LINE 1非編碼區(qū)5UTR對(duì)腫瘤相關(guān)miRNA及其靶基因的調(diào)控作

1、.中文摘要摘要：近年來隨著非編碼序列研究的逐漸深入，發(fā)現(xiàn)越來越多的非編碼序列有著 重要的功能，同時(shí)在腫瘤分子發(fā)病機(jī)制和人類疾病治療方面的作用被大量證實(shí)。 在這些非編碼序列中，重復(fù)序列占很大的比重，這些重復(fù)序列大部分是移動(dòng)元件， 包括轉(zhuǎn)座子和逆轉(zhuǎn)座子。在逆轉(zhuǎn)座子中有二種長(zhǎng)散布重復(fù)序列LINEs，LINEl是 LINEs的重要組成成分，LINEl包含兩個(gè)開放閱讀框OI江1、ORF2和兩個(gè)非編碼 區(qū)域3UTR、5UTR。非編碼區(qū)5uTR序列是一個(gè)雙向啟動(dòng)子，正向啟動(dòng)子從obp 開始，反向啟動(dòng)子從400bp開始，400bp至680bp之間的這段序列對(duì)啟動(dòng)子的活性 有很大的影響。在絕大多數(shù)情況下，LIN

2、El是以5截短的形式存在，同時(shí)LINE1 的啟動(dòng)子為高度甲基化狀態(tài)，造成其沉默，但生殖細(xì)胞發(fā)育、胚胎發(fā)育的早期以 及腫瘤細(xì)胞中則為激活狀態(tài)。這提示LINEl的激活可能涉及腫瘤發(fā)生的共同機(jī)制。 國(guó)內(nèi)外的一些文獻(xiàn)報(bào)道對(duì)LINEl開放閱讀框的研究較多，但對(duì)其非編碼區(qū)3UTR、 5UTR還知之甚少。非編碼I斟A尤其是miI淑A在最近幾年也引起了大家的關(guān)注，它通過誘導(dǎo) mRNA的切割降解，與靶mRNA的序列互補(bǔ)，引起翻譯抑制或其他形式的調(diào)節(jié)機(jī) 制抑制靶基因的表達(dá)。迄今已經(jīng)發(fā)現(xiàn)并命名了超過9500個(gè)miRNA，參與細(xì)胞的生 長(zhǎng)、分化和細(xì)胞周期調(diào)控多個(gè)環(huán)節(jié)【5】，其中50位于與癌癥相關(guān)的染色體區(qū)域或易 斷裂

3、位點(diǎn)。有研究者認(rèn)為miRNA可以作為腫瘤易感基因的候選基因。這些發(fā)現(xiàn)說 明有很多未知的miRNA在真核細(xì)胞的調(diào)控中以及腫瘤的發(fā)生中發(fā)揮重要作用。同 時(shí)miIA作為癌基因或抑癌基因使人們對(duì)它的研究興趣與腫瘤分子發(fā)病機(jī)制相關(guān) 聯(lián)，對(duì)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展有著重要的影響。本文旨在將兩者結(jié)合起來，研究LINEl非編碼區(qū)5UTR對(duì)腫瘤相關(guān)miIA及其靶基因的調(diào)控作用。簡(jiǎn)要介紹5UTR的結(jié)構(gòu)以及所含的雙向啟動(dòng)子特征，以及相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道涉及 的內(nèi)源性miIA的來源，本篇論文重點(diǎn)研究LINEl非編碼區(qū)5UTR對(duì)腫瘤相關(guān) miI斟A及其靶基因的調(diào)控機(jī)理，主要研究?jī)?nèi)容分為三大部分：一、LINEl 5uTR對(duì)己知主要腫瘤相

4、關(guān)miRNA表達(dá)的影響 本部分將LINEl 5UTR RNA雙鏈、正義鏈、反義鏈分別轉(zhuǎn)入HEK 293細(xì)胞，通過熒光定量PCR來檢測(cè)它們對(duì)與腫瘤相關(guān)miRNA表達(dá)量的影響。二、LINEl 5uTR對(duì)候選miIA所調(diào)控的靶基因表達(dá)的影響本部分將LINEl 5uTR I淤A雙鏈、正義鏈、反義鏈分別轉(zhuǎn)入HEK 293細(xì)胞，通過熒光定量PCR來檢測(cè)受LINEl 5uTR影響的miRNA的靶基因的表達(dá)量的影響。三、LINEl 5UTR對(duì)miRNA所調(diào)控的靶基因啟動(dòng)子甲基化程度變化的影響：本部分通過熒光定量PcR來檢測(cè)LNEl 5uTR對(duì)miRNA靶基因甲基化及去 甲基化程度的影響，從而揭示LINEl 5

5、UTR對(duì)miRNA及其靶基因的調(diào)控機(jī)制。研究發(fā)現(xiàn)，LINEl非編碼區(qū)5UTR對(duì)miIA及其靶基因的表達(dá)產(chǎn)生了作用，通過甲基化檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，LINEl非編碼區(qū)5UTR對(duì)IIliI斟A靶基因的影響可能不是 通過甲基化作用，可能是從轉(zhuǎn)錄水平影響到基因的表達(dá)。 關(guān)鍵詞：L礬E1；5UTR；n缸R(shí)NA；腫瘤分類號(hào)：Q7ABSTRACTABSTRACT：hl rccent years，more and more non-coding sequence play 1mportant rolesT11e roles of noncoding sequence in也e regulation of physiolo

6、酉cal and p礎(chǔ)olo孕cal，especial iIl tu】mo啦卿esis，were investigated丘equentlyMost of non。Coding sequ吼ces are r印eat sequ饑Ces，which most of缸l鋤are mobile e1鋤ents，mcludlng仕姐岬son and retro廿ansposonRegarding re仃ot胱lsposons，long im唧ersed nuclear eleIIlents(LINEs)is me m萄or e1鋤ents iIl humaIl genome a11d L烈E1is me

7、 move哪helmlng one 鋤ong m鋤，LINElis composed of ORFl、oRF2 aIld non-codre百on 5uTR、 3，UTRNoncoding sequence 5UTR hafbors a bidirectional娜Imoter，fon砌 promoter舶m obp，觚d reverse promoter敞m 400bp，me sequence b咖e吼400bp and680bp play import趾t r01e in aCtiV塒of prI)moterSo it is implica覘that its缸aIls鋤ptswiU for

8、nl a double s仃ing RNA，wlich caIl process a siRNA iIl訪V0UNEl appears 丘cquenny in me f0衄of 5tr吼cated，aJld its promoter is hype吼ethylation m Inostsituations aIld so as to mal【e it silence，Whereas，in me deVeloping genn ceUs，eallyeI】1b011ic tissues a11d mor cells，LINEl is activatedIt suggestIed mat LINEl

9、activation may involVe a common mech枷sm of tumorigenesisNoncoding RNA，especially miI礬A，attract more atteI!Ltionsn啪u咖inducing mR NA de掣adation 眥d complement叫 combination of t鶘et砌A， cause tr趾slational repression or omer foms of re酣ation mechallism of idhibiting meaIldexpression of target genesTo date，

10、more thall 9500 miRNAs haVe been foulldn鋤ed，wllich involved in cell growfh，di儂鰳ntiation and cell cycle regulation趾d soon50of mem are located in chromosomal regions associated wlm caIlcer or士ra昏le regions，it is considered to be me ideal targets for t哪or detection趾d therapy as an onc02ene or mor suppr

11、essor genes，miRNA will open a new aV饑lle for understaIldlng嘶ofigensis111e卿ose of this paper is to combine me tw0，research me reguIatlonof 5UTR of LINE 1 on tllmor-associated miRNAs a11d melr target genesBaSed 0n me characters of 5UTR of LINEl，we h)rpothesized that me仃aIlscnptsd舐ved丘Dm botll promoter

12、s of 5UTR may contnbute to siRNA and miRNA，wmch西ve rise to m刪genes response subsequentlyTo elucidate thection of 5UTR ofLINEl，the mestigation was categorized缸ee parts as士ollows：1The impact of LINE 1 5UTR on tuInor-associated miRNA expresslonWim RNAs pr印aredby扛狃scription in Vi怕，HEK 293 cells were倆1st

13、ectedbyVme doubles扛a11d RNA，le sense strand RNA and me鋤tisense s紐鋤d RNA of LINE 1 5UTR rcspectiVelyThe aLlteration ofknown tumor-aLssociated miRNA were iIetected byreal time qWultitiative PCR2 111e iInpact ofLINEl 5UTR on tagen g印es oft啪or-associated IIliRNABaSed on1e condidate 1IliI斟A identi丘ed abo

14、Ve，廿le t叫昏et genes regulated by t11ese miItNAs were investigated齜卿ore in仃ansfected HEK 293 cells for meir eXpression by real缸1e刪tiatiVe PCR3The mechaIlism inVestigation oftlle s仃e鋤line ofLINEl5UTR-miRNAtargetgeIles by detecting tlle promoters melylation of mIget geneswi廿1臼mlSfected HEK 293 cells，tll

15、e memylation in CpG island of p湖noters of target geIles waS detected by tlle approach of restrictive enzyme witll methylation seIlsitiV時(shí)conlbiIling realtime qualltitiative PCR111e study fouIld t11at 5UTR of LINEl is si印mcant to me expression of tlle miRNA and its ta瑪et gene，iletection of methylation

16、 fount nlat tlle a臟ction of 5UTR of LINE l t0 eXpression of target g衄e of“RNA may be缸姐s嘶p：tion“l(fā)cVcr not印igenetic leVerKEYWoRS：LINE 1；5UTR；miRNA；tumorCLASSNo：Q7致謝當(dāng)論文寫到致謝這里時(shí)，心中涌起萬千感激和感慨，感激的是兩年來包括老 師、家人、朋友、同學(xué)對(duì)我的支持、理解與教誨；感慨的是兩年的時(shí)問太短了， 我能向各位老師和同學(xué)學(xué)習(xí)鈞時(shí)間非常有限。在這兩年的時(shí)間里，我一直都為能成為朱運(yùn)峰教授的學(xué)生而感到驕傲和自豪， 朱老師在學(xué)術(shù)上的造詣和精益

17、求精的態(tài)度深深地折服了我，在生活中對(duì)我的關(guān)心 和照顧讓我倍感溫馨，嚴(yán)謹(jǐn)且靈活的思維方式讓我受益匪淺并對(duì)未來的生活和工 作產(chǎn)生深遠(yuǎn)的影響。在這里要對(duì)朱老師表示深深的感激。實(shí)驗(yàn)室的各位老師們，無論在學(xué)習(xí)上還是在生活、工作中都給了我無私的幫 助和支持。在課堂上，盡可能多的向我們傳授知識(shí)：在試驗(yàn)中，盡可能的幫我們 解決遇到的問題；在生活上，盡可能的考慮到每位同學(xué)的情況。在此，我對(duì)各位 老師表示由衷的感謝。難以割舍的還有同學(xué)之間的情誼，我們?cè)谶@個(gè)實(shí)驗(yàn)室里朝夕相處，共同探討 實(shí)驗(yàn)問題、共同解決生活難題。無論是師兄師姐還是師弟師妹們，你們都給了我 無聲的幫助和支持，為了表示對(duì)你們的感謝，我覺得有必要留下你們

18、的名字，和 我的論文一起被保存：王諾鑫、馬海濱、王曉宇、郭舒涵、張娜、焦月盈、郭海 紅、李丹丹、趙峰、徐少華、袁銳、周亞瓊、闞學(xué)通、常卓、劉莉莉、石柳、李 冠琳、張彩艷、賀麗、楊辛、趙萌、郭芳、宋琳琳、金璽圓、王卓然、江彥澤、 肖碩、婁亮亮、田士軍、候雷、劉靜佚、戴蒙、李金龍、宋何煜、王楠、武曉燕、 徐菲一、繆新燕、楊海強(qiáng)、吳浩、張秀娟、張妮。同時(shí)，不能忘記的還有的軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院葉棋濃教授和程龍師兄，程龍師兄 在熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)中給了我很多的幫助和支持。同時(shí)還有中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院的老 師，為我實(shí)驗(yàn)的順利進(jìn)行提供了便利的條件，在此也要對(duì)他們的辛勤付出表示感 謝。最后，我要對(duì)一直以來支持我的家人和朋

19、友表示誠(chéng)摯的感謝，尤其是我的父 母，感謝的話說多少都不能表達(dá)出我對(duì)他們的感激之情，沒有他們的支持與理解， 我不可能站在這里完成我的學(xué)業(yè)，更沒有機(jī)會(huì)認(rèn)識(shí)各位老師和同學(xué)，對(duì)他們表達(dá) 我最誠(chéng)摯的感謝，在未來我會(huì)更加努力，不會(huì)讓大家失望。一頁紙張盛不下我滿滿的感激之情，兩年也不能滿足我求知的心，但因?yàn)樵?經(jīng)跟大家在一起開心、努力過，將是我一生的財(cái)富，最后祝所有的人都能快樂工 作、幸福生活。1引言11 miRNA的發(fā)現(xiàn)基因組中曾被認(rèn)為是“垃圾序列”的一些重復(fù)序列，在近幾年引起了廣泛關(guān) 注，它們可能具有重要的生物學(xué)作用。這些重復(fù)序列中，大部分是移動(dòng)元件，包 括轉(zhuǎn)座子和逆轉(zhuǎn)座子，逆轉(zhuǎn)座子中有一種長(zhǎng)散布重復(fù)序

20、列LINEs，在LINEs中 LINEl是主要組成成員，全長(zhǎng)57kb，在人類基因組中的拷貝有十萬份以上，占總 序列的15左右。LINEl是一個(gè)進(jìn)化上保守的超基因家族，5、3端為非編碼區(qū) (untranslated reigon，UTR)，中間含兩個(gè)開放閱讀框(open reading廳鋤e，0RF)。95以上的LINEl 5端存在缺失，其中有10L烈E1還存在重排，因此具有序列全長(zhǎng)及轉(zhuǎn)座活性的LINEl非常少見。具有活性的LINEl 5端3端為非編碼序列(UTR)， 其中含有兩個(gè)開放閱讀框0RFl和ORF2，5端UTR含有一個(gè)內(nèi)部啟動(dòng)子，3端 uTR含有一個(gè)非典型的加尾信號(hào)和polyA尾序列。

21、在正常分化的細(xì)胞中，LINEl 的啟動(dòng)子為高度甲基化狀態(tài)，使其沉默，但在生殖細(xì)胞發(fā)育、胚胎發(fā)育的早期和 腫瘤細(xì)胞中則呈激活狀態(tài)。研究發(fā)現(xiàn)，在大多數(shù)腫瘤細(xì)胞中LINEl的啟動(dòng)子均為 激活狀態(tài)，這就提示我們它可能涉及腫瘤發(fā)生的共同機(jī)制。LINEl可能是我們研 究腫瘤發(fā)生、發(fā)展的一個(gè)重要突破口。籮UTR瑟NR黷瓣A冀黲門35 qTRl。，。；。，。，。；。，一。，。，。一l。一0籍0辯F2琺l，圖11 LINEl結(jié)構(gòu)圖Figure 11the stmcture ofLINEl有趣的是，非編碼RNA(ncRNA)的作用以及它與腫瘤的發(fā)生，發(fā)展之問的 關(guān)系的研究也引起了人們極大的關(guān)注。長(zhǎng)期以來，ncRN

22、A被認(rèn)為是沒有功能的基 因垃圾，隨著進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，人類基因組大約有50的DNA轉(zhuǎn)錄為RNA， 而其中只有約2的RNA翻譯為蛋白質(zhì)，剩余的98為不編碼的部分【2l。ncRNA 的功能在各種復(fù)雜的細(xì)胞機(jī)制中被發(fā)現(xiàn)，如轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)，染色體復(fù)制，RNA加工、 修飾4，mRNA穩(wěn)定性和翻譯，基因沉默，DNA印記，DNA去甲基化，RNA干擾【5】，甚至蛋白質(zhì)降解和轉(zhuǎn)運(yùn)過程中都起作用【41。非編碼心悄在發(fā)病機(jī)制和人類 疾病治療方面的作用被大量證實(shí)，其中最引人注目的是微小砌忱(IIlicfoIA， miIA)，mjRNA由內(nèi)源基因編碼，可通過誘導(dǎo)nlIA的切割降解，翻譯抑制或其他形式的調(diào)節(jié)機(jī)制抑制靶基因的表達(dá)

23、，它已被作為癌基因或抑癌基因參與腫瘤 疾病的研究，同時(shí)也作為一種新的腫瘤標(biāo)記和治療靶向位點(diǎn)參與腫瘤的治療。本課題將LINEl和miIA結(jié)合起來，尋求它們之間及它們和腫瘤的發(fā)生、 發(fā)展之間存在的聯(lián)系，這是一種新的揭示腫瘤發(fā)生、發(fā)展的思路和方法，它的運(yùn) 用開拓了腫瘤分子發(fā)病機(jī)制研究的新篇章，將對(duì)未來腫瘤分子發(fā)病機(jī)制的研究起 到一定的啟發(fā)作用。12文獻(xiàn)綜述121miIA的發(fā)現(xiàn)1993年Lee【_7】等在秀麗線蟲體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了第一個(gè)呈時(shí)間特異性表達(dá)的調(diào)控基因 砌一4，不編碼蛋白，形成小分子RNA，小分子RNA抑制砌4蛋白合成，但是砌一J4 lIl】剛A水平無明顯變化。2000年Reillllan等【8】又

24、發(fā)現(xiàn)了第二個(gè)類似基因彪扣7，在 其他11種生物中檢測(cè)出了彪乒7及其同源物【9】。砌一4和彪扣7均調(diào)節(jié)線蟲的生長(zhǎng)發(fā) 育，在第一蛹期問，砌一4 I淤A的表達(dá)和第四蛹期彪卜7的表達(dá)經(jīng)過 3uTR(3un缸獨(dú)slated Re西ons)啟動(dòng)了靶IIl】RNA的減量調(diào)節(jié)。3一UTR單元是每個(gè) 調(diào)節(jié)RNA的附加部分，用以界定細(xì)胞命運(yùn)的瞬時(shí)分化進(jìn)程【14剖，由此可見尾f一7， 砌一4只是表達(dá)時(shí)間不同，而且長(zhǎng)度很短且在特定時(shí)間出現(xiàn)和發(fā)揮作用，因此被稱為小時(shí)限性I斟A(Small temporal RNA，stRNA)。2001年lO月又報(bào)道從線蟲、果 蠅和人體克隆的幾十個(gè)類似砌彳的小RNA基因。隨著對(duì)它們研究

25、的不斷深入， 發(fā)現(xiàn)它們是一種可調(diào)節(jié)基因表達(dá)、調(diào)控生長(zhǎng)發(fā)育、維持機(jī)體正常生理功能的一類 重要的小分子RNA，稱它們?yōu)槲⑿A(miI礬A)。miRNA成為基因表達(dá)調(diào)節(jié)系 統(tǒng)的一個(gè)重要組成部分，其本身的表達(dá)也受其它反式作用因子和順式作用元件的 調(diào)節(jié)，包括一些癌基因、表觀遺傳學(xué)等的調(diào)節(jié)【l 。miIA普遍存在于真核細(xì)胞中，是一種包含1923 nt內(nèi)源性小分子單鏈的 RNA，其前體大概是70100nt左右，形成標(biāo)準(zhǔn)的stem結(jié)構(gòu)【11，miRNA本身不具有開放閱讀框(open Reading Fr鋤e，ORF)，不編碼蛋白質(zhì)，作用于靶mRNA，導(dǎo)致其降解或抑制其翻犁91，在轉(zhuǎn)錄后水平和翻譯后水平上對(duì)靶

26、基因的表達(dá)有調(diào)節(jié)作用，在進(jìn)化過程中高度保守。miIA基因以單拷貝，多拷貝或基因簇的形式存在于基因組中，大多位于染色體內(nèi)含子、基因的間隔區(qū)，另有一小部分位于premRNA的內(nèi)含子區(qū)，其表達(dá)受生理反應(yīng)和發(fā)育信號(hào)的動(dòng)態(tài)調(diào)控。成熟的IIliRNA 5一端的磷 酸基團(tuán)和3端羥基是miRNA與相同長(zhǎng)度的功能RNA降解片段的區(qū)分標(biāo)志【11】。生 物在不同的發(fā)育階段、不同的組織器官中，IIliIA的種類和數(shù)量都有所不同，而 且其表達(dá)具有時(shí)空特異性。編碼miRNAs的基因約占全部預(yù)測(cè)基因的1一5， 在人類基因組中可能存在1000多種IIliRNA基因。通過電腦用分析軟件預(yù)測(cè)得到， 每種111iRNA可調(diào)控的基因

27、可達(dá)200多種，這意味著可能有超過13的人類蛋白編 碼基因受其調(diào)控。通過對(duì)小鼠和人類細(xì)胞的研究，發(fā)現(xiàn)IIliIAs可通過調(diào)節(jié)信號(hào) 分子的表達(dá)，對(duì)多種生物學(xué)過程發(fā)揮重要調(diào)控作用，包括個(gè)體發(fā)育、細(xì)胞分化、 增殖、代謝、凋亡和應(yīng)激等【9】。目前發(fā)現(xiàn)的miIA大多具有表達(dá)的組織特異性和 時(shí)序性，在不同組織，不同發(fā)育階段表達(dá)水平有顯著差異，其中有些miRNA主要 表現(xiàn)為加工成熟具有組織特異性，而前體的表達(dá)則表現(xiàn)為廣譜性特征。這些特點(diǎn) 提示miIA可能參與復(fù)雜的基因調(diào)控，可能對(duì)組織和細(xì)胞的功能特異性，組織發(fā)育起重要作用。很多111iRNA在遠(yuǎn)距離但功能相關(guān)的組織細(xì)胞中有保守序列，推測(cè) 這些分子參與一些必要

28、的發(fā)育和生理過程。一個(gè)miI淤A可調(diào)節(jié)數(shù)百個(gè)靶基因包括 轉(zhuǎn)錄因子、細(xì)胞因子、受體等，miRNA和靶基因組成了復(fù)雜的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)。122miI斟A的來源 miIA基因大多位于染色體內(nèi)含子、基因問區(qū)域或不編碼IIl】剛A外顯子，一些miIA在基因組中有多個(gè)位點(diǎn)，也有串聯(lián)排列的【12】。雖然有關(guān)miRNA的生物形 成和機(jī)制的研究仍處于起步階段，目前普遍認(rèn)為的真核生物miRNA的產(chǎn)生有四個(gè) 步驟：第一，miRNA以長(zhǎng)的大小約為1000 bp的長(zhǎng)鏈RNA初始轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物pri“IA 形式從基因組中被轉(zhuǎn)錄出來，很可能由P01II介導(dǎo)，primiIA具有5端7甲基鳥苷酸帽子和3端多聚腺苷酸尾巴【91。第二，研miI

29、A被I礬aS鋤內(nèi)切酶家族成員和屬于雙鏈IA結(jié)合蛋白(dsRBD)的DGCR8組成的復(fù)合物【9】加工形成約6070 nt 的、具有發(fā)卡結(jié)構(gòu)的單鏈miI小A前體premiRNA。Drosha的剪切位點(diǎn)位于 研miI斟A發(fā)夾結(jié)構(gòu)的底部，會(huì)相互錯(cuò)開兩個(gè)核苷酸，所以premiRNA 3端有2個(gè) 核苷酸比較突出。在剪切位點(diǎn)的上游20 nt到剪切位點(diǎn)的下游25 nt之間的發(fā)夾柄區(qū) 序列常常具有關(guān)鍵作用，其突變會(huì)顯著削弱核酸內(nèi)切酶Drosha的剪切效率。Drosha 對(duì)RNA的特異性剪切決定了成熟miRNA的序列【l引。pre-nliI汛A具有重要的二級(jí)結(jié) 構(gòu)，包括不完全配對(duì)的dsRNA區(qū)域，可被連續(xù)的切割成

30、一個(gè)或多個(gè)miRNA。該步 驟取決于premiIA的起源是位于外顯子還是內(nèi)含子。第三，prenliIA通過 RallGTP及其受體Exponin5轉(zhuǎn)運(yùn)出細(xì)胞核并被IA誘導(dǎo)的基因沉默復(fù)合物(RISC) 識(shí)別。RISC是由RnaseIII的家族成員dsI出DTRBP、Dicer以及核酸內(nèi)切酶A曙onaute2(A902)組成的，RISC在不需要ATP的情況下，能將premiRNA加工為成熟miRNA， 裂解靶mRNA。其中RISC的裝配、pre_miRNA的加工和靶mRNA的斷裂是偶聯(lián)的引。Dicer剪切發(fā)夾樣的premiRNA會(huì)形成22 bp不完全互補(bǔ)的雙鏈，其中包括一條 成熟的miRNA鏈和互

31、補(bǔ)序列miRNA術(shù)，呈miRNA：miRNA宰雙螺旋結(jié)合。這兩條 鏈的3端都有2個(gè)突出的核苷酸，在miRNA鏈靠近5端的地方還有一個(gè)不與 miRNA術(shù)鏈相應(yīng)位置堿基配對(duì)的小突起，這個(gè)小突起的存在削弱了miRNA=I：5端的 穩(wěn)定性一J。成熟miRNA的產(chǎn)生總是會(huì)優(yōu)先選擇5端較不穩(wěn)定那的一條鏈，因此 miRNA鏈被選中作為成熟miRNA的機(jī)會(huì)約大于miRNA木鏈100倍。雙鏈解開后的 miRNA與A902結(jié)合會(huì)留在活化后的RISC中，而miRNA塢圭則迅速被降解【15】。第四， 成熟的miRNA通過互補(bǔ)序列識(shí)別靶mRNA，并與其3端非翻譯區(qū)(UTR)結(jié)合，由 A902剪切靶mRNA使其降解，或抑

32、制mRNA翻譯，誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄后基因沉默【16】。 雌 酶一圖12：miRNA的產(chǎn)生 由P01II介導(dǎo)，miRNA以前體的形式從miRNA基岡組中轉(zhuǎn)錄山來。primiRNA被RNaseIII內(nèi)切 酶家族成員及屬丁雙鏈RNA結(jié)合蛋白(dsRBD)的DGCR8組成的微處理復(fù)合物加T形成具有 發(fā)譬結(jié)構(gòu)的單鏈miI斟A前體premiRNA。premiRNA通過RanGTP及其受體Exportin5轉(zhuǎn)運(yùn)出細(xì) 胞核并被RNA誘導(dǎo)的基岡沉默復(fù)合物(RISC)識(shí)別。Dicer剪切發(fā)夾樣premiRNA形成一22 bp不 完全互補(bǔ)的雙鏈，包括一條成熟的miRNA鏈，及其互補(bǔ)序列miRNA宰，早miRNA：miRNA半

33、雙 螺旋結(jié)合成熟的miRNA通過互補(bǔ)序列識(shí)別靶mRNA，并與其3端：1f!翻譯區(qū)(UTR)結(jié)合，由A902剪切靶mI斟A使其降解，或抑制mRNA翻譯，誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄后基岡沉默。Fig12 The PrOduction of Eukaryotic miRNA4Mediated by the Pol-，miI礬A is仃粕scribed fhm the mil吼g蚰ome as the form of p庳m氓NAUnder tlle complex of tlIe Dmsha蛐d DGCI讒，p庫miRNA is pmcessed into a singbstrandedhairpin p倫mi】剛A

34、P渺miRNA is tr鋤sponed out of tlIe肌cleus by R粕-GTP and itsceptor E印o rti：n_5蛐d試en鮞ed by R毽CP渺mil礬A ha卸in foma緬n is cut into double-str柚ded， includjng a chain of matlIre m涮呵A柚d禮smplementary seq啦nce Of nliI斟A， was miI礬A：miRNAdupkx bi|睢dingMatll聃miRNA驢豇豫target mRNA bycomplem蚰tary鴕quence，binding mRNAs 3-U

35、TR，A902 make target mRNA degrade orinhibite its打anslation，iIIducing post-tr粕sc訂p廿onal gene smnce123 miI礬A的作用方式目前普遍認(rèn)為的lIliRNA的作用方式主要有3種：第一種，IniI斟A與靶基因不完 全互補(bǔ)結(jié)合，miIA就會(huì)通過特異性識(shí)別靶111】瞇A的3UTR，并與之結(jié)合，抑制靶 mIA的翻譯而不影響mRNA的穩(wěn)定性，正是這種不完全互補(bǔ)配對(duì)模式，一個(gè)miRNA可調(diào)節(jié)數(shù)百個(gè)靶基因，包括轉(zhuǎn)錄因子、細(xì)胞因子、受體等【111，主要以線蟲 lin一4為代表，這種miIA作用方式是目前發(fā)現(xiàn)的最多的一種

36、；第二種，作用方式 與siRNA非常類似，作用時(shí)與靶基因完全或幾乎完全互補(bǔ)結(jié)合，導(dǎo)致mRNA的降解， 以miRNA17l為代表，這種作用方式在植物的miRNA中多次發(fā)現(xiàn)；第三種，以1et7 為代表，它同時(shí)具有以上兩種作用模式：當(dāng)與靶基因完全互補(bǔ)結(jié)合時(shí)，會(huì)直接切 割mIA：當(dāng)與靶基因不完全互補(bǔ)結(jié)合時(shí)，起調(diào)節(jié)基因表達(dá)的作用。124 miRNA與腫瘤的關(guān)系1241IiRNA的定位與腫瘤發(fā)生 腫瘤是機(jī)體在受到各種致癌因素的影響后，局部組織的某一個(gè)細(xì)胞在基因水平上失去了對(duì)其生長(zhǎng)的調(diào)控能力，導(dǎo)致了克隆性異常增生而形成的新生物【111。腫 瘤抑制基因和致癌基因先由DNA轉(zhuǎn)錄至RNA，然后翻譯成蛋白從而產(chǎn)生效

37、應(yīng)。針 對(duì)腫瘤的發(fā)生機(jī)制已有多種學(xué)說，但至今仍沒有確切的解釋，所以針對(duì)腫瘤的研 究不能僅限于臨床研究，還應(yīng)該從腫瘤發(fā)生的微環(huán)境與表型的關(guān)系入手。miRNA 可能能為我們更好的認(rèn)識(shí)和控制癌癥提供一個(gè)新的途徑。miRNA可能不能控制癌 癥的發(fā)生，發(fā)展及轉(zhuǎn)移，但能微調(diào)正常細(xì)胞生長(zhǎng)的組織內(nèi)平衡。這種調(diào)控網(wǎng)絡(luò)由 在多種水平調(diào)控基因組結(jié)構(gòu)及基因表達(dá)的miRNA和RNA水平調(diào)控相互作用網(wǎng)絡(luò)中的蛋白質(zhì)編碼基因構(gòu)成。有研究者認(rèn)為miI淤A在癌癥相關(guān)區(qū)域的發(fā)生率高于非癌癥相關(guān)區(qū)域，miRNA 與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有密切關(guān)系，很多miI礬A都定于已知腫瘤相關(guān)基因組區(qū)域內(nèi)或已知的脆性部位【11】，也有越來越多的證據(jù)

38、顯示IIliRNA的失調(diào)與某些類型的 癌癥密切相關(guān)，推測(cè)基因miRNA相互作用可能在癌癥中發(fā)揮著重要作用。在人類 中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了300多個(gè)miIA，其中高達(dá)50的nliIA位于與癌癥相關(guān)的染色體區(qū) 域或易斷裂位點(diǎn)。高通量的nliRNA微陣列方法是研究IIliIA在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)譜的有效方法，Murak鋤il等用此方法檢測(cè)了25個(gè)肝癌病人癌變組織及癌旁組織，獲得了miRNA在肝癌中的表達(dá)譜。研究發(fā)現(xiàn)30個(gè)表達(dá)失控lIliRNA基因，其中 miI斟A199a，miIA195，miIA199a木，miIA200a以及miRNA125a在腫 瘤組織中的表達(dá)水平明顯低于癌旁組織。有研究者實(shí)驗(yàn)顯示，檢測(cè)的1

39、86個(gè)miIA 中有98個(gè)miIA基因在癌癥相關(guān)區(qū)域發(fā)現(xiàn)，占到的比例為527，包括43的 miIA基因精確定位于LOH或腫瘤增殖區(qū)域，像肺癌，乳腺癌，卵巢癌，結(jié)腸癌， 胃癌，肝癌以及淋巴瘤，白血病。另有實(shí)驗(yàn)表明5068(222 of438)“IA位于 距離腫瘤易感區(qū)域小于5 Mb的位點(diǎn)上。其中在卵巢癌中，371的miI必A基因位于 DNA拷貝數(shù)反常的區(qū)域，這樣的情況同樣也出現(xiàn)在乳腺癌和黑素瘤中，占到的比例為728在乳腺癌中，859在黑素瘤中。同時(shí)Murak鋤i等發(fā)現(xiàn)3個(gè)miRNA在肝細(xì)胞肝癌中的表達(dá)高于癌旁組織，5個(gè)miI礬A表達(dá)降低，利用此表達(dá)譜可以區(qū)分癌 組織和正常組織，準(zhǔn)確率達(dá)978(4

40、546)。這些易感性頻率分布說明，誘發(fā)腫瘤的 基因在基因組的分布中不是隨機(jī)的而是集中在某些特定的染色體上，不但具有位 點(diǎn)的特殊性，而且miRNA很有可能存在于腫瘤易感區(qū)域內(nèi)：研究發(fā)現(xiàn)，在13種 miRNA中，7種miRNA在腫瘤易感和抗腫瘤品系中序列發(fā)生改變，其中5種miRNA 在啟動(dòng)子區(qū)域發(fā)生變化，只有2種在它們的母體中也發(fā)生了變化。因此，在腫瘤易 感和抗腫瘤品系中miI礬A啟動(dòng)子序列的變化嚴(yán)重影響IIliI斟A的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。人類腫瘤組織和細(xì)胞中miRNA的表達(dá)增高時(shí)，被看做癌基因或癌相關(guān)基因。 細(xì)胞不恰當(dāng)?shù)脑鲋呈悄[瘤發(fā)生機(jī)制，miI斟A有促進(jìn)腫瘤增殖或抑制腫瘤抑制基因， 從而參與調(diào)控與細(xì)胞增

41、殖有關(guān)的基因，誘導(dǎo)腫瘤的發(fā)生【ll】。2002年，Calin【l副等就 發(fā)現(xiàn)miR15a和mill161位于染色體13q14，巧合的是這一區(qū)域在一半以上的 BCLLs病人中缺失或表達(dá)下調(diào)。并且這一缺失發(fā)生在約50的外套細(xì)胞淋巴瘤中(Inalltle cell lyn叩homa，MCL)，同時(shí)也在1640的多發(fā)性骨髓瘤和60的前列 腺癌中出現(xiàn)【l引。所以有關(guān)專家推測(cè)在這一區(qū)域中可能存在著一個(gè)或多個(gè)腫瘤抑制 基因，能夠起到抑制腫瘤的作用：但是，奇怪的是并沒有在這一區(qū)域發(fā)現(xiàn)任何可 能會(huì)參與腫瘤發(fā)生基因的存在。而Calill等又發(fā)現(xiàn)，差不多一半以上的miIA位于 和腫瘤發(fā)生有關(guān)的相關(guān)的區(qū)域及脆性位點(diǎn)、

42、雜合型丟失區(qū)，擴(kuò)增區(qū)或斷裂點(diǎn)區(qū)。 2005年，He等發(fā)現(xiàn)miR1792多順反子所處的的13q3132區(qū)正好位于人類B細(xì)胞淋 巴瘤頻繁發(fā)生基因擴(kuò)增的區(qū)域，在B細(xì)胞淋巴瘤和細(xì)胞系中，miR_1792的 primiI斟A和成熟miRNA的量有顯著的增加。同時(shí)在具有淋巴瘤遺傳傾向的小鼠 中，如果增強(qiáng)miR1792表達(dá)，就可能促進(jìn)MYC誘導(dǎo)的B細(xì)胞淋巴瘤形成，小鼠發(fā)6生淋巴瘤的速度會(huì)更快(51d，對(duì)照組36個(gè)月)，發(fā)病率也更高(100，對(duì)照組30)， 這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果都提示我們111iR1792可能是癌基因【91。有關(guān)報(bào)道稱lIiiR1792的表達(dá) 可能是受MYC蛋白的調(diào)控。機(jī)理可能是MYC通過直接與13號(hào)

43、染色體上的 miR-17-92位點(diǎn)結(jié)合，達(dá)到激活其表達(dá)的效果。同時(shí)受MYC激活的111iR-1792又可下調(diào)轉(zhuǎn)錄因子E2F1蛋白的表達(dá)，轉(zhuǎn)錄因子E2F1蛋白具有誘導(dǎo)凋亡的作用【201，miR-1792的過表達(dá)可能是通過抑制凋亡來促進(jìn)腫瘤的形成。其他刪A位于腫瘤發(fā)生相關(guān)位點(diǎn)的例子還有：111iRNA143和111iR145在乳腺癌、宮頸癌、淋巴系統(tǒng)腫 瘤和結(jié)直腸腫瘤中表達(dá)水平均一致下調(diào)，且這種下調(diào)與轉(zhuǎn)錄后加工有關(guān)。兩者可能的靶mRNA中包含了作用于信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和基因表達(dá)的一些基斟211。rniIA143和miR145兩個(gè)基因都位于5q3233。MiR142位于17號(hào)染色體易位斷裂點(diǎn)的接頭處 t(8，

44、17)pJ，它使已易位的cMyc的轉(zhuǎn)譯上調(diào)從而增加B淋巴細(xì)胞白血病的易發(fā)性。 在MiR-142發(fā)卡結(jié)構(gòu)下游有一個(gè)20 nt的保守序列成分，其在染色體易位時(shí)容易丟失 pJ。Bic基因發(fā)現(xiàn)于雞淋巴瘤中，位于禽白血病病毒的逆轉(zhuǎn)錄整合位點(diǎn)，整合的前 病毒可促進(jìn)bic基因的表達(dá)，有人認(rèn)為bic編碼的IA通過進(jìn)一步加工就可形成 miR155。Iorio等還發(fā)現(xiàn)，MiR125b在乳腺腫瘤中表達(dá)下調(diào)，定位于11q2324，這 一區(qū)域在乳腺、卵巢和肺部腫瘤中都有缺失現(xiàn)象的存在。在這一區(qū)域也沒有找到 能夠真正參與到腫瘤發(fā)生的抑癌基因，推測(cè)miR125b可能有一種腫瘤發(fā)生的作用。 可見，miRNA表達(dá)水平的變化可能

45、導(dǎo)致腫瘤基因或抑癌基因轉(zhuǎn)錄后的錯(cuò)誤調(diào)控， 進(jìn)而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生，而其本身可能也發(fā)揮了抑癌基因或腫瘤基因的功能與作用。1242 nliI訊A表達(dá)異常表達(dá)參與多種疾病的發(fā)生 miIA的異常在很多人類疾病中發(fā)現(xiàn)，包括癌癥，糖尿病和阿茲海默癥中。多個(gè)研究小組利用微陣列(Illicroarray)和磁珠雜交技術(shù)發(fā)現(xiàn)良性和惡性腫瘤中 miIA的表達(dá)水平發(fā)生變化【22彩】，但miRNA表達(dá)水平的改變與腫瘤的發(fā)生，誰是 “因”，誰是“果”，還沒有確切的答案，有相當(dāng)一部分學(xué)者認(rèn)為是miRNA通過 轉(zhuǎn)錄失常、突變、DNA拷貝數(shù)失常，缺失、增殖或基因修飾而參與腫瘤的發(fā)生。 miRNA的改變引起腫瘤細(xì)胞中蛋白質(zhì)表達(dá)的變

46、化，加速了腫瘤的發(fā)展。每一種 miIA的表達(dá)水平受miRNA相鄰的調(diào)控元件的影響。miIA的失活是它的靶 mRNA的過表達(dá)引起的。相反，miRNA的活化是它的靶111A表達(dá)下調(diào)引起的。 因此靶基因表達(dá)的改變參與到細(xì)胞凋亡，細(xì)胞周期，病毒入侵等過程，導(dǎo)致腫瘤 的引發(fā)，發(fā)生和發(fā)展。子宮平滑肌瘤是常見的婦科腫瘤，用高通量的miRNA微陣列方法檢測(cè)了55個(gè) 患者的組織，發(fā)現(xiàn)45個(gè)表達(dá)失控的“RNA，其中1et7 miI礬A家族，miRNA21， miI淤A23b，miI斟A29b以及miINA一197變化最為明顯。慢性淋巴細(xì)胞性白血病 中最常見的染色體異常是13q14區(qū)雜合子或純合子丟失，同時(shí)還在50

47、的套細(xì)胞淋 巴瘤，1640的多發(fā)性骨髓瘤以及60的前列腺癌中也出現(xiàn)過類似的情況【9】，7所以推測(cè)這一位點(diǎn)存在至少一種腫瘤抑制基因，發(fā)現(xiàn)miR-15a和111iR161位于缺失 位點(diǎn)LEu2內(nèi)含子內(nèi)。乳頭狀甲狀腺癌miR-221、miR222和商R146表達(dá)上調(diào)與Kjt 蛋白表達(dá)下降有關(guān)，miRNA和硒t表達(dá)異常參與腫瘤發(fā)生。Bcl2蛋白高表達(dá)與 lIliR-15a和miR-161缺失或下調(diào)有關(guān)，1lliR15a和IIliR161是治療腫瘤的候選基因圳。miR-17-92家族由13q31的C130rf25基因編碼，染色體免疫共沉淀發(fā)現(xiàn)MyC結(jié)合 c130rf25第一個(gè)內(nèi)含子，Myc誘導(dǎo)血R一17

48、92家族和E2F1轉(zhuǎn)錄增加，而這些IIliRNAs 負(fù)調(diào)節(jié)E2F1，抑制mir-175p和miR20a可以明顯增加E2F1表達(dá)。另一方面，過多 E2F1可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，miR1792負(fù)調(diào)節(jié)E2F1阻止其凋亡活性，促進(jìn)了Myc介導(dǎo) 的細(xì)胞增殖IlJ。結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT1 16p53表達(dá)影響miI必A，這與miRNA基因的啟 動(dòng)子上有p53結(jié)合位點(diǎn)有關(guān)【241。生殖細(xì)胞腫瘤中，miR372和miR373可以通過直接 抑制U汀S2(抑癌基因)的表達(dá)下調(diào)p53介導(dǎo)的抑制依賴于細(xì)胞周期蛋白激酶(CDK) 作用，促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)【251。miIA在腫瘤中表達(dá)失控的研究結(jié)果如僅顯示變化趨勢(shì)而沒有后續(xù)的功能研

49、究是無意義的。目前研究miRNA功能的方法最多的是過表達(dá)，表達(dá)水平下調(diào)或表 達(dá)沉默，進(jìn)而分析實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷谋硇偷淖兓枰栽忈屘禺恗iRNA的功能。miI冰A經(jīng)過加工獲得成熟片段，參入沉默誘導(dǎo)復(fù)合物(RISC)，通過與靶基因111剛A3UTR某些特異位點(diǎn)相互作用，導(dǎo)致靶基因miIA翻譯障礙或穩(wěn)定性降低，通過 靶基因分析軟件獲得靶基因序列信息，特別是靶基因n瓜NA 3uTR的作用位點(diǎn)。 克隆含有該位點(diǎn)的片段至含有報(bào)告基因的質(zhì)粒，獲得重組質(zhì)粒后，結(jié)合特異miRNA 過表達(dá)及抑制方法，建立熒光素雙報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)分析方法，評(píng)估其對(duì)靶基因 的調(diào)控作用。此結(jié)果通過蛋白質(zhì)水平上的進(jìn)一步驗(yàn)證，最終確認(rèn)特異miI

50、A調(diào)控 的靶基因，并以此為線索對(duì)miRNA在某一特定生理或病理過程中的功能進(jìn)行研究。1243刪A參與腫瘤相關(guān)病毒的調(diào)控致瘤病毒的感染是腫瘤發(fā)生的重要因素之一，占到的比例約為20，有些致瘤病毒既能在在自身基因組中編碼lIliRNA，也能利用宿主細(xì)胞編碼的miIA在感 染細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)和控制自身和宿主基因的表達(dá)【11】。這些病毒miRNA與病毒感染狀態(tài) 的維持及病毒的致瘤作用有關(guān)。有研究者在HIV-l感染細(xì)胞中分離出了一種稱為miRN367的基因，它是病毒 基因組Nef基因的產(chǎn)物，miRN367可以降低HIV1 LTR啟動(dòng)子的活性，達(dá)到抑制了 H轉(zhuǎn)錄的目的【11】。HCV的5和3非翻譯區(qū)都有一段序列能

51、夠與肝細(xì)胞特異性的 miIA122種子序列發(fā)生部分配對(duì)。而病毒本身為了在宿主細(xì)胞存活，會(huì)調(diào)節(jié)細(xì) 胞miRNA的表達(dá)。有研究者發(fā)現(xiàn)與miR122互補(bǔ)的2O甲基化的反義寡核苷酸能夠 起到抑制HCV復(fù)制的作用，這使我們推測(cè)miR122可能是病毒復(fù)制的正調(diào)控因子【61。HCV的5和3非翻譯區(qū)各有一段區(qū)域能夠與肝細(xì)胞特異性的miRNA122種子區(qū)域部分配對(duì)。研究者用哺乳動(dòng)物的miIA表達(dá)譜芯片技術(shù)檢測(cè)了轉(zhuǎn)染乙型肝炎病毒(HB全基因組的人成肝細(xì)胞瘤細(xì)胞系HepG2細(xì)胞中111iIA的表達(dá)情況，結(jié)果顯 示：與親本H印G2細(xì)胞差異表達(dá)的lIliIA共有27個(gè)(占5：3)，其中表達(dá)上調(diào)的有 7個(gè)基因，有20個(gè)基

52、因是表達(dá)下調(diào)的，存在差異性上調(diào)m缺一181d基因和差異性下調(diào) miR-15a基因，表明肝細(xì)胞中存在與HBv復(fù)制相關(guān)的miI悄“61。而病毒自身為了在 宿主細(xì)胞中成功存活，也必定會(huì)反過來調(diào)節(jié)細(xì)胞塒IA的表達(dá)。1244 nliIA參與腫瘤發(fā)生的機(jī)制有研究者認(rèn)為不恰當(dāng)?shù)募?xì)胞增殖是腫瘤發(fā)生機(jī)制中的一種經(jīng)典的解釋，因?yàn)?miRNA有抑制基因表達(dá)的作用，可能會(huì)通過調(diào)控和細(xì)胞增殖相關(guān)的基因，改變了 細(xì)胞的正常周期，從而誘發(fā)腫瘤【19】。Chall等【19】發(fā)現(xiàn)，miR-21在人類惡性膠質(zhì)瘤中 表達(dá)量較高，可能發(fā)揮抗凋亡因子的作用。如果抑制觚R21的表達(dá)，可以激活天 冬氨酸途徑，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，使惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞

53、數(shù)量減少，胱天蛋白酶一3和胱天蛋 白酶7的活性增加了3倍，凋亡顯著提高，這說明miR2l可能通過阻斷凋亡基因表 達(dá)維持惡性表型【26】。EL染色顯示在封閉miI斟A2 1后，DNA的片段化與細(xì)胞 核凋亡表型明顯增加。Calin等【19】發(fā)現(xiàn)，111iR-15和miR161的表達(dá)在65的B細(xì)胞慢 性淋巴細(xì)胞白血病病人中表現(xiàn)下調(diào)。不久，ciIIlmino等又發(fā)現(xiàn)，在BcLL細(xì)胞中， miR15a和IIliR-161能夠直接與BCL2的3UTR序列相互作用從而調(diào)控BCL2蛋白 的表達(dá)，并與之成負(fù)相關(guān)，而BCL2是抗凋亡基因，常常參與細(xì)胞凋亡過程，說明 miR15a和miR161發(fā)揮了類似抑癌基因的作

54、用。miR15a和誠(chéng)R-161還有可能能激 活外源性APAf1胱天蛋白酶9PA砌，的凋亡途徑，參與凋亡過程。所以，miR15a 和miR161表達(dá)的下調(diào)可能導(dǎo)致了BCL2的過表達(dá)，參與大部分人類B細(xì)胞CLL發(fā)病 機(jī)制。這些都提示：miR一21的高表達(dá)，能夠是編碼凋亡相關(guān)基因的穩(wěn)定性降低或 導(dǎo)致表達(dá)下調(diào)，發(fā)揮了抗凋亡因子的作用。在惡性膠質(zhì)瘤中，miR21能通過封閉 凋亡基因的表達(dá)，發(fā)揮了類似癌基因的作用。但是chen919】等卻發(fā)現(xiàn)，在HeLa細(xì) 胞中，111iR21的作用機(jī)制是通過影響細(xì)胞的增殖能力而不是通過參與細(xì)胞凋亡發(fā) 揮作用的?？梢娔骋惶厥鈓iRNA，包括miRNA21在內(nèi)，在不同的細(xì)胞

55、中通過什么 樣的途徑發(fā)揮作用，取決于基因在不同細(xì)胞中的靶基因。雖然，miR21在惡性膠 質(zhì)瘤細(xì)胞中起到的是抗凋亡的作用，但在其他腫瘤細(xì)胞中卻未必有相同的調(diào)控機(jī) 制。有研究者發(fā)現(xiàn)RAS信號(hào)通路通過在哺乳動(dòng)物調(diào)控細(xì)胞正常生長(zhǎng)和惡性增殖的 過程中發(fā)揮作用，RAs蛋白過表達(dá)會(huì)引起細(xì)胞的惡性增歹直【19】。Jollllson等【”】發(fā)現(xiàn)人 類RAS家族的三個(gè)成員HRAS、l氓AS和NRAS的3uTR區(qū)含有多個(gè)與彪乒7互補(bǔ)的 位點(diǎn)，彪扣7對(duì)RaS基因有調(diào)控作用，推測(cè)與腫瘤發(fā)生有關(guān)，彪乒7是最早發(fā)現(xiàn)的miIA 之一，同時(shí)也是治療腫瘤的靶點(diǎn)【27】。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，肺癌組織中彪扛7表達(dá)下調(diào)與RaS蛋白表達(dá)上調(diào)有關(guān)

56、，增加彪卜7表達(dá)會(huì)抑制肺癌細(xì)胞株的生長(zhǎng)【28】。HeLa細(xì)胞中彪扣7活性的降低導(dǎo)致了RAS的蛋白表達(dá)量增加了70。而且Tal(鋤izawa等還發(fā)現(xiàn)在肺9癌組織中，RAS蛋白與正常蛋白相比呈現(xiàn)顯著性的高表達(dá)，而彪乒7貝0表現(xiàn)顯著性低表達(dá)。所以，在正常細(xì)胞中三g扣7的水平較高，I認(rèn)S蛋白的表達(dá)受到明顯的抑制作 用；而在腫瘤細(xì)胞和組織中，彪乒7的表達(dá)水平很低甚至沒有，刪踮簍因失去控制導(dǎo) 致其蛋白過量表達(dá)，引起細(xì)胞惡性增殖。這說明，miIA表達(dá)量的變化可能和細(xì)胞的分化作用有關(guān)，我們知道，所有人類腫瘤發(fā)生的一個(gè)標(biāo)志是分化能力的喪失。 miRNA的前體在受到外界刺激時(shí)，例如細(xì)胞間的相互作用或激素的刺激，就會(huì)轉(zhuǎn)