ) 無(wú)規(guī)卷曲無(wú)規(guī)卷曲 ( random coil )( random coil ) 多肽鏈中的各個(gè)肽平面圍繞同一軸旋轉(zhuǎn)，形成螺旋結(jié)構(gòu)，螺旋一周，沿軸上升的距離即螺距為0.54nm,含3.6個(gè)氨基酸殘基；兩個(gè)氨基酸之間的距離為0.15nm; 每個(gè)aa殘基沿軸旋轉(zhuǎn)100度. 肽鏈內(nèi)形成氫鍵，氫鍵的取向幾乎與軸平行，每個(gè)氨基酸殘基的C=O氧與其后第四個(gè)氨基酸殘基的N-

8、H氫形成氫鍵。 絕大多數(shù)天然蛋白質(zhì)中的-螺旋幾乎都是右手螺旋。 -螺旋都是由L-型氨基酸構(gòu)成的（Gly除外）。-螺旋及結(jié)構(gòu)特點(diǎn)1.1. - -螺旋螺旋螺距螺距0.54nm每殘基的每殘基的軸向高度軸向高度0.15nm每殘基繞軸每殘基繞軸旋轉(zhuǎn)旋轉(zhuǎn)100 o2. -折疊（折疊（ -折疊或 -折疊片也稱 -結(jié)構(gòu)或 -構(gòu)象，它是蛋白質(zhì)中第二種最常見(jiàn)的二級(jí)結(jié)構(gòu)。 -折疊是由兩條或多條幾乎完全伸展的多肽鏈平行排列，通過(guò)鏈間的氫鍵進(jìn)行交聯(lián)而形成的，或一條肽鏈內(nèi)的不同肽段間靠氫鍵而形成的。肽鏈的主鏈呈鋸齒狀折疊構(gòu)象 - -折疊折疊-折疊結(jié)構(gòu)幾乎所有肽鍵都參與鏈間氫鍵的形成，氫鍵與鏈的長(zhǎng)軸接近垂直。-折疊有兩種類

9、型： 一種為平行式，即所有肽鏈的N-端都在同一邊。 另一種為反平行式，即相鄰兩條肽鏈的方向相反 - -折疊的特點(diǎn)折疊的特點(diǎn)3. -轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)卷曲轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)卷曲 - -轉(zhuǎn)角轉(zhuǎn)角無(wú)規(guī)卷曲是用來(lái)闡述沒(méi)有確定規(guī)律性的那部無(wú)規(guī)卷曲是用來(lái)闡述沒(méi)有確定規(guī)律性的那部分肽鏈結(jié)構(gòu)。分肽鏈結(jié)構(gòu)。 細(xì)胞色素細(xì)胞色素C C的三級(jí)結(jié)構(gòu)的三級(jí)結(jié)構(gòu)無(wú)規(guī)則卷曲無(wú)規(guī)則卷曲）超二級(jí)結(jié)構(gòu)）超二級(jí)結(jié)構(gòu)在蛋白質(zhì)分子中，由若干相鄰的二級(jí)結(jié)構(gòu)單元組合在一起，彼此相互作用，形成有規(guī)則的、在空間上能辨認(rèn)的二級(jí)結(jié)構(gòu)組合體。幾種類型的超二級(jí)結(jié)構(gòu)： ；超二級(jí)結(jié)構(gòu)超二級(jí)結(jié)構(gòu)（在結(jié)構(gòu)層次上高于二（在結(jié)構(gòu)層次上高于二級(jí)結(jié)構(gòu)，但沒(méi)有聚集成級(jí)結(jié)構(gòu)，但沒(méi)有聚集成

10、具有功能的結(jié)構(gòu)域）具有功能的結(jié)構(gòu)域） 超二級(jí)結(jié)構(gòu)和結(jié)構(gòu)域超二級(jí)結(jié)構(gòu)和結(jié)構(gòu)域超二級(jí)結(jié)構(gòu)類型超二級(jí)結(jié)構(gòu)類型 X 纖維蛋白分子的結(jié)構(gòu)域纖維蛋白分子的結(jié)構(gòu)域 2）結(jié)構(gòu)域）結(jié)構(gòu)域大分子蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)?？煞指畛梢粋€(gè)或大分子蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)常可分割成一個(gè)或數(shù)個(gè)球狀或纖維狀的區(qū)域，折疊得較為緊密，各數(shù)個(gè)球狀或纖維狀的區(qū)域，折疊得較為緊密，各行使其功能，稱為結(jié)構(gòu)域行使其功能，稱為結(jié)構(gòu)域(domain)(domain) 。結(jié)構(gòu)域的概念有三種不同而又相互聯(lián)系的涵義:即獨(dú)立的結(jié)構(gòu)單位、獨(dú)立的功能單位和獨(dú)立的折疊單位。2）結(jié)構(gòu)域類型： -螺旋域； -折疊域； +域； /域；無(wú)規(guī)則卷曲+-回折域； 無(wú)規(guī)則卷曲+ -螺旋

11、結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)域1結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)域2 -折疊折疊 -轉(zhuǎn)角轉(zhuǎn)角二硫鍵二硫鍵 -螺旋螺旋卵溶菌酶的三級(jí)結(jié)構(gòu)中的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域卵溶菌酶的三級(jí)結(jié)構(gòu)中的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域三、蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)三、蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)疏水鍵、離子鍵、氫鍵和疏水鍵、離子鍵、氫鍵和 范德華力等。范德華力等。 主要的化學(xué)鍵主要的化學(xué)鍵整條肽鏈中全部氨基酸殘基的相對(duì)空間位置。整條肽鏈中全部氨基酸殘基的相對(duì)空間位置。即肽鏈中所有原子在三維空間的排布位置。即肽鏈中所有原子在三維空間的排布位置。（一）（一） 定義定義 維持蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)的作用力v氫鍵： x H yv疏水作用力：是指非極性基團(tuán)即疏水基團(tuán)為了避開(kāi)水相而群集在一起的集合力 v范德華力：在物質(zhì)的

12、聚集狀態(tài)中，分子與分子之間存在著一種較弱的作用力v離子鍵：它是由帶相反電荷的兩個(gè)基團(tuán)間的靜電吸引所形成的v二硫鍵 ：是兩個(gè)硫原子之間所形成的共價(jià)鍵目目 錄錄-折疊折疊-轉(zhuǎn)角轉(zhuǎn)角無(wú)規(guī)則卷無(wú)規(guī)則卷曲曲 空穴空穴-螺旋螺旋2、三級(jí)結(jié)構(gòu)的特征：含多種二級(jí)結(jié)構(gòu)單元；有明顯的折疊層次；是緊密的球狀或橢球狀實(shí)體；分子表面有一空穴(活性部位)；疏水側(cè)鏈埋藏在分子內(nèi)部，親水側(cè)鏈暴露在分子表面。實(shí)例：肌紅蛋白肌紅蛋白血紅素輔基 肌紅蛋白肌紅蛋白 (Mb) N 端端 C端端抹香鯨肌紅蛋白（Myoglobin）的三級(jí)結(jié)構(gòu) 四級(jí)結(jié)構(gòu)是指由兩 個(gè)或兩個(gè)以上具有三級(jí)結(jié)構(gòu)的多肽鏈按一定方式聚合而成的特定構(gòu)象的蛋白質(zhì)分子。其中

13、每條多肽鏈稱為亞基。 通常亞基只有一條多肽鏈，但有的亞基由兩條或多條多肽鏈組成，這些多肽鏈間多以二硫鍵相連亞基單獨(dú)存在時(shí)無(wú)生物學(xué)活性。 一般來(lái)說(shuō)具有四級(jí)結(jié)構(gòu)的蛋白屬于寡聚蛋白。1. 1.定義定義2.維持蛋白質(zhì)四級(jí)結(jié)構(gòu)的主要作用力 在蛋白質(zhì)四級(jí)結(jié)構(gòu)中，亞基之間的作用力主要包括：氫鍵、離子鍵、范德華力和疏水鍵。即亞基之間主要是通過(guò)次級(jí)鍵彼此締合在一起。 疏水鍵疏水鍵是最主要的作用力。血紅蛋白四級(jí)結(jié)構(gòu)血紅蛋白四級(jí)結(jié)構(gòu)血紅素血紅素輔基輔基化學(xué)鍵化學(xué)鍵共價(jià)鍵共價(jià)鍵次級(jí)鍵次級(jí)鍵肽鍵肽鍵二硫鍵二硫鍵氫鍵氫鍵疏水鍵疏水鍵鹽鍵鹽鍵范德華力范德華力一級(jí)結(jié)構(gòu)一級(jí)結(jié)構(gòu)二、三、四級(jí)結(jié)構(gòu)二、三、四級(jí)結(jié)構(gòu)三、四級(jí)結(jié)構(gòu)三、四

14、級(jí)結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)分子中的共價(jià)鍵與次級(jí)鍵蛋白質(zhì)分子中的共價(jià)鍵與次級(jí)鍵血紅蛋白血紅蛋白的四級(jí)結(jié)構(gòu)的四級(jí)結(jié)構(gòu) 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系第第 三三 節(jié)節(jié)一級(jí)結(jié)構(gòu)是空間構(gòu)象的基礎(chǔ)一級(jí)結(jié)構(gòu)是空間構(gòu)象的基礎(chǔ) 牛核糖核酸酶的牛核糖核酸酶的一級(jí)結(jié)構(gòu)一級(jí)結(jié)構(gòu)二二硫硫鍵鍵蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系 研究蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系主要是：研究多肽鏈中不同部位的殘基與生物功能的關(guān)系。 進(jìn)行這方面的研究常用的方法有：同源蛋白質(zhì)氨基酸順序相似性分析、氨基酸殘基的化學(xué)修飾及切割實(shí)驗(yàn)等。 2.2.蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的變異與分子病蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的變異與分子病 指蛋白質(zhì)分子中由于指蛋白質(zhì)分子中

15、由于AAAA排列順序與正常蛋排列順序與正常蛋白質(zhì)不同而發(fā)生的一種遺傳病白質(zhì)不同而發(fā)生的一種遺傳病( (基因突變?cè)斐傻幕蛲蛔冊(cè)斐傻? )。鐮刀形貧血?。虹牭缎呜氀。翰∫颍貉t蛋白病因：血紅蛋白AAAA順序的細(xì)微變化順序的細(xì)微變化 -鏈鏈N端氨基酸排列順序端氨基酸排列順序 1 2 3 4 5 6 7 8 Hb-A（正常人）（正常人） Val-His-Leu-Thr-Pro-Glu-Glu-Lys Hb-S（患（患 者）者） Val-His-Leu-Thr-Pro-Val-Glu-Lys鐮刀形貧血病：鐮刀形貧血?。翰∪梭w內(nèi)血紅蛋白的含量乃至紅細(xì)胞病人體內(nèi)血紅蛋白的含量乃至紅細(xì)胞的量都較正常人少，

16、且紅細(xì)胞的形狀為新月形，即鐮的量都較正常人少，且紅細(xì)胞的形狀為新月形，即鐮刀狀。此種細(xì)胞壁薄，而且脆性大，極易漲破而發(fā)生刀狀。此種細(xì)胞壁薄，而且脆性大，極易漲破而發(fā)生溶血；再者，發(fā)生鐮變的細(xì)胞粘滯加大，易栓塞血管；溶血；再者，發(fā)生鐮變的細(xì)胞粘滯加大，易栓塞血管；由于流速較慢，輸氧機(jī)能降低，使臟器官供血出現(xiàn)障由于流速較慢，輸氧機(jī)能降低，使臟器官供血出現(xiàn)障礙，從而引起頭昏、胸悶而導(dǎo)致死亡。礙，從而引起頭昏、胸悶而導(dǎo)致死亡。正常紅正常紅細(xì)胞細(xì)胞鐮刀形鐮刀形紅細(xì)胞紅細(xì)胞正常紅細(xì)胞與鐮刀形紅細(xì)胞的掃描電鏡圖 谷氨酸在生理谷氨酸在生理pHpH值值下為帶負(fù)電荷下為帶負(fù)電荷R R基氨基基氨基酸，而纈氨酸卻是一

17、酸，而纈氨酸卻是一種非極性種非極性R R基氨基酸，基氨基酸，就使得就使得HbSHbS分子表面的分子表面的荷電性發(fā)生改變，引荷電性發(fā)生改變，引起等電點(diǎn)改變，溶解起等電點(diǎn)改變，溶解度降低，使之不正常度降低，使之不正常地聚集成纖維狀血紅地聚集成纖維狀血紅蛋白，致使紅細(xì)胞變蛋白，致使紅細(xì)胞變形成鐮刀狀形成鐮刀狀, ,輸氧功能輸氧功能下降下降, ,細(xì)胞脆弱易溶血細(xì)胞脆弱易溶血. .鐮刀型貧血病（一）肌紅蛋白與血紅蛋白的結(jié)構(gòu)（一）肌紅蛋白與血紅蛋白的結(jié)構(gòu) 蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系 一、兩性解離性質(zhì)及等電點(diǎn)二、蛋白質(zhì)膠體性質(zhì)三、蛋白質(zhì)的沉淀四、蛋白質(zhì)的變性與復(fù)性五、蛋白質(zhì)的紫外吸

18、收特性六、蛋白質(zhì)呈色反應(yīng)第六節(jié)蛋白質(zhì)的重要性質(zhì)（一）蛋白質(zhì)的兩性電離（一）蛋白質(zhì)的兩性電離 蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)蛋白質(zhì)的理化性質(zhì) 蛋白質(zhì)分子除兩端的氨基和羧基可解離外，蛋白質(zhì)分子除兩端的氨基和羧基可解離外，氨基酸殘基側(cè)鏈中某些基團(tuán)，在一定的溶液氨基酸殘基側(cè)鏈中某些基團(tuán)，在一定的溶液pHpH條條件下都可解離成帶負(fù)電荷或正電荷的基團(tuán)。件下都可解離成帶負(fù)電荷或正電荷的基團(tuán)。 * * 蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)( isoelectric point, ( isoelectric point, pIpI) ) 當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)溶液處于某一當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)溶液處于某一pHpH時(shí)，蛋白質(zhì)解離成時(shí)，蛋白質(zhì)解離成正、負(fù)離子的趨勢(shì)

19、相等，即成為兼性離子，凈電正、負(fù)離子的趨勢(shì)相等，即成為兼性離子，凈電荷為零，此時(shí)溶液的荷為零，此時(shí)溶液的pHpH稱為稱為蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)。蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)。(二二)蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)蛋白質(zhì)屬于生物大分子之一，分子量可自1萬(wàn)至100之巨，其分子的直徑可達(dá)1100nm，為膠粒范圍之內(nèi)，由于蛋白質(zhì)的分子量很大它在水中能夠形成膠體溶液。蛋白質(zhì)溶液具有膠體溶液的典型性質(zhì)，如丁達(dá)現(xiàn)象、布郎運(yùn)動(dòng)等。 由于膠體溶液中的蛋白質(zhì)不能通過(guò)半透膜，因此可以應(yīng)用透析法將非蛋白小分子雜質(zhì)除去。 * 蛋白質(zhì)膠體穩(wěn)定的因素蛋白質(zhì)膠體穩(wěn)定的因素顆粒表面電荷顆粒表面電荷水化膜水化膜+帶正電荷的蛋白質(zhì)帶正電荷的蛋白質(zhì)帶負(fù)

20、電荷的蛋白質(zhì)帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)的蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)的蛋白質(zhì)水化膜水化膜+帶正電荷的蛋白質(zhì)帶正電荷的蛋白質(zhì)帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)不穩(wěn)定的蛋白質(zhì)顆粒不穩(wěn)定的蛋白質(zhì)顆粒酸酸堿堿酸酸堿堿酸酸堿堿脫水作用脫水作用脫水作用脫水作用脫水作用脫水作用溶液中蛋白質(zhì)的聚沉溶液中蛋白質(zhì)的聚沉蛋白質(zhì)膠體性質(zhì)的應(yīng)用蛋白質(zhì)膠體性質(zhì)的應(yīng)用 由于膠體溶液中的蛋白質(zhì)不能通過(guò)半透由于膠體溶液中的蛋白質(zhì)不能通過(guò)半透膜，因此可以應(yīng)用透析法將非蛋白的小分膜，因此可以應(yīng)用透析法將非蛋白的小分子雜質(zhì)除去。子雜質(zhì)除去。透析法：以半透膜提純蛋白質(zhì)的方法叫透透析法：以半透膜提純蛋白質(zhì)的方法叫透析法析法半透膜：只允許溶劑小分子通過(guò)，而

21、溶質(zhì)半透膜：只允許溶劑小分子通過(guò)，而溶質(zhì)大分子不能通過(guò)，如羊皮紙、火棉膠、玻大分子不能通過(guò)，如羊皮紙、火棉膠、玻璃紙等璃紙等（三）蛋白質(zhì)的變性、沉淀和凝固（三）蛋白質(zhì)的變性、沉淀和凝固 * * 蛋白質(zhì)的變性蛋白質(zhì)的變性(denaturation(denaturation) )蛋白質(zhì)的性質(zhì)與它們的結(jié)構(gòu)密切相關(guān)。某些物理或化學(xué)因素的作用下，能夠破壞蛋白質(zhì)的特定空間構(gòu)象，引起蛋也即有序的空間結(jié)構(gòu)變成無(wú)序的空間結(jié)構(gòu)，蛋白質(zhì)理化性質(zhì)改變并導(dǎo)致其生理活性喪失。這種現(xiàn)象稱為蛋白質(zhì)的變性. 造成變性的因素造成變性的因素如加熱、乙醇等有機(jī)溶劑、強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、如加熱、乙醇等有機(jī)溶劑、強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、重金屬離子及生物堿試

22、劑等重金屬離子及生物堿試劑等 。 變性的本質(zhì)變性的本質(zhì) 破壞非共價(jià)鍵和二硫鍵，不改變蛋白破壞非共價(jià)鍵和二硫鍵，不改變蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)。質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)。蛋白質(zhì)沉淀 蛋白質(zhì)在溶液中的穩(wěn)定性是有條件的、蛋白質(zhì)在溶液中的穩(wěn)定性是有條件的、相對(duì)的。如果加入適當(dāng)?shù)脑噭┦沟鞍踪|(zhì)分子相對(duì)的。如果加入適當(dāng)?shù)脑噭┦沟鞍踪|(zhì)分子處于處于等電點(diǎn)狀態(tài)等電點(diǎn)狀態(tài)或或失去水化層失去水化層（消除相同電消除相同電荷，除去水膜荷，除去水膜），），蛋白質(zhì)膠體溶液就不再穩(wěn)蛋白質(zhì)膠體溶液就不再穩(wěn)定并將產(chǎn)生沉淀。定并將產(chǎn)生沉淀。定義：定義：蛋白質(zhì)在溶液中靠水膜和電荷保持其蛋白質(zhì)在溶液中靠水膜和電荷保持其穩(wěn)定性，水膜和電荷一旦除去，蛋白質(zhì)溶液

23、穩(wěn)定性，水膜和電荷一旦除去，蛋白質(zhì)溶液的穩(wěn)定性就被破壞，蛋白質(zhì)就會(huì)從溶液中沉的穩(wěn)定性就被破壞，蛋白質(zhì)就會(huì)從溶液中沉淀下來(lái)，此現(xiàn)象即為淀下來(lái)，此現(xiàn)象即為蛋白質(zhì)的沉淀作用。蛋白質(zhì)的沉淀作用。n定義：定義：在在溫和條件下溫和條件下，通過(guò)改變?nèi)芤旱?，通過(guò)改變?nèi)芤旱膒HpH或電荷或電荷狀況，使蛋白質(zhì)從膠體溶液中沉狀況，使蛋白質(zhì)從膠體溶液中沉淀分離。淀分離。n 在沉淀過(guò)程中，在沉淀過(guò)程中，結(jié)構(gòu)和性質(zhì)都沒(méi)有發(fā)結(jié)構(gòu)和性質(zhì)都沒(méi)有發(fā)生變化生變化，在適當(dāng)?shù)臈l件下，可以重新溶解，在適當(dāng)?shù)臈l件下，可以重新溶解形成溶液，所以這種沉淀又稱為形成溶液，所以這種沉淀又稱為非變性沉非變性沉淀。淀。n 可逆沉淀是分離和純化蛋白質(zhì)的

24、基本可逆沉淀是分離和純化蛋白質(zhì)的基本方法，如方法，如等電點(diǎn)沉淀法、鹽析法和有機(jī)溶等電點(diǎn)沉淀法、鹽析法和有機(jī)溶劑沉淀法劑沉淀法等。等。n定義：定義：在強(qiáng)烈沉淀?xiàng)l件下，不僅破壞了蛋在強(qiáng)烈沉淀?xiàng)l件下，不僅破壞了蛋白質(zhì)膠體溶液的穩(wěn)定性，而且也白質(zhì)膠體溶液的穩(wěn)定性，而且也破壞了蛋白破壞了蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)質(zhì)的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，產(chǎn)生的蛋白質(zhì)沉淀不可能，產(chǎn)生的蛋白質(zhì)沉淀不可能再重新溶解于水。再重新溶解于水。n由于沉淀過(guò)程發(fā)生了蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)由于沉淀過(guò)程發(fā)生了蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)的變化，所以又稱為的變化，所以又稱為變性沉淀。變性沉淀。n如如加熱沉淀加熱沉淀（次級(jí)鍵）（次級(jí)鍵）、強(qiáng)酸堿沉淀、強(qiáng)酸堿沉淀（影（影響電荷

25、）響電荷）、重金屬鹽沉淀（、重金屬鹽沉淀（HgHg2+2+、 PbPb2+2+ 、CuCu2+2+、 AgAg2+2+）和生物堿試劑或某些酸類沉淀）和生物堿試劑或某些酸類沉淀等都屬于不可逆沉淀。等都屬于不可逆沉淀。鹽析 在蛋白質(zhì)的水溶液中，加入大量在蛋白質(zhì)的水溶液中，加入大量高濃度高濃度的強(qiáng)電解的強(qiáng)電解質(zhì)鹽質(zhì)鹽如硫酸銨、氯化鈉、硫酸鈉等，可破壞蛋質(zhì)分如硫酸銨、氯化鈉、硫酸鈉等，可破壞蛋質(zhì)分子表面的水化層，中和它們的電荷，因而使蛋白質(zhì)子表面的水化層，中和它們的電荷，因而使蛋白質(zhì)沉淀析出，這種現(xiàn)象稱為沉淀析出，這種現(xiàn)象稱為鹽析鹽析。 而而低濃度低濃度的鹽溶液加入蛋白質(zhì)溶液中，會(huì)導(dǎo)致蛋的鹽溶液加入蛋

26、白質(zhì)溶液中，會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)的溶解度增加，該現(xiàn)象稱為白質(zhì)的溶解度增加，該現(xiàn)象稱為鹽溶鹽溶。鹽析的機(jī)理鹽析的機(jī)理： 破壞蛋白質(zhì)的水化膜，中和表面的凈電荷破壞蛋白質(zhì)的水化膜，中和表面的凈電荷。鹽析法是最常用的蛋白質(zhì)沉淀方法，該方法不會(huì)使鹽析法是最常用的蛋白質(zhì)沉淀方法，該方法不會(huì)使蛋白質(zhì)產(chǎn)生變性。蛋白質(zhì)產(chǎn)生變性。 各種蛋白質(zhì)的親水性及荷電性均有差別，因此不各種蛋白質(zhì)的親水性及荷電性均有差別，因此不同蛋白質(zhì)所需中性鹽濃度也有不同，只要調(diào)節(jié)中性同蛋白質(zhì)所需中性鹽濃度也有不同，只要調(diào)節(jié)中性鹽濃度，就可使混合蛋白質(zhì)溶液中的幾種蛋白質(zhì)分鹽濃度，就可使混合蛋白質(zhì)溶液中的幾種蛋白質(zhì)分散沉淀析出，這種方法稱為散沉淀析出

27、，這種方法稱為分段鹽析分段鹽析。弱酸或弱堿沉淀法(等電點(diǎn)沉淀） 用弱酸或弱堿調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)溶液的用弱酸或弱堿調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)溶液的pHpH處于處于等電點(diǎn)處等電點(diǎn)處，使蛋白質(zhì)沉淀。，使蛋白質(zhì)沉淀。弱酸或弱堿沉淀法機(jī)理：弱酸或弱堿沉淀法機(jī)理：破壞蛋白質(zhì)表面凈電荷破壞蛋白質(zhì)表面凈電荷。 有機(jī)溶劑沉淀法： 在蛋白質(zhì)溶液中，加入能與水互溶的在蛋白質(zhì)溶液中，加入能與水互溶的有機(jī)溶劑如乙醇、丙酮等，蛋白質(zhì)產(chǎn)生有機(jī)溶劑如乙醇、丙酮等，蛋白質(zhì)產(chǎn)生沉淀。沉淀。有機(jī)溶劑沉淀法的機(jī)理有機(jī)溶劑沉淀法的機(jī)理： 破壞蛋白質(zhì)的水化膜破壞蛋白質(zhì)的水化膜。注意：注意：有機(jī)溶液沉淀蛋白質(zhì)通常在有機(jī)溶液沉淀蛋白質(zhì)通常在低溫低溫條件下進(jìn)行，否則

28、有機(jī)溶劑與水互溶產(chǎn)條件下進(jìn)行，否則有機(jī)溶劑與水互溶產(chǎn)生的溶解熱會(huì)使蛋白質(zhì)產(chǎn)生變性生的溶解熱會(huì)使蛋白質(zhì)產(chǎn)生變性。重金屬鹽沉淀(條件：pH 稍大于pI為宜) 當(dāng)當(dāng)pH pH 稍大于稍大于pIpI時(shí)，時(shí)，蛋白質(zhì)顆粒帶負(fù)電荷這蛋白質(zhì)顆粒帶負(fù)電荷這樣就容易與重金屬離子結(jié)合成不溶性鹽而樣就容易與重金屬離子結(jié)合成不溶性鹽而沉沉淀。淀。重金屬沉淀法的機(jī)理重金屬沉淀法的機(jī)理：重金屬鹽加入之后，與帶負(fù)電的羧基結(jié)合重金屬鹽加入之后，與帶負(fù)電的羧基結(jié)合。 加熱變性沉淀法 幾乎所有的蛋白質(zhì)都因加熱變性而凝幾乎所有的蛋白質(zhì)都因加熱變性而凝固。固。少量鹽促進(jìn)蛋白質(zhì)加熱凝固少量鹽促進(jìn)蛋白質(zhì)加熱凝固。 當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)處于等電點(diǎn)時(shí)，加

29、熱凝固當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)處于等電點(diǎn)時(shí)，加熱凝固最完全和最迅速最完全和最迅速. . 如：如：煮雞蛋煮雞蛋 酶的制備：酶的制備：超氧化物歧化酶的提取超氧化物歧化酶的提取蛋白質(zhì)的變性與復(fù)性 A、蛋白質(zhì)的變性定義 天然蛋白質(zhì)因受物理、化學(xué)因素的影響，使蛋白天然蛋白質(zhì)因受物理、化學(xué)因素的影響，使蛋白質(zhì)分子的構(gòu)象發(fā)生了異常變化，從而導(dǎo)致生物活性質(zhì)分子的構(gòu)象發(fā)生了異常變化，從而導(dǎo)致生物活性的喪失以及物理、化學(xué)性質(zhì)的異常變化。但的喪失以及物理、化學(xué)性質(zhì)的異常變化。但一級(jí)結(jié)一級(jí)結(jié)構(gòu)未遭破壞構(gòu)未遭破壞，這種現(xiàn)象稱為，這種現(xiàn)象稱為蛋白質(zhì)的變性。蛋白質(zhì)的變性。引起蛋白質(zhì)變性的主要因素1.物理因素：物理因素： 加熱、高壓、紫外線

30、照射、加熱、高壓、紫外線照射、X-射線、超射線、超聲波、劇烈振蕩和攪拌等聲波、劇烈振蕩和攪拌等2.化學(xué)因素：化學(xué)因素： 強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、脲、去污劑（十二烷基硫強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、脲、去污劑（十二烷基硫酸鈉（酸鈉（SDS）、重金屬鹽、三氯醋酸、）、重金屬鹽、三氯醋酸、濃乙醇等。濃乙醇等。蛋白質(zhì)的變性后的表現(xiàn) 生物活性喪失；溶解度降低，對(duì)于球狀蛋白粘度生物活性喪失；溶解度降低，對(duì)于球狀蛋白粘度增加；光吸收系數(shù)增大；生物化學(xué)性質(zhì)改變。增加；光吸收系數(shù)增大；生物化學(xué)性質(zhì)改變。 組分和分子量不變。組分和分子量不變。蛋白質(zhì)變性的本質(zhì)： 分子中各種次級(jí)鍵斷裂，使其空間構(gòu)象分子中各種次級(jí)鍵斷裂，使其空間構(gòu)象從緊密有序的狀

31、態(tài)變成松散無(wú)序的狀態(tài)，從緊密有序的狀態(tài)變成松散無(wú)序的狀態(tài)，一級(jí)結(jié)構(gòu)不破壞。 變性后的蛋白質(zhì)在結(jié)構(gòu)上雖有改變，但組成成分和相對(duì)分子質(zhì)量不變。 蛋白質(zhì)的復(fù)性 定義：定義：如果引起變性的因素如果引起變性的因素比較溫和比較溫和，蛋白質(zhì)構(gòu)象僅僅是有些松散時(shí)，當(dāng)除去變蛋白質(zhì)構(gòu)象僅僅是有些松散時(shí)，當(dāng)除去變性因素后，可根據(jù)熱力學(xué)原理緩慢地重新性因素后，可根據(jù)熱力學(xué)原理緩慢地重新自發(fā)折疊恢復(fù)原來(lái)的構(gòu)象，這種現(xiàn)象稱作自發(fā)折疊恢復(fù)原來(lái)的構(gòu)象，這種現(xiàn)象稱作復(fù)性復(fù)性。電泳電泳蛋白質(zhì)在高于或低于其蛋白質(zhì)在高于或低于其pIpI的溶液中為帶電的的溶液中為帶電的顆粒，在電場(chǎng)中能向正極或負(fù)極移動(dòng)。這種通過(guò)顆粒，在電場(chǎng)中能向正極或

32、負(fù)極移動(dòng)。這種通過(guò)蛋白質(zhì)在電場(chǎng)中泳動(dòng)而達(dá)到分離各種蛋白質(zhì)的技蛋白質(zhì)在電場(chǎng)中泳動(dòng)而達(dá)到分離各種蛋白質(zhì)的技術(shù)術(shù), , 稱為稱為電泳電泳(elctrophoresis(elctrophoresis) ) 。根據(jù)支撐物的不同，可分為薄膜電泳、凝膠根據(jù)支撐物的不同，可分為薄膜電泳、凝膠電泳等。電泳等。 電泳蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)pH條件下，不發(fā)生電泳條件下，不發(fā)生電泳現(xiàn)象。現(xiàn)象。利用蛋白質(zhì)的電泳利用蛋白質(zhì)的電泳現(xiàn)象，可以將不同帶現(xiàn)象，可以將不同帶電性質(zhì)和不同大小、電性質(zhì)和不同大小、形狀的蛋白質(zhì)分子進(jìn)形狀的蛋白質(zhì)分子進(jìn)行分離純化。行分離純化。 根據(jù)蛋白質(zhì)凈電荷根據(jù)蛋白質(zhì)凈電荷的差異來(lái)分離蛋白質(zhì)的差異

33、來(lái)分離蛋白質(zhì)的一種方法是的一種方法是電泳法電泳法。幾種重要的蛋白質(zhì)電泳幾種重要的蛋白質(zhì)電泳* *SDS-SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳，常用于蛋白質(zhì)，常用于蛋白質(zhì)分子量的測(cè)定。分子量的測(cè)定。* *等電聚焦電泳等電聚焦電泳，通過(guò)蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的差異，通過(guò)蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的差異而分離蛋白質(zhì)的電泳方法。而分離蛋白質(zhì)的電泳方法。* *雙向凝膠電泳雙向凝膠電泳是蛋白質(zhì)組學(xué)研究的重要技是蛋白質(zhì)組學(xué)研究的重要技術(shù)。術(shù)。 蛋白質(zhì)在遠(yuǎn)紫外光區(qū)（200-230nm）有較大的吸收，在280nm有一特征吸收峰，可利用這一特性對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行定性定量鑒定。蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度/（mg/ml）=1.55A1c

34、m - 0.76A1cm280 260測(cè)定范圍：測(cè)定范圍：0.10.10.5mg/ml0.5mg/ml 蛋白質(zhì)的紫外吸收 蛋白質(zhì)的顏色反應(yīng)蛋白質(zhì)的顏色反應(yīng)茚三酮反應(yīng)茚三酮反應(yīng)(ninhydrin(ninhydrin reaction) reaction) 蛋白質(zhì)經(jīng)水解后產(chǎn)生的氨基酸也可發(fā)生茚蛋白質(zhì)經(jīng)水解后產(chǎn)生的氨基酸也可發(fā)生茚三酮反應(yīng)。三酮反應(yīng)。 雙縮脲反應(yīng)雙縮脲反應(yīng)(biuret(biuret reaction) reaction)蛋白質(zhì)和多肽分子中肽鍵在稀堿溶液中與蛋白質(zhì)和多肽分子中肽鍵在稀堿溶液中與硫酸銅共熱，呈現(xiàn)紫色或紅色，此反應(yīng)稱為硫酸銅共熱，呈現(xiàn)紫色或紅色，此反應(yīng)稱為雙雙縮脲反應(yīng)縮脲反應(yīng)，雙縮脲反應(yīng)可用來(lái)檢測(cè)蛋白質(zhì)水解，雙縮脲反應(yīng)可用來(lái)檢測(cè)蛋白質(zhì)水解程度。程度。蛋白質(zhì)的顏色反應(yīng) 雙縮脲反應(yīng)雙縮脲反應(yīng) 酚試劑反應(yīng)酚試劑反應(yīng) 蛋白質(zhì)定量、定性蛋白質(zhì)定量、定性 茚三酮反應(yīng)茚三酮反應(yīng) 測(cè)定常用方