乳酸菌檢驗操作規(guī)范培訓(xùn)

1、目錄目錄一、乳酸菌一、乳酸菌二、儀器設(shè)備二、儀器設(shè)備三、三、 培養(yǎng)基培養(yǎng)基四、無菌室準(zhǔn)備四、無菌室準(zhǔn)備五、接種培養(yǎng)五、接種培養(yǎng)六、菌落計數(shù)六、菌落計數(shù)七、乳酸菌在改進(jìn)七、乳酸菌在改進(jìn)MC培養(yǎng)基上菌落特征培養(yǎng)基上菌落特征八、過氧化氫酶試驗八、過氧化氫酶試驗一、一、乳酸菌乳酸菌1 1、乳酸菌的概念、乳酸菌的概念乳酸菌一詞并非生物分類學(xué)名詞，而是指乳酸菌一詞并非生物分類學(xué)名詞，而是指能夠利用發(fā)酵性糖類產(chǎn)生大量乳酸的一類能夠利用發(fā)酵性糖類產(chǎn)生大量乳酸的一類微生物的統(tǒng)稱。微生物的統(tǒng)稱。通常將乳酸細(xì)菌之類群稱為乳酸菌。通常將乳酸細(xì)菌之類群稱為乳酸菌。2 2、乳酸菌主要分布、乳酸菌主要分布乳桿菌屬乳桿菌屬L

2、actobacillusLactobacillus 鏈球菌屬鏈球菌屬StreptococcusStreptococcus明串珠菌屬明串珠菌屬LeuconostocLeuconostoc片球菌屬片球菌屬PediococcusPediococcus雙歧桿菌屬雙歧桿菌屬BifidobacteriumBifidobacterium一乳桿菌屬一乳桿菌屬LactobacillusLactobacillus1乳桿菌屬的形態(tài)特征乳桿菌屬的形態(tài)特征 細(xì)胞呈桿狀，多為長桿狀、短桿狀及棒桿狀，一細(xì)胞呈桿狀，多為長桿狀、短桿狀及棒桿狀，一般成短鏈排列。革蘭氏染色陽性，通常不運動，般成短鏈排列。革蘭氏染色陽性，通常不運

3、動，無芽孢。無芽孢。2乳桿菌屬的生物學(xué)特點乳桿菌屬的生物學(xué)特點 化能異養(yǎng)型，營養(yǎng)要求嚴(yán)格，生長繁殖需要多種化能異養(yǎng)型，營養(yǎng)要求嚴(yán)格，生長繁殖需要多種氨基酸、維生素、肽、核酸衍生物。氨基酸、維生素、肽、核酸衍生物。 厭氧、耐氧性厭氧或兼性厭氧厭氧、耐氧性厭氧或兼性厭氧 生長最適生長最適pH為為5.56.2，在，在pH5的環(huán)境中可生長，的環(huán)境中可生長，而中性或初始堿性條件下生長速率降低。而中性或初始堿性條件下生長速率降低。生長溫度范圍，生長溫度范圍，253，最適生長溫度，最適生長溫度3040。 3乳桿菌屬的代表種乳桿菌屬的代表種 3.1保加利亞乳桿菌保加利亞乳桿菌L.bulgaricus細(xì)胞形態(tài)長

4、桿狀，兩端鈍圓。細(xì)胞形態(tài)長桿狀，兩端鈍圓。固體培養(yǎng)基生長的菌落呈棉花狀，易與其它乳酸固體培養(yǎng)基生長的菌落呈棉花狀，易與其它乳酸菌區(qū)別。菌區(qū)別。能利用葡萄糖、果糖、乳糖進(jìn)展同型乳酸發(fā)酵產(chǎn)能利用葡萄糖、果糖、乳糖進(jìn)展同型乳酸發(fā)酵產(chǎn)生生D型乳酸有酸澀味，適口性差，不能利型乳酸有酸澀味，適口性差，不能利用蔗糖。用蔗糖。該菌是乳酸菌中產(chǎn)酸能力最強的菌種。該菌是乳酸菌中產(chǎn)酸能力最強的菌種。蛋白質(zhì)分解力較弱，發(fā)酵乳中可產(chǎn)生香味物質(zhì)蛋白質(zhì)分解力較弱，發(fā)酵乳中可產(chǎn)生香味物質(zhì)乙醛。乙醛。最適生長溫度最適生長溫度3745，溫度高于，溫度高于50或低于或低于20不生長。不生長。常作為發(fā)酵酸奶的生產(chǎn)菌。常作為發(fā)酵酸奶的

5、生產(chǎn)菌。 3.2嗜酸乳桿菌嗜酸乳桿菌L.acidophilus 細(xì)胞形態(tài)比保加利亞乳桿菌小，呈細(xì)長桿狀，能細(xì)胞形態(tài)比保加利亞乳桿菌小，呈細(xì)長桿狀，能利用葡萄糖、果糖、乳糖、蔗糖進(jìn)展同型乳酸發(fā)利用葡萄糖、果糖、乳糖、蔗糖進(jìn)展同型乳酸發(fā)酵產(chǎn)生乳酸。酵產(chǎn)生乳酸。最適生長溫度最適生長溫度37，20以下不生長，耐熱性差。以下不生長，耐熱性差。蛋白質(zhì)分解力較弱。蛋白質(zhì)分解力較弱。 最適生長最適生長pH 5.56.0，耐酸性強，能在其它乳酸，耐酸性強，能在其它乳酸菌不能生長的酸性環(huán)境中生長繁殖。菌不能生長的酸性環(huán)境中生長繁殖。嗜酸乳桿菌是能夠在人體腸道定殖的少數(shù)有益微嗜酸乳桿菌是能夠在人體腸道定殖的少數(shù)有益

6、微生物菌群之一，其代謝產(chǎn)物有機(jī)酸和抗菌物質(zhì)生物菌群之一，其代謝產(chǎn)物有機(jī)酸和抗菌物質(zhì)乳桿菌素可抑制病原菌和腐敗菌的生長。乳桿菌素可抑制病原菌和腐敗菌的生長。 二鏈球菌屬二鏈球菌屬Streptococcus1鏈球菌屬的形態(tài)特征鏈球菌屬的形態(tài)特征 細(xì)胞呈球形或卵圓形，成對或成鏈排列。革蘭氏細(xì)胞呈球形或卵圓形，成對或成鏈排列。革蘭氏染色陽性，無芽孢，一般不運動，不產(chǎn)生色素。染色陽性，無芽孢，一般不運動，不產(chǎn)生色素。2鏈球菌屬的生物學(xué)特點鏈球菌屬的生物學(xué)特點 化能異養(yǎng)型，同型乳酸發(fā)酵產(chǎn)生右旋乳酸；化能異養(yǎng)型，同型乳酸發(fā)酵產(chǎn)生右旋乳酸；兼性厭氧型，接觸酶反響陰性，厭氧培養(yǎng)兼性厭氧型，接觸酶反響陰性，厭氧培

7、養(yǎng)生長良好。生長良好。 3鏈球菌屬的代表種鏈球菌屬的代表種 嗜熱鏈球菌嗜熱鏈球菌St.thermophilus 細(xì)胞形態(tài)呈鏈球狀。細(xì)胞形態(tài)呈鏈球狀。能利用葡萄糖、果糖、乳糖和蔗糖進(jìn)展發(fā)酵產(chǎn)生乳能利用葡萄糖、果糖、乳糖和蔗糖進(jìn)展發(fā)酵產(chǎn)生乳酸酸 。蛋白質(zhì)分解力較弱，在發(fā)酵乳中可產(chǎn)生香味物質(zhì)雙蛋白質(zhì)分解力較弱，在發(fā)酵乳中可產(chǎn)生香味物質(zhì)雙乙酰。乙酰。 該菌主要特征是能在高溫條件下產(chǎn)酸，最適生長溫該菌主要特征是能在高溫條件下產(chǎn)酸，最適生長溫度度4045，溫度低于，溫度低于20不產(chǎn)酸。耐熱性強，能不產(chǎn)酸。耐熱性強，能耐耐6568的高溫。的高溫。三明串珠菌屬三明串珠菌屬Leuconostoc 菌落一般小于菌

8、落一般小于1.0mm，光滑、圓形、灰白色，光滑、圓形、灰白色 細(xì)胞球形或豆?fàn)?，成對或成鏈排列?xì)胞球形或豆?fàn)?，成對或成鏈排?。革蘭氏染色陽性，不運動，無芽孢。革蘭氏染色陽性，不運動，無芽孢。四雙歧桿菌屬四雙歧桿菌屬Bifidobacterium 1雙歧桿菌屬的形態(tài)特征雙歧桿菌屬的形態(tài)特征 細(xì)胞呈多樣形態(tài)：細(xì)胞呈多樣形態(tài)：Y字型、字型、V字型、彎曲狀、勺型，字型、彎曲狀、勺型，典型形態(tài)為分叉桿菌典型形態(tài)為分叉桿菌 革蘭氏染色陽性，亞甲基蘭染色菌體著色不規(guī)那革蘭氏染色陽性，亞甲基蘭染色菌體著色不規(guī)那么。無芽孢和鞭毛，不運動。么。無芽孢和鞭毛，不運動。 2雙歧桿菌屬的生物學(xué)特點雙歧桿菌屬的生物學(xué)特點

9、 化能異養(yǎng)型，對營養(yǎng)要求苛刻，生長繁殖需要多化能異養(yǎng)型，對營養(yǎng)要求苛刻，生長繁殖需要多種雙歧因子種雙歧因子 。能利用葡萄糖、果糖、乳糖和半乳糖，生成乳酸能利用葡萄糖、果糖、乳糖和半乳糖，生成乳酸和乙酸及少量的甲酸和琥珀酸。和乙酸及少量的甲酸和琥珀酸。 蛋白質(zhì)分解力微弱。蛋白質(zhì)分解力微弱。專性厭氧，但不同菌種或菌株對氧的敏感性存在專性厭氧，但不同菌種或菌株對氧的敏感性存在差異，屢次傳代培養(yǎng)后，菌株的耐氧性增強。差異，屢次傳代培養(yǎng)后，菌株的耐氧性增強。生長溫度范圍生長溫度范圍2545，最適生長溫度，最適生長溫度37。生長生長pH值范圍值范圍4.58.5，最適生長起始，最適生長起始pH值值6.57.

10、0，不耐酸，酸性環(huán)境，不耐酸，酸性環(huán)境pH5.5對菌體存活不對菌體存活不利。利。 3、代表種、代表種 人體腸道中共有人體腸道中共有8種，其中數(shù)量最多的種，其中數(shù)量最多的5種為：種為：兩歧雙歧桿菌兩歧雙歧桿菌B.bifidum嬰兒雙歧桿菌嬰兒雙歧桿菌B.infantis青春雙歧桿菌青春雙歧桿菌B.adolescentis長雙歧桿菌長雙歧桿菌B.longum短雙歧桿菌短雙歧桿菌(B.breve)4、雙歧桿菌功能、雙歧桿菌功能是人體腸道有益菌群，它可定殖在宿主的腸粘膜是人體腸道有益菌群，它可定殖在宿主的腸粘膜上形成生物學(xué)屏障上形成生物學(xué)屏障 具有拮抗致病菌、改善微生態(tài)平衡、合成多種微具有拮抗致病菌、

11、改善微生態(tài)平衡、合成多種微生素、提供營養(yǎng)、抗腫瘤、降低內(nèi)毒素、提高免生素、提供營養(yǎng)、抗腫瘤、降低內(nèi)毒素、提高免疫力、保護(hù)造血器官、降低膽固醇水平等重要生疫力、保護(hù)造血器官、降低膽固醇水平等重要生理功能，其促進(jìn)人體安康的有益作用，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過理功能，其促進(jìn)人體安康的有益作用，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過其它乳酸菌。其它乳酸菌。 二、檢測儀器設(shè)備二、檢測儀器設(shè)備 冰箱：冰箱：04恒溫培養(yǎng)箱：恒溫培養(yǎng)箱：361恒溫水浴鍋：恒溫水浴鍋：461微生物顯微鏡微生物顯微鏡三角瓶：三角瓶：500ml滅菌刻度吸管：滅菌刻度吸管：1ml、10ml 滅菌平皿：直徑滅菌平皿：直徑90mm三、三、 培養(yǎng)基培養(yǎng)基 1、改進(jìn)、改進(jìn)MC培養(yǎng)基培養(yǎng)基

12、 成分：大豆蛋白胨，成分：大豆蛋白胨，5g；牛肉浸膏，；牛肉浸膏，5g;酵母酵母浸膏，浸膏，5g；葡萄糖，；葡萄糖，20g；乳糖，；乳糖， 20g；碳酸；碳酸鈣，鈣， 10g；瓊脂，；瓊脂，15g；蒸餾水，；蒸餾水，1000mL；1的中性紅溶液，的中性紅溶液，5mL；硫酸多粘菌素；硫酸多粘菌素B，10萬萬IU。 11515分鐘高壓滅菌備用。分鐘高壓滅菌備用。2、培養(yǎng)基的準(zhǔn)備、培養(yǎng)基的準(zhǔn)備使用前，將滅菌培養(yǎng)基用微波爐或水浴鍋使用前，將滅菌培養(yǎng)基用微波爐或水浴鍋加熱溶解，在加熱溶解，在4045水浴中保溫待用。水浴中保溫待用。四、無菌室準(zhǔn)備四、無菌室準(zhǔn)備無菌室使用前后，用紫外燈照射無菌室使用前后，用

13、紫外燈照射3040min。將。將工作服、工作帽和工作鞋放入無菌室進(jìn)展滅菌，工作服、工作帽和工作鞋放入無菌室進(jìn)展滅菌，進(jìn)入無菌室前換上工作服、工作帽和工作鞋。進(jìn)入無菌室前換上工作服、工作帽和工作鞋。超凈工作臺面，使用前用超凈工作臺面，使用前用75%酒精擦拭消毒后，酒精擦拭消毒后，用紫外燈照射用紫外燈照射4045min；操作完畢后，用干凈；操作完畢后，用干凈抹布將操作臺面擦拭干凈后，用抹布將操作臺面擦拭干凈后，用75%的酒精棉球的酒精棉球進(jìn)展擦拭，開啟紫外燈照射進(jìn)展擦拭，開啟紫外燈照射4045min。五、接種培養(yǎng)五、接種培養(yǎng) 以無菌操作，用以無菌操作，用1ml滅菌刻度吸管吸取滅菌刻度吸管吸取1ml

14、樣品原液，注入含有滅菌生理鹽水的試管樣品原液，注入含有滅菌生理鹽水的試管內(nèi)，充分振搖，制成內(nèi)，充分振搖，制成1:10的稀釋液。的稀釋液。注意：刻度吸管尖端不要觸及試管內(nèi)生理注意：刻度吸管尖端不要觸及試管內(nèi)生理鹽水。鹽水。用用1ml滅菌刻度吸管吸取滅菌刻度吸管吸取1ml1:10的稀釋液，注的稀釋液，注入含有滅菌生理鹽水的試管內(nèi)，振搖試管，混入含有滅菌生理鹽水的試管內(nèi)，振搖試管，混合均勻。合均勻。注意：吸取稀釋液前，用刻度吸管吹打，使稀注意：吸取稀釋液前，用刻度吸管吹打，使稀 釋混合均勻。刻度吸管尖端不要觸及管內(nèi)稀釋釋混合均勻。刻度吸管尖端不要觸及管內(nèi)稀釋液。液。另取另取1ml滅菌刻度吸管，按上述

15、操作順序，滅菌刻度吸管，按上述操作順序，做做10倍遞增稀釋液，如此每遞增一次，即倍遞增稀釋液，如此每遞增一次，即換用換用1支支1ml滅菌刻度吸管。滅菌刻度吸管。在無菌操作條件下，用在無菌操作條件下，用1ml滅菌刻度吸管吸滅菌刻度吸管吸取選定的樣品稀釋液或原液至滅菌平皿內(nèi)。取選定的樣品稀釋液或原液至滅菌平皿內(nèi)。 同上對同一樣品重復(fù)操作，即每個選定的適同上對同一樣品重復(fù)操作，即每個選定的適當(dāng)?shù)臉悠废♂屢鹤鰞蓚€平皿。當(dāng)?shù)臉悠废♂屢鹤鰞蓚€平皿。 按以上步驟，以按以上步驟，以1ml滅菌生理鹽水作為空白操滅菌生理鹽水作為空白操作對照。作對照。 在無菌操作條件下，將約在無菌操作條件下，將約15ml的改進(jìn)的改

16、進(jìn)MC培培養(yǎng)基傾入樣品平皿中，將平皿置于操作臺面養(yǎng)基傾入樣品平皿中，將平皿置于操作臺面上輕輕轉(zhuǎn)動，使樣品和培養(yǎng)基混合均勻。上輕輕轉(zhuǎn)動，使樣品和培養(yǎng)基混合均勻。 接種培養(yǎng)操作錄像接種培養(yǎng)操作錄像討論討論錄像中存在細(xì)節(jié)問題：錄像中存在細(xì)節(jié)問題：1、拿平板前先消毒手、拿平板前先消毒手2、倒培養(yǎng)基前要對培養(yǎng)基的瓶進(jìn)展消毒，、倒培養(yǎng)基前要對培養(yǎng)基的瓶進(jìn)展消毒，可以酒精棉球消毒和酒精燈外焰消毒。可以酒精棉球消毒和酒精燈外焰消毒。待培養(yǎng)基凝固后，將平皿翻轉(zhuǎn)，即有培養(yǎng)待培養(yǎng)基凝固后，將平皿翻轉(zhuǎn)，即有培養(yǎng)基的一面向上?；囊幻嫦蛏?。 將所有平皿置于將所有平皿置于361培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)723h，觀察乳

17、酸菌菌落特征。，觀察乳酸菌菌落特征。 六、菌落計數(shù)六、菌落計數(shù) 選取菌落數(shù)在選取菌落數(shù)在30300之間的平皿進(jìn)展計數(shù)。之間的平皿進(jìn)展計數(shù)。 計數(shù)后，隨機(jī)挑取五個菌落進(jìn)展革蘭氏染色，顯計數(shù)后，隨機(jī)挑取五個菌落進(jìn)展革蘭氏染色，顯微鏡檢查并做過氧化氫酶試驗。微鏡檢查并做過氧化氫酶試驗。 革蘭氏陽性，過氧化氫酶陰性，無芽孢的球菌或革蘭氏陽性，過氧化氫酶陰性，無芽孢的球菌或桿菌可定為乳酸菌。桿菌可定為乳酸菌。根據(jù)證實為乳酸菌菌落計算出該皿內(nèi)的乳酸菌數(shù)，根據(jù)證實為乳酸菌菌落計算出該皿內(nèi)的乳酸菌數(shù)，乘以其稀釋倍數(shù)即得每毫升樣品中乳酸菌數(shù)。乘以其稀釋倍數(shù)即得每毫升樣品中乳酸菌數(shù)。例如檢樣例如檢樣10-4的稀釋液在改進(jìn)的稀釋液在改進(jìn)MC平板上，生成可平板上，生成可疑菌落為疑菌落為35個，取五個鑒定，證實為乳酸菌的是四個，取五個鑒定，證實為乳酸菌的是四個，那么個，那么1ml樣品中乳酸菌數(shù)為：樣品中乳酸菌數(shù)為：35*4/5*104=2.8*105。 七、乳酸菌在改進(jìn)七、乳酸菌在改進(jìn)MC培養(yǎng)基上菌落特征培養(yǎng)基上菌落特征菌體菌體改改 良良 MC桿菌桿菌平皿底為粉紅色，菌落較小，圓形、平皿底為粉紅色，菌落較小，圓形、紅色、邊緣似星狀，直徑紅色、邊緣似星狀，直徑2mm1mm1mm，可有淡淡的暈可有