原代神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)方法辯析

1、神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)體外神經(jīng)細(xì)胞的培養(yǎng)已成為神經(jīng)生物學(xué)研究中十分有用的技術(shù)手段。神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)的主要優(yōu)點(diǎn)是:（1）分散培養(yǎng)的神經(jīng)細(xì)胞在體外生長(zhǎng)成熟后,能保持結(jié)構(gòu)和功能上的某些特點(diǎn),而且長(zhǎng)期培養(yǎng)能形成髓鞘和建立突觸聯(lián)系,這就提供了體內(nèi)生長(zhǎng)過程在體外重現(xiàn)的機(jī)會(huì)。（2）能在較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)直接觀察活細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化、形態(tài)和功能變化,便于使用各種不同的技術(shù)方法如相差顯微鏡、熒光顯微鏡、電子顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡、同位素標(biāo)記、原位雜交、免疫組化和電生理等手段進(jìn)行研究。（3）易于施行物理（如缺血、缺氧）、化學(xué)和生物因子（如神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子）等實(shí)驗(yàn)條件,觀察條件變更對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的直接或間接作用。（4）便于從細(xì)胞和分子水平探討某

2、些神經(jīng)疾病的發(fā)病機(jī)制，藥物或各種因素對(duì)胚胎或新生動(dòng)物神經(jīng)細(xì)胞在生長(zhǎng)、發(fā)育和分化等各方面的影響。我們實(shí)驗(yàn)室從80年代始開展了神經(jīng)細(xì)胞的體外培養(yǎng)工作，取得了一些經(jīng)驗(yàn)，現(xiàn)將培養(yǎng)細(xì)胞分類及方法簡(jiǎn)要介紹如下:一.雞胚背根神經(jīng)節(jié)組織塊培養(yǎng)主要用于神經(jīng)生長(zhǎng)因子（NGF等神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的生物活性測(cè)定。在差倒置顯微鏡下觀察以神經(jīng)突起的生長(zhǎng)長(zhǎng)度和密度為指標(biāo)半定量評(píng)估NGF的活性。1材料和方法（1）選正常受精的雞蛋，置于37生化培養(yǎng)箱內(nèi)孵化，每日翻動(dòng)雞蛋一次。（2）取孵化8-12d的雞蛋,用70%酒精消毒蛋殼，從氣室端敲開蛋殼，用消毒鑷剝除氣室部蛋殼。（3）用彎鑷鉤住雞胚頸部，無菌條件下取出雞胚置小平皿內(nèi)，除去頭部后

3、，腹側(cè)向上置滅菌毛玻璃片上,用眼科彎鑷子打開胸腹腔，除去內(nèi)臟器官。（4）在解剖顯微鏡下，小心除去腹膜，暴露脊柱及其兩側(cè)，在椎間孔旁可見到沿脊柱兩側(cè)排列的背根節(jié)（圖1），用一對(duì)5號(hào)微解剖鑷小心取出。（5）置背根節(jié)于解剖溶液內(nèi)，用微解剖鑷去除附帶組織，接種于涂有鼠尾膠的玻璃或塑料培養(yǎng)瓶中，在DMEM6血清培養(yǎng)液中培養(yǎng)。2結(jié)果雞胚背根神經(jīng)節(jié)在含神經(jīng)生長(zhǎng)因子（NGF,2.5S，20ng/ml）的無血清培養(yǎng)液中培養(yǎng)24h,神經(jīng)節(jié)長(zhǎng)出密集的神經(jīng)突起。而未加NGF的神經(jīng)節(jié)培養(yǎng)24h,未見神經(jīng)突起生長(zhǎng)。二新生大鼠、新生小鼠及雞胚背根神經(jīng)節(jié)分散細(xì)胞培養(yǎng)背根神經(jīng)節(jié)（DRG細(xì)胞起源于神經(jīng)性NGF研究先驅(qū)Levi-M

4、ontalcini的實(shí)驗(yàn)表明，外原性NGFt歸刺激DRGffl胞生長(zhǎng)發(fā)育并形成廣泛的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)。在體外，分離培養(yǎng)的神經(jīng)節(jié)在NGF存在的情況下，神經(jīng)突起的生長(zhǎng)在一天之內(nèi)可長(zhǎng)達(dá)數(shù)毫米，因此，利用培養(yǎng)的DRGffl胞，進(jìn)行軸突生長(zhǎng)發(fā)育的研究，是最為經(jīng)典而常用的方法之一。1 材料和方法取新生一天的大鼠（wistar種）和小鼠（昆明種）。用眼科剪在無菌條件下除去背部皮膚,然后剪取一段脊髓,背側(cè)朝上置于滅菌毛玻璃片上,在解剖顯微鏡下沿椎管兩側(cè)水平剪除腹側(cè)一半椎骨,暴露脊髓和神經(jīng)節(jié),用解剖鑷分離出神經(jīng)節(jié)。雞胚背根神經(jīng)節(jié)的取材方法同前。剝除神經(jīng)節(jié)被膜,用0.125%胰蛋白酶消化（3730min）分散后用種植（P

5、lating）培養(yǎng)液稀釋成0.2X105個(gè)細(xì)胞/ml密度的細(xì)胞懸液，接種于涂有鼠尾膠的35mmi料培養(yǎng)皿中，每皿2ml細(xì)胞懸液置。置標(biāo)本于36、10%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24h后傾去培養(yǎng)皿內(nèi)種植培養(yǎng)液，改用飼養(yǎng)（Feeding）培養(yǎng)液培養(yǎng)。接種第3d,在培養(yǎng)皿中分別加入細(xì)胞分裂抑制劑5-氟-2'-脫氧尿昔15g/ml和尿音35g/ml以抑制非神經(jīng)細(xì)胞的增殖，作用48h后更換新鮮飼養(yǎng)培養(yǎng)液，以后每周換液兩次,每次更換一半新鮮飼養(yǎng)培養(yǎng)液。2 .培養(yǎng)液成份種植培養(yǎng)液：80%Eagle'sDMEMt葡萄糖600mg/100mkNaHCO3.7g/L);10%胎牛血清；10%馬血清；NG

6、F20ng/ml;谷氨酰胺lOOg/ml。脫氧核糖核酸酶I40科g/ml。飼養(yǎng)培養(yǎng)液:95%Eagle'sDMEM(含葡萄糖600mg/100ml、NaHCO33.7g/L,)；5%馬血清；NGF20ng/ml;神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素1ml/100ml;谷氨酰胺100g/mlo3 新生大鼠背根節(jié)神經(jīng)元的生長(zhǎng)分化和形態(tài)特征新生大鼠背根節(jié)神經(jīng)元接種后4h,大部分細(xì)胞可貼壁，呈圓形或橢圓形，直徑8-14m,胞體周圍呈現(xiàn)一圈光暈。神經(jīng)元的細(xì)胞核位于中央或偏于胞體一側(cè),核仁明顯,亦可見雙核神經(jīng)元。接種后24h,大部分貼壁細(xì)胞開始長(zhǎng)出突起。其中多數(shù)為具有多個(gè)突起的多極神經(jīng)元,少數(shù)為雙極和假單極神經(jīng)元,突起細(xì)長(zhǎng)

7、,并可觀察到突起末端的生長(zhǎng)錐。除單個(gè)散布的神經(jīng)元外,還常見到幾個(gè)或多個(gè)神經(jīng)元聚集在一起,它們向四周發(fā)出樹枝狀的神經(jīng)突起。培養(yǎng)2-3d后神經(jīng)元的突起逐漸增多并延長(zhǎng),形成稀疏的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng),神經(jīng)元突起的主干和分枝明顯延長(zhǎng)并增粗,神經(jīng)突起網(wǎng)絡(luò)變得更加稠密,神經(jīng)元胞體逐漸增大。大鼠背根節(jié)神經(jīng)元可維持培養(yǎng)2個(gè)月。4 新生小鼠背根節(jié)神經(jīng)元的生長(zhǎng)分化和形態(tài)特征新生小鼠背根節(jié)神經(jīng)元的形態(tài)結(jié)構(gòu)和生長(zhǎng)分化基本上與新生大鼠相似,但小鼠背根節(jié)神經(jīng)元的胞體較大鼠稍小。神經(jīng)元亦隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增大。小鼠背根節(jié)神經(jīng)元亦可維持培養(yǎng)2個(gè)月。5雞胚背根節(jié)神經(jīng)元的生長(zhǎng)分化和形態(tài)特征雞胚背根節(jié)神經(jīng)元的生長(zhǎng)分化

8、基本上亦與新生大鼠和小鼠相似。但雞胚背根節(jié)神經(jīng)元以假單極為多見。與大鼠或小鼠背根節(jié)培養(yǎng)神經(jīng)元相比,神經(jīng)突起分枝較少。神經(jīng)元胞體稍小,神經(jīng)元亦隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增大。雞胚背根節(jié)神經(jīng)元亦可維持培養(yǎng)2個(gè)月。三.新生小鼠頸上交感神經(jīng)元分散細(xì)胞培養(yǎng)交感神經(jīng)系統(tǒng)在維持機(jī)體的正常功能和對(duì)環(huán)境的適應(yīng)性反應(yīng)中起著十分重要的作用。交感神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)特別有助于神經(jīng)細(xì)胞發(fā)育和可塑性研究，利用體外培養(yǎng)系統(tǒng)可進(jìn)行交感神經(jīng)細(xì)胞的發(fā)生、死亡、形態(tài)和生化發(fā)育、遞質(zhì)表形的獲得，以及靶組織與傳入纖維的突觸形成的研究。此外，通過體外培養(yǎng)系統(tǒng)可獲得關(guān)于神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子、激素，細(xì)胞因子等調(diào)節(jié)交感神經(jīng)元發(fā)育的信息，了解傳入纖維的輸入以及與

9、靶組織的聯(lián)系的機(jī)制。1材料和方法實(shí)驗(yàn)用出生當(dāng)天的昆明種小鼠，在無菌條件下腹部朝上固定于塑料泡沫板上,用微解剖鑷在解剖顯微鏡下找到氣管兩側(cè)的頸總動(dòng)脈,并以此為標(biāo)志,在頸總動(dòng)脈分為頸內(nèi)外動(dòng)脈交叉處找到上頸交感節(jié),取出上頸交感節(jié),置于含1%膠元酶(Collagenase)和1%消化酶(Dispase)的2ml混合消化液中消化(37，1h)分散后，用種植(Plating)培養(yǎng)液稀釋成0.2X105個(gè)細(xì)胞/ml密度的的細(xì)胞懸液；接種于涂有小牛皮膠或以小鼠腦皮層膠質(zhì)細(xì)胞為背景的35mn料培養(yǎng)皿中，每皿2ml細(xì)胞懸液置。置標(biāo)本于36C、10%CO§養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24h后傾去培養(yǎng)皿內(nèi)種植培養(yǎng)液,改用飼

10、養(yǎng)(Feeding)培養(yǎng)液培養(yǎng)。接種第3d,在培養(yǎng)皿中分別加入細(xì)胞分裂抑制劑5-氟-2'-脫氧尿昔15g/ml和尿音35g/ml,作用48h后更換新鮮飼養(yǎng)培養(yǎng)液,以后每周換液兩次,每次更換一半新鮮飼養(yǎng)培養(yǎng)液。2培養(yǎng)液成份種植培養(yǎng)液：80%Eagle'sDMEMfr葡萄糖600mg/100ml、NaHCO3.7g/L);10%J臺(tái)牛血清；10%馬血清；NGF20ng/ml;谷氨酰胺100科g/ml。脫氧核糖核酸酶I40科g/ml。飼養(yǎng)培養(yǎng)液:95%Eagle'sDMEM(含葡萄糖600mg/100ml、NaHCO33.7g/L,)；5%馬血清；NGF20ng/ml;神經(jīng)營(yíng)

11、養(yǎng)素1ml/100ml;谷氨酰胺lOOg/ml。3新生小鼠交感節(jié)神經(jīng)元的生長(zhǎng)分化和形態(tài)特征新生小鼠交感節(jié)神經(jīng)元在含NGF的培養(yǎng)液中種植后4h,細(xì)胞即開始貼附在膠元薄膜或在皮層膠質(zhì)細(xì)胞層上生長(zhǎng),交感神經(jīng)元的胞體一般為圓形,有時(shí)亦可見橢圓或梭形,體積較大,直徑約8-14科m左右，胞體周圍呈現(xiàn)一圈光暈，神經(jīng)元的細(xì)胞核大多偏于胞體一側(cè)，核仁明顯，亦可見雙核神經(jīng)元。接種后24h,大部分貼壁神經(jīng)元開始長(zhǎng)出突起。培養(yǎng)2-3天后,神經(jīng)元突起逐漸增多并延長(zhǎng),形成稀疏的網(wǎng)絡(luò)。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng),神經(jīng)突起網(wǎng)絡(luò)變得更加稠密。神經(jīng)細(xì)胞的主干和分枝明顯延長(zhǎng)并增粗,神經(jīng)元的胞體逐漸增大。小鼠交感神經(jīng)元可維持培養(yǎng)1-2個(gè)月。

12、四.胚胎小鼠、大鼠、雞胚脊髓腹角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元培養(yǎng)，中樞神經(jīng)系統(tǒng)包括腦和脊髓，脊髓是中樞的初級(jí)部分，其功能有二，一是傳導(dǎo)感覺和運(yùn)動(dòng)沖動(dòng)，二是完成軀體運(yùn)動(dòng)的基本反射。脊髓突然被橫斷并與高級(jí)中級(jí)失去聯(lián)系后產(chǎn)生脊休克。因此，利用體外培養(yǎng)的脊髓腹角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元進(jìn)行脊髓損傷和修復(fù)的研究日益受到重視。1 材料和方法用12-14d胚齡的小鼠、12-14d胚齡的大鼠、孵化10d的雞胚，在無菌條件下取出胎鼠或雞胚脊髓，剝除脊膜后,將整個(gè)脊髓腹側(cè)面朝上置于平皿中，用微解剖鑷和雙面刀片沿脊髓中央管縱切兩半，再將脊髓兩側(cè)的腹側(cè)部分切下，將組織塊切碎，用0.125%胰蛋白酶消化（37C30min）分散后，用種植培養(yǎng)液（同第二

13、節(jié)）稀釋成5X105個(gè)細(xì)胞/ml密度的細(xì)胞懸液，接種于涂有小牛皮膠的35mm塑料培養(yǎng)皿中，每皿2ml,置36C、10%CO勺培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24h后傾去培養(yǎng)皿內(nèi)種植培養(yǎng)液,改用飼養(yǎng)培養(yǎng)液（同第二節(jié)）進(jìn)行培養(yǎng)。以后每周換液兩次,每次更換50%的新鮮飼養(yǎng)培養(yǎng)液。2 胚胎小鼠、大鼠、雞胚脊髓腹角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的生長(zhǎng)分化和形態(tài)特征胚鼠和雞胚脊髓腹側(cè)神經(jīng)元培養(yǎng)12h后,大部分神經(jīng)元可貼壁,貼壁神經(jīng)元呈圓形,直徑5-8科m,其中少數(shù)神經(jīng)元開始伸出1-2個(gè)突起。培養(yǎng)24h后，神經(jīng)元突起逐漸增多并延長(zhǎng)，形成稀疏的網(wǎng)絡(luò),培養(yǎng)的脊髓神經(jīng)元以雙極和多極為多見,神經(jīng)元呈圓形或橢圓形及多邊形不等,胞核清楚,多數(shù)具1-2個(gè)核仁

14、。隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng),神經(jīng)元突起進(jìn)一步增多、增粗并延長(zhǎng),形成稀疏的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò),神經(jīng)元胞體逐漸增大。多極胞體大的神經(jīng)元逐漸增多,經(jīng)膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶（ChAT）免疫組織化學(xué)染色和乙酰膽堿酯酶（AChE）組化染色呈陽(yáng)性反應(yīng)。此后，只要定期換液并適當(dāng)抑制非神經(jīng)細(xì)胞的過度增殖,胚眙大鼠、胚盼小鼠和雞胚脊髓腹側(cè)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元在體外可維持培養(yǎng)2個(gè)月。五.新生大鼠海馬神經(jīng)元分散培養(yǎng)海馬屬大腦邊緣系統(tǒng)，與情緒、學(xué)習(xí)及記憶有關(guān)，它具有明顯的長(zhǎng)突觸傳遞的長(zhǎng)時(shí)間程長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)（LTP）和長(zhǎng)時(shí)程抑制（LDT）的能力。LTP和LDP具有協(xié)動(dòng)性、特異性、長(zhǎng)時(shí)性的特點(diǎn)，目前已被認(rèn)為是學(xué)習(xí)和記憶的基礎(chǔ)。而且海馬組織常常是引起癲癇發(fā)作的病變

15、部位，并且海馬細(xì)胞對(duì)缺血、缺氧特別敏感。這些特征反映了海馬神經(jīng)元的內(nèi)在性。例如，對(duì)缺氧的可塑性和易感性均與NMD（AN-methyi-D-aspartate，N-甲基-D-天冬氨酸）受體的獨(dú)特性質(zhì)相關(guān)。海馬具有中樞神經(jīng)系統(tǒng)的典型特性，有相對(duì)同源性的神經(jīng)元群體，據(jù)估計(jì)，海馬主要的細(xì)胞類型-錐體神經(jīng)元占海馬全部神經(jīng)元的85%-90%。海馬CA1和CA2區(qū)含有的錐體細(xì)胞在電生理特性及其相互連接的形式上各不相同，并能分別進(jìn)行培養(yǎng)。海馬錐體細(xì)胞具有特征性的形態(tài)，它們有單根軸突和數(shù)根樹突組成，所有的樹突都高度分化并密布樹突嵴。此外，海馬錐體神經(jīng)元相互之間與中間神經(jīng)元群體之間均有直接聯(lián)系，在體外培養(yǎng)系統(tǒng)缺乏

16、外源性傳入纖維的情況下，海馬神經(jīng)元相互間仍然能產(chǎn)生廣泛的突觸聯(lián)系。1材料和方法取當(dāng)天出生的Wistar大鼠,在無菌條件下取腦、分離出雙側(cè)海馬，用0.125%胰蛋白酶消化（36C、30min）分散后，用種植培養(yǎng)液（同第二節(jié)）稀釋成5X105個(gè)細(xì)胞/ml密度的細(xì)胞液,接種于涂有小牛皮膠的35mmi料培養(yǎng)皿中，每皿2ml,置標(biāo)本于36C,含10%CO勺培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。24h后頃去培養(yǎng)皿內(nèi)種植培養(yǎng)液,改用飼養(yǎng)培養(yǎng)液（同第二節(jié)）培養(yǎng)。接種第5d,在培養(yǎng)皿中分別加入細(xì)胞分裂抑制劑5'-氟-2'-脫氧尿昔15g/ml和尿音35g/ml或加入阿糖胞甘3g/ml以抑制非神經(jīng)細(xì)胞的過度增殖，作用48

17、h后更換新鮮培養(yǎng)液，以后每周換液2次，每次更換50%新鮮培養(yǎng)液。2新生大鼠海馬神經(jīng)元的生長(zhǎng)分化和形態(tài)特征新生大鼠海馬神經(jīng)元種植后12h,大部分細(xì)胞可貼壁,呈圓形,其中少數(shù)神經(jīng)細(xì)胞開始伸出1-2個(gè)突起。培養(yǎng)24h后，伸出突起的神經(jīng)細(xì)胞逐漸增多，突起一般為20-40m,長(zhǎng)者可達(dá)60dmi培養(yǎng)3d后，神經(jīng)元突起進(jìn)一步增多并延長(zhǎng)，形成稀疏的網(wǎng)絡(luò)。培養(yǎng)的海馬細(xì)胞以錐體細(xì)胞為多見，胞體較大，直徑6-12科01隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，神經(jīng)元胞體逐漸增大，胞突主干和分技明顯延長(zhǎng)并增粗,形成更加稠密的網(wǎng)絡(luò)。海馬神經(jīng)元在體外可維持培養(yǎng)2個(gè)月。六新生大鼠隔神經(jīng)元分散培養(yǎng)隔亦屬大腦邊緣系統(tǒng)，主要與一系例內(nèi)臟活動(dòng)、軀體活動(dòng)

18、，情緒活動(dòng)有密切關(guān)系。1 材料和方法取當(dāng)天出生的Wistar大鼠,在無菌條件下取腦、分離出雙側(cè)隔區(qū)，培養(yǎng)方法同海馬神經(jīng)元培養(yǎng)。2 新生大鼠隔神經(jīng)元的生長(zhǎng)分化和形態(tài)特征新生大鼠隔區(qū)培養(yǎng)神經(jīng)元的生長(zhǎng)分化基本上與新生大鼠海馬神經(jīng)元相似。但隔神經(jīng)元大多為具有兩個(gè)突起的雙極神經(jīng)元，神經(jīng)元胞體呈橢圓形，直徑6-8科m=隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，神經(jīng)元胞體逐漸增大,神經(jīng)突起逐漸增粗,并互相聯(lián)絡(luò)成網(wǎng)。新生大鼠隔神經(jīng)元亦可持續(xù)培養(yǎng)3 個(gè)月。七新生大鼠下丘腦神經(jīng)元分散培養(yǎng)下丘腦，作為神經(jīng)系統(tǒng)和內(nèi)分泌系統(tǒng)的連接點(diǎn)，在神經(jīng)內(nèi)分泌研究中有很重要的地位。它不僅通過神經(jīng)-神經(jīng)，神經(jīng)體液通路與垂體發(fā)生直接的聯(lián)系，以興奮與抑制兩種不

19、同的機(jī)制維持垂體內(nèi)分泌的相對(duì)恒定，而且與腦干網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)、皮質(zhì)邊緣系統(tǒng)等共同調(diào)節(jié)機(jī)體的各種活動(dòng)。下丘腦的分泌功能以及其所分泌的各種肽類激素、神經(jīng)多肽是下丘腦參與調(diào)節(jié)內(nèi)臟活動(dòng)、生理機(jī)能以及垂體內(nèi)分泌的重要物質(zhì)基礎(chǔ)。1 材料和方法取當(dāng)天出生的Wistar大鼠,在無菌條件下取腦、分離出雙側(cè)下丘腦，培養(yǎng)方法同海馬神經(jīng)元培養(yǎng)。2 新生大鼠下丘腦神經(jīng)元的生長(zhǎng)分化和形態(tài)特征新生大鼠下丘腦神經(jīng)元的生長(zhǎng)分化和形態(tài)特征基本上和新生大鼠隔神經(jīng)元相似。培養(yǎng)的下丘腦神經(jīng)元大多為具有兩個(gè)突起的雙極神經(jīng)元，神經(jīng)元胞體呈橢圓形，直徑6-8科m,偶見胞體較大（直徑9-12m）的多極神經(jīng)細(xì)胞。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，下丘腦神經(jīng)元胞體逐漸

20、增大。下丘腦神經(jīng)元亦可維持培養(yǎng)2個(gè)月。八新生大鼠大腦皮層神經(jīng)元分散培養(yǎng)大腦皮質(zhì)是大腦半球最外表的一層灰質(zhì)，大腦皮質(zhì)內(nèi)神經(jīng)元的數(shù)量極大，其類型也很多，但均屬多極神經(jīng)元，神經(jīng)元之間具有復(fù)雜的聯(lián)系，反映皮質(zhì)的高度發(fā)展。有人從機(jī)能上將皮質(zhì)分為：感覺皮質(zhì)、聯(lián)絡(luò)皮質(zhì)、運(yùn)動(dòng)皮質(zhì)。1 材料和方法取當(dāng)天出生的Wistar大鼠,在無菌條件下取腦、分離出雙側(cè)皮層，培養(yǎng)方法同海馬神經(jīng)元培養(yǎng)。2 新生大鼠大腦皮層神經(jīng)元的生長(zhǎng)分化和形態(tài)特征新生大鼠皮層元的生長(zhǎng)分化和形態(tài)特征基本上和新生大鼠海馬神經(jīng)元相似。培養(yǎng)的皮層神經(jīng)元中既可見到體積較大（直彳58-12Wm）的錐體細(xì)胞和顆粒細(xì)胞（如星狀細(xì)胞、籃狀細(xì)胞和梭形細(xì)胞）,也可見

21、到馬提諾蒂細(xì)胞,胞體較小,呈三角形或多角形。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng),神經(jīng)元胞體逐漸增大,突起增粗。新生大鼠皮層神經(jīng)元亦可持續(xù)培養(yǎng)2個(gè)月。九新生大鼠紋狀體神經(jīng)元培養(yǎng)位于大腦皮質(zhì)下，緊靠丘腦背外側(cè)的幾塊灰質(zhì)，稱為基底神經(jīng)節(jié)，它們包括尾狀核、殼核和蒼白球，前兩者合起來又稱為紋狀體。紋狀體是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的高級(jí)部位，在這里進(jìn)行著運(yùn)動(dòng)機(jī)能的最高級(jí)整合，它們與隨意運(yùn)動(dòng)的穩(wěn)定、肌緊張和軀體運(yùn)動(dòng)的整合有密切關(guān)系。中腦黑質(zhì)除含有較多的多巴胺（DA）神經(jīng)元外，還含有丫-氨基丁酸（GABA神經(jīng)元等，紋狀體是其主要的靶組織，共同組成黑質(zhì)紋狀體DA系統(tǒng)。1 材料和方法取當(dāng)天出生的Wistar大鼠,在無菌條件下取腦、分離出雙側(cè)

22、紋狀體，培養(yǎng)方法同海馬神經(jīng)元培養(yǎng)。2 新生大鼠紋狀體神經(jīng)元的生長(zhǎng)分化和形態(tài)特征新生大鼠紋狀體神經(jīng)元的生長(zhǎng)分化和形態(tài)特征基本上和新生大鼠隔神經(jīng)元相似。培養(yǎng)的紋狀體神經(jīng)元大多為具有兩個(gè)突起的雙極神經(jīng)元，神經(jīng)元胞體呈橢圓形，直徑6-8科隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng),紋狀體神經(jīng)元胞體逐漸增大。紋狀體神經(jīng)元亦可維持培養(yǎng)2個(gè)月。十新生大鼠中腦黑質(zhì)神經(jīng)元培養(yǎng)黑質(zhì)由中腦背側(cè)的致密部和腹側(cè)的網(wǎng)狀部組成，中腦黑質(zhì)是多巴胺神經(jīng)元存在的部位，實(shí)驗(yàn)表明，大鼠中腦腹側(cè)多巴胺在運(yùn)動(dòng)和行為中起著關(guān)鍵性的作用。黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元退性病變可引起帕金森綜合癥。因此，多巴胺神經(jīng)元的體外培養(yǎng)為多巴胺神經(jīng)元的形態(tài)、受體分布、藥物作用、電生理特性的

23、研究以及多巴胺神經(jīng)元移植研究提供了較好的實(shí)驗(yàn)手段。1 材料和方法取當(dāng)天出生的Wistar大鼠,在無菌條件下取腦、分離出雙側(cè)黑質(zhì)，培養(yǎng)方法同海馬神經(jīng)元培養(yǎng)。2 新生大鼠中腦黑質(zhì)神經(jīng)元的生長(zhǎng)分化和形態(tài)特征新生大鼠中腦黑質(zhì)神經(jīng)元的生長(zhǎng)分化和形態(tài)特征基本上和新生大鼠下丘腦神經(jīng)元相似。培養(yǎng)的中腦黑質(zhì)神經(jīng)元大多為具有兩個(gè)突起的雙極神經(jīng)元，神經(jīng)元胞體呈橢圓形，直徑6-8科m,隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，中腦黑質(zhì)神經(jīng)元胞體逐漸增大。中腦黑質(zhì)神經(jīng)元亦可維持培養(yǎng)2個(gè)月。十一.新生大鼠小腦神經(jīng)神經(jīng)元培養(yǎng)小腦由外層的灰質(zhì)（皮質(zhì)）、內(nèi)部的白質(zhì)和三對(duì)深部的核團(tuán)（頂核、間位核和齒狀核）組成。與大腦皮質(zhì)相比，小腦皮質(zhì)的結(jié)構(gòu)和神經(jīng)元環(huán)

24、路的組成相對(duì)簡(jiǎn)單，整個(gè)小腦皮質(zhì)共有三層結(jié)構(gòu)：分子層、浦肯野細(xì)胞層和顆粒層。其中含有五種神經(jīng)元，即顆粒細(xì)胞，浦肯野細(xì)胞、籃狀細(xì)胞、星形細(xì)胞和高爾基細(xì)胞。小腦是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中最大的運(yùn)動(dòng)機(jī)構(gòu)，主要作用是維持軀體平衡，調(diào)節(jié)肌肉張力和協(xié)調(diào)隨意運(yùn)動(dòng)。小腦的另一個(gè)與運(yùn)動(dòng)有關(guān)的重要功能是在技巧性運(yùn)動(dòng)的獲得和建立過程中發(fā)揮運(yùn)動(dòng)學(xué)習(xí)的作用。在體外培養(yǎng)系統(tǒng)中，小腦細(xì)胞大小和形態(tài)的特征明顯，容易識(shí)別。另外，小腦缺陷神經(jīng)突變的小鼠種系比較多，這些條件都使小腦細(xì)胞成為發(fā)育研究的良好對(duì)象。1 材料和方法取當(dāng)天出生的Wistar大鼠,在無菌條件下取腦、分離出雙側(cè)小腦，培養(yǎng)方法同海馬神經(jīng)元培養(yǎng)。2 新生大鼠小腦神經(jīng)細(xì)胞的生長(zhǎng)分

25、化和形態(tài)特征新生大鼠小腦神經(jīng)元的生長(zhǎng)分化基本和新生大鼠皮層神經(jīng)元相似。培養(yǎng)的小腦神經(jīng)元以顆粒細(xì)胞為多見，體積較小，直徑3-5科m,亦可見到一定數(shù)量的星狀細(xì)胞，哺肯野細(xì)胞和籃狀細(xì)胞（胞體直徑6-8Wm）,它們均隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng),神經(jīng)元胞體逐漸增大,突起逐漸增粗。新生大鼠小腦神經(jīng)元亦可持續(xù)培養(yǎng)2個(gè)月。十二新生大鼠腦腺垂體細(xì)胞培養(yǎng)大鼠的垂體分為前、中、后三葉，前葉亦稱腺垂體，主要分泌生長(zhǎng)激素、催乳素、各種促激素及黑素細(xì)胞刺激素。因此建立體外培養(yǎng)腺垂體細(xì)胞的方法，可用來探討各種因素直接對(duì)細(xì)胞分泌功能的影響，以及開展神經(jīng)內(nèi)分泌分子生物學(xué)的研究。1 材料和方法取當(dāng)天出生的Wistar大鼠,在無菌條件下分

26、離出腺垂體，用0.125%胰蛋白酶消化（36、30min）分散后，用種植培養(yǎng)液（同第二節(jié)）稀釋成2乂106個(gè)細(xì)胞/ml密度的細(xì)胞液,接種于涂有小牛皮膠的35mm塑料培養(yǎng)皿中，每皿2ml,置標(biāo)本于36C,含10%CO勺培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。24h后頃去培養(yǎng)皿內(nèi)種植培養(yǎng)液,改用飼養(yǎng)培養(yǎng)液（同第二節(jié)）培養(yǎng)。以后每周換液2次,每次更換50%新鮮培養(yǎng)液。2 新生大鼠腦腺垂體細(xì)胞的生長(zhǎng)形態(tài)特征接種后24h,新生大鼠腦腺垂體分散細(xì)胞即開始貼附在膠元薄膜上生長(zhǎng),腦腺垂體細(xì)胞最初分散或聚集成小團(tuán),隨后迅速分裂增殖。細(xì)胞境界清楚,形狀不規(guī)則,有圓形,卵圓或多角形。核位于胞體中央或偏于胞體一側(cè),可見1-2個(gè)核仁。隨著培養(yǎng)時(shí)

27、間的延長(zhǎng),腦腺垂體細(xì)胞胞體逐漸增大,形成單層,鋪滿皿壁底層。腦腺垂體細(xì)胞可持續(xù)培養(yǎng)1個(gè)月。十三神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)（一）雪旺細(xì)胞雪旺細(xì)胞（Schwanncell,S。是外周神經(jīng)系統(tǒng)最主要的膠質(zhì)細(xì)胞，也是外周神經(jīng)的成髓鞘細(xì)胞；它形成髓鞘，或包裹軸突而不形成髓鞘。雪旺細(xì)胞的功能極其活躍，一旦神經(jīng)受損，它能反應(yīng)性分裂增殖，分泌神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì)和細(xì)胞粘附分子，對(duì)神經(jīng)元及其軸突起營(yíng)養(yǎng)和修復(fù)作用。近年來的研究表明，雪旺細(xì)胞也能促進(jìn)中樞神經(jīng)對(duì)脫髓鞘損傷的修復(fù)，如對(duì)脊髓的再生，對(duì)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)以及對(duì)隔-海馬通路再生等。說明雪旺細(xì)胞也能改善中樞神經(jīng)再生的微環(huán)境，因而近年來對(duì)雪旺細(xì)胞的研究，尤其是體外培養(yǎng)研

28、究已成熱點(diǎn)。1 材料和方法雪旺細(xì)胞培養(yǎng)取材于各類哺乳動(dòng)物的外周神經(jīng)和背根神經(jīng)節(jié)，取孵化8-12d雞胚、出生1-3d的小鼠或大鼠和人工流產(chǎn)的人胎兒，在無菌條件下用解剖鑷分離出神經(jīng)節(jié)，剝除神經(jīng)節(jié)被膜,用0.125%胰蛋白酶消化（3730min）后用培養(yǎng)液（90%DMEM，10%胎牛血清，2mM谷氨酰胺）吹打分散成細(xì)胞懸液，先接種于玻璃培養(yǎng)瓶中，于培養(yǎng)箱中孵育30min后，翻轉(zhuǎn)瓶子吸出細(xì)胞懸液，除去已貼壁的成纖維細(xì)胞，再接種于涂有鼠尾膠的35mmi料培養(yǎng)皿中，種植密度為0.2X105個(gè)細(xì)胞/ml,每皿2ml細(xì)胞懸液置。置36C、10%CO§養(yǎng)箱中培養(yǎng)。接種第3d,在培養(yǎng)皿中分別加入細(xì)胞分裂

29、抑制劑5-氟-2'-脫氧尿昔15g/ml和尿音35科g/ml,以進(jìn)一步去除成纖維細(xì)胞,作用48小時(shí)后更換新鮮培養(yǎng)液，以后每周換液兩次,每次更換一半新鮮飼養(yǎng)培養(yǎng)液。2 雪旺細(xì)胞的生長(zhǎng)和形態(tài)特征培養(yǎng)15d后可獲得較高純度的雪旺細(xì)胞，雪旺細(xì)胞呈雙極梭狀，核卵居中，相互平行排列，經(jīng)S-100免疫組織化學(xué)染色呈陽(yáng)性反應(yīng)。增殖分裂的雪旺細(xì)胞可用于進(jìn)一步傳代培養(yǎng)，也可進(jìn)行冷凍保存?zhèn)溆?。（二）星形膠質(zhì)細(xì)胞星形膠質(zhì)細(xì)胞是膠質(zhì)細(xì)胞中體積最大，數(shù)量最多的一種，胞體呈星形，核大，呈卵圓形，染色質(zhì)稀少，星形膠質(zhì)細(xì)胞分兩類，一類為原漿性星形膠質(zhì)細(xì)胞（protoplasmicastrocyte），其突起短粗，分枝多

30、。另一種為纖維性星形膠質(zhì)細(xì)胞（fibrousastrocyte），它的突起細(xì)長(zhǎng)，分枝少。纖維性星形膠質(zhì)細(xì)胞是與少突膠質(zhì)細(xì)胞源自同一前體細(xì)胞。星形膠質(zhì)細(xì)胞具有多種功能，中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)神經(jīng)元及其突起間的空隙幾乎全部由星形膠質(zhì)細(xì)胞充填，起結(jié)構(gòu)的支持作用，星形膠質(zhì)細(xì)胞的突起構(gòu)成血腦屏障，星形膠質(zhì)細(xì)胞能攝取和代謝某些神經(jīng)遞質(zhì)如丫-氨基丁酸等。調(diào)節(jié)局部神經(jīng)遞質(zhì)的濃度，使神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)能平穩(wěn)地發(fā)揮作用。還能吸收細(xì)胞間隙中過多的K+,為K+的存儲(chǔ)庫(kù)，通過調(diào)節(jié)K+的水平而影響神經(jīng)元的電生理活動(dòng)。星形膠質(zhì)細(xì)胞能合成和分泌大量神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，有維持神經(jīng)元生存和促進(jìn)神經(jīng)元突起生長(zhǎng)的作用，亦能分泌白細(xì)胞介素，腫瘤壞死因子和干擾

31、素等多種細(xì)胞因子，星形膠質(zhì)細(xì)胞有分裂能力，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后，星形膠質(zhì)細(xì)胞增生、肥大，填補(bǔ)缺損，形成膠質(zhì)瘢痕。（1）方法和結(jié)果選擇出生2d的SD大鼠，無菌條件下分離出大腦皮層，用0.125%胰蛋白酶消化（37C30min）后用培養(yǎng)液（90%DMEM10%胎牛血清，2mM谷氨酰胺）吹打分散成細(xì)胞懸液，先接種于玻璃培養(yǎng)瓶中，于培養(yǎng)箱中孵育30min后，翻轉(zhuǎn)瓶子吸出細(xì)胞懸液，除去已貼壁的成纖維細(xì)胞，再接種于涂有鼠尾膠的75cm2塑料培養(yǎng)瓶中，種植密度為1X105個(gè)細(xì)胞/cm：每瓶10ml細(xì)胞懸液置。置36C、10%COM養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每周換液2次，培養(yǎng)10-14h,細(xì)胞分為兩層，下一層為I型膠質(zhì)細(xì)胞

32、即原漿形膠質(zhì)細(xì)胞，上一層是O-2A前體細(xì)胞，根據(jù)兩類細(xì)胞貼壁能力的差異，以振蕩培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行分選，在37搖床上振蕩，16h（180r/min）O-2A2前體細(xì)胞可被搖下來，搖下來的細(xì)胞種植在涂有鼠尾膠的75mcm2塑料培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)液使用20%胎牛血清促進(jìn)O-2A前體細(xì)胞分化為II型膠質(zhì)細(xì)胞即纖維型膠質(zhì)細(xì)胞?？煞至言鲋车脑瓭{形膠質(zhì)細(xì)胞和纖維型膠質(zhì)細(xì)胞可用于進(jìn)一步傳代培養(yǎng)，也可進(jìn)行冷凍保存?zhèn)溆?。純度鑒定可用膠質(zhì)纖維酸性蛋白抗體（GFAP染色確定。（三）少突膠質(zhì)細(xì)胞1方法和結(jié)果少突膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)方法同星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)。少突膠質(zhì)細(xì)胞比星形膠質(zhì)細(xì)胞小，光鏡下少突膠質(zhì)細(xì)胞胞體呈圓形或多角形，突起呈串珠狀，根據(jù)其所在部位的不同可分為束間少突膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)元周圍少突膠質(zhì)細(xì)胞。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)，少突膠質(zhì)細(xì)胞主要形成及維持髓鞘。討論在神經(jīng)生理、生化和神經(jīng)藥理的研究中、神經(jīng)細(xì)胞的體外培養(yǎng)日益受到重視,因?yàn)樗茄芯繂蝹€(gè)神經(jīng)細(xì)胞功能和結(jié)構(gòu)的適宜方法。在體外培養(yǎng)條件下背根神經(jīng)節(jié)、頸上交感節(jié)、胚胎脊髓和不同腦區(qū)（海馬、隔、下丘腦、大腦皮層、小腦和垂體細(xì)胞等）培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)特征都不盡相同，這與它們具有不同功能有關(guān)。交感和感覺神經(jīng)元以及不同腦區(qū)神經(jīng)元的體外培養(yǎng)成功,為我們深入研究它們的結(jié)構(gòu)和功能提供了合適的體外實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?。在背根?jié)神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)過程中