新型發(fā)酵蔬菜制品乳酸菌發(fā)酵劑的篩選研究

1、第19卷 第3期 寧波大學(xué)學(xué)報(bào)(理工版V ol.19 No.3 2006年9月 JOURNAL OF NINGBO UNIVERSITY ( NSEE Sept. 2006收稿日期:2006-04-30.基金項(xiàng)目:國家星火計(jì)劃項(xiàng)目(2005EA701026;寧波市科研基金(2004C100037. 文章編號:1001-5132(200603-0316-05新型發(fā)酵蔬菜制品乳酸菌發(fā)酵劑的篩選研究劉 璞,翁佩芳,吳祖芳(寧波大學(xué) 生命科學(xué)與生物工程學(xué)院,浙江 寧波 315211摘要:從榨菜等一些自然腌制蔬菜制品中分離得到一些乳酸菌菌株,通過細(xì)胞形態(tài)及生理學(xué)特性觀察研究,初步篩選出Lactobaci

2、llus 8株菌株. 并進(jìn)一步通過發(fā)酵產(chǎn)酸和細(xì)胞生長比較實(shí)驗(yàn)得到3株乳酸菌菌株Lact .2,Lact .6和Lact .8,通過菌株間不同配比和發(fā)酵榨菜驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),最后確定了榨菜發(fā)酵制品的最適發(fā)酵劑為Lact .2和Lact .8,最佳配比為1:1. 關(guān)鍵詞:乳酸菌;分離;篩選;發(fā)酵;榨菜中圖分類號:Q939.11文獻(xiàn)標(biāo)識碼:A傳統(tǒng)的蔬菜腌制是利用高鹽濃度的滲透作用及乳酸菌在蔬菜中的生長代謝,主要是乳酸發(fā)酵作用,賦予腌菜特有的風(fēng)味. 但目前,浙江地區(qū)蔬菜腌制產(chǎn)品工藝依然停留在自然腌制發(fā)酵水平,發(fā)酵周期長,生產(chǎn)過程不易控制及易引起環(huán)境污染等一系列問題,腌制過程中的雜菌尤其是硝酸鹽還原菌,能夠產(chǎn)生

3、亞硝酸鹽等對人體有害的物質(zhì)1,導(dǎo)致腌菜企業(yè)難以實(shí)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化、規(guī)?；a(chǎn),直接影響企業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益和進(jìn)一步發(fā)展.由于蔬菜腌制加工中采用乳酸菌發(fā)酵技術(shù)對產(chǎn)品的營養(yǎng)價(jià)值、食用品質(zhì)及其產(chǎn)生的環(huán)境和經(jīng)濟(jì)效益等諸多方面帶來的顯著效果2,近年來,乳酸菌接種發(fā)酵工藝已引起腌菜企業(yè)的高度重視,通過接種一定量的乳酸菌發(fā)酵劑,發(fā)酵產(chǎn)酸使腌制發(fā)酵初期pH 迅速下降,抑制有害雜菌,尤其是抑制亞硝酸鹽還原菌等的生長,使發(fā)酵能夠正常進(jìn)行,并賦予制品濃郁的香味和豐富的營養(yǎng),因此,篩選出合適的乳酸菌發(fā)酵劑是亟待解決的首要問題. 本實(shí)驗(yàn)從常見的腌菜中篩選出發(fā)酵性能優(yōu)良的乳酸菌,考慮菌株間存在的互生作用,以一定比例混合配比,優(yōu)選新型乳

4、酸菌發(fā)酵劑,為其在榨菜等生產(chǎn)中的應(yīng)用創(chuàng)造有利條件.1 材料與方法1.1 材料 1.1.1 菌種分離源市售青菜頭、大白菜、卷心菜、蘿卜、冬瓜,實(shí)驗(yàn)室腌制. 1.1.2 培養(yǎng)基培養(yǎng)基1:蛋白胨10g ;牛肉膏10g ;瓊脂15g ;酵母提取物5g ;檸檬酸二銨2g ;葡萄糖20g ;碳酸鈣20g ;吐溫80 1ml ;K 2HPO 42g ;MgSO 4·7H 2O 0.58g ;MnSO 4·4H 2O 0.25g ;蒸餾水1000ml ;pH6.4,用于乳酸菌的分離與鑒定3.培養(yǎng)基2:液體MRS 培養(yǎng)基:蛋白胨10g ;酵第3期劉璞等:新型發(fā)酵蔬菜制品乳酸菌發(fā)酵劑的篩選研究

5、 317母提取物5g;檸檬酸二銨2g;葡萄糖20g;牛肉膏10g;吐溫80 1ml;K2HPO42g;MgSO4·7H2O 0.58g;MnSO4·4H2O 0.25g;蒸餾水1000ml; pH6.4,用于乳酸菌的活化及篩選.培養(yǎng)基3(蔬菜汁基礎(chǔ)培養(yǎng)基:番茄原汁30ml,加蒸餾水至100ml,蛋白胨1%,葡萄糖2%,pH6.8,用于乳酸菌的增殖培養(yǎng)4.1.2儀器與設(shè)備SPX型智能生化培養(yǎng)箱,寧波江南儀器廠; XLZ-107E顯微鏡;722光柵分光光度計(jì),上海精密科學(xué)儀器有限公司;pHS-25數(shù)顯pH計(jì),上海精密科學(xué)儀器有限公司;電熱手提式壓力蒸汽消毒器,寧波醫(yī)療器械廠;電

6、熱鼓風(fēng)干燥箱,重慶銀河試驗(yàn)儀器有限公司;Acculab ALC210.3電子天平, Acsulab公司.1.3方法1.3.1 乳酸菌的分離、鑒定取各樣品不同階段發(fā)酵液進(jìn)行梯度稀釋,傾注平板于37培養(yǎng)48h,挑取單個有溶鈣圈菌落純化,根據(jù)菌落特征進(jìn)行初步歸類,對革蘭氏染色陽性、無芽孢、接觸酶陰性菌株,進(jìn)一步進(jìn)行紙層析實(shí)驗(yàn)5,所確定乳酸菌菌株,編號,保存.1.3.2 菌株發(fā)酵性能測試將各菌種分別轉(zhuǎn)管活化數(shù)次,恢復(fù)活力,在250ml三角瓶中裝入100ml初始pH為6.4的MRS 液體培養(yǎng)基,然后再向此培養(yǎng)基中分別接種已活化的各菌種,接種量為2%,于37條件下培養(yǎng)24h,每隔3h取菌液,滴定酸度和pH

7、值,并以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo),以相應(yīng)的OD值、酸度和pH值為縱坐標(biāo),繪制曲線,初步選定產(chǎn)酸力強(qiáng)、生長穩(wěn)定的菌株為發(fā)酵實(shí)驗(yàn)菌.1.3.3 發(fā)酵劑的優(yōu)選混合配比實(shí)驗(yàn):對所篩選的發(fā)酵菌種以液體MRS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)進(jìn)行混合配比實(shí)驗(yàn),以細(xì)胞濃度(OD值和pH為考察指標(biāo),繪制混合菌株OD值和pH隨時(shí)間變化曲線,得出發(fā)酵劑的菌株的組成及最適配比.初步發(fā)酵實(shí)驗(yàn):選擇新鮮、大小適中的青菜頭經(jīng)清洗、修剪,入壇壓實(shí),加入8%的無菌鹽水,從以上實(shí)驗(yàn)中篩選的發(fā)酵劑進(jìn)行接種(接種量2%,作為接種發(fā)酵組;相同條件下不接種,作為自然發(fā)酵組;于室溫(25發(fā)酵,菜水鹽度平衡時(shí)為發(fā)酵成熟,進(jìn)行感觀評定,判斷腌制榨菜的風(fēng)味品質(zhì).1.3.4

8、 分析方法細(xì)胞濃度測定(光密度法:用722分光光度計(jì)在波長600nm處測定培養(yǎng)液的光密度6.pH值測定:用pHS-25數(shù)顯pH計(jì)直接測定.產(chǎn)酸率:以酚酞為指示劑,用0.1N的氫氧化鈉溶液滴定,結(jié)果以乳酸百分含量表示:乳酸(% =(N NaOH V NaOH×0.09/V樣品×1007.感觀評定8:感觀評定人員為10人,均為學(xué)表1 分離菌株形態(tài)特征菌落形態(tài)菌體形態(tài)編號大小/mm 顏色表面大小/m 菌體形態(tài),排列染色結(jié)果來源Lact.1 0.2-0.7 乳白光滑 0.5-0.8 球形或卵圓形,一般成對G+青菜頭Lact.2 0.5-2 灰白濕潤光滑 0.5-1 球棒狀,單個、成

9、對或成鏈G+大白菜Lact.3 <1 灰白濕潤光滑 0.8-1×1-2球桿狀,單個或成對G+大白菜Lact.4 0.2-1 灰白濕潤光滑 0.6-1 球形或球桿狀,單個或成對G+卷心菜Lact.51-2乳白光滑 0.6-1 球形,一般成對,有時(shí)短鏈G+卷心菜Lact.6 0.5-1 灰白表面發(fā)暗 0.5×1 球桿狀,單個或成對G+蘿卜Lact.7 0.1-0.2 灰白表面發(fā)暗 0.5×1-2 短桿狀,成對或成鏈G+蘿卜Lact.8 0.5-1.5 乳白光滑 0.5×0.8-1 短桿樁,一般成對G+冬瓜318 寧波大學(xué)學(xué)報(bào)(理工版 2006習(xí)過食品感

10、觀評定的師生. 取榨菜樣品,切片后,攤開,分別對色澤、形態(tài)、風(fēng)味和質(zhì)地進(jìn)行評定,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行打分,評分標(biāo)準(zhǔn)為:色澤及形態(tài)30分,香氣30分,質(zhì)地40分.2 結(jié)果與討論2.1 菌種分離、鑒定從5種腌制原料中初步分離出菌株15株,經(jīng)革蘭氏及芽孢染色鏡檢、接觸酶反應(yīng),篩選出8株革蘭氏染色陽性、無芽孢、接觸酶陰性菌株,經(jīng)乳酸紙層析定性分析均為乳酸菌菌株. 其形態(tài)學(xué)特征見表1.2.2 菌株發(fā)酵性能測試 2.2.1 菌株生長曲線通過測定各菌株發(fā)酵培養(yǎng)過程中培養(yǎng)液的OD 值變化,依據(jù)菌株各自的生長趨勢,分析比較菌株的生長量和生長速度. 由圖1菌株24h 的OD 值變化,可以看出,Lact .8、Lact .

11、1菌株生長快,菌體密度大,生長也較穩(wěn)定,14h 左右進(jìn)入平穩(wěn)期,生長周期相對較長. 其次,Lact .6相對生長較快,菌體密度較大,生長比較穩(wěn)定,約12h 進(jìn)入平穩(wěn)期;而Lact .2生長周期相對較短,菌體密度較小,在10h 左右進(jìn)入平穩(wěn)期,生長穩(wěn)定;其他菌株則均在14h 左右進(jìn)入平穩(wěn)期,生長狀況穩(wěn)定. 2.2.2 菌株pH 及酸度變化曲線菌株培養(yǎng)液的酸度及pH 變化情況,可以直觀地反映出各菌株的產(chǎn)酸速度和產(chǎn)酸量大小. 由圖2及圖3可知,各菌株產(chǎn)酸曲線隨時(shí)間變化均呈上升趨勢,產(chǎn)酸量不斷增加,在生長過程中,乳酸菌快速繁殖產(chǎn)酸,使發(fā)酵液的pH 值迅速下降,從而可抑制其他有害微生物的活動,其中Lac

12、t .8產(chǎn)酸量最高,產(chǎn)酸速度快,其次是Lact .6,產(chǎn)酸速度較快,它們可以在發(fā)酵初期就占優(yōu)勢,使pH 迅速下降;而Lact .2雖產(chǎn)酸量較低,但是可以防止產(chǎn)品后期過酸,促進(jìn)戊糖發(fā)酵,對產(chǎn)品后熟風(fēng)味有利3. 因此,分別選擇Lact .8、Lact .6與Lact .2菌株作為發(fā)酵劑的菌株組成,在抑制雜菌同時(shí),又可增加制品風(fēng)味. 2.3 混合菌株發(fā)酵配比的確定以發(fā)酵溫度為37,接種量2%,發(fā)酵液體MRS 培養(yǎng)基,Lact .2與Lact .6、Lact .2與Lact .8種間比為0:1,1:0,1:1,1:2,2:1,pH 值和OD 值隨時(shí)間變化曲線如圖4-7所示.由圖4、5可知,在相同培養(yǎng)條

13、件下,2菌株共同培養(yǎng)后,菌體密度和產(chǎn)酸量都比任何菌種單獨(dú)培養(yǎng)要高,尤其,在相同培養(yǎng)條件下,當(dāng)菌種之間的配比為1:2時(shí),發(fā)酵初期,其產(chǎn)酸和OD 值很明顯都比其他配比要高,這說明這2種菌共同培養(yǎng)并無拮抗效應(yīng),而是利用混合菌種在培養(yǎng)過程中的互生作用,使之能更加充分地利用現(xiàn)有的碳源和氮源,使乳酸積累量增高,促進(jìn)菌株生長代謝3. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,Lact .2與Lact .6的2種菌組合生產(chǎn)發(fā)酵劑要優(yōu)于單一菌種,最佳配比為1:2.從圖6和圖7可以看出,發(fā)酵初期,約從發(fā)酵 圖1 OD 值隨培養(yǎng)時(shí)間變化曲線 圖2 pH 值隨培養(yǎng)時(shí)間變化曲線 圖3 發(fā)酵過程酸度變化曲線 第3期 劉 璞等:新型發(fā)酵蔬菜制品乳酸菌

14、發(fā)酵劑的篩選研究 319開始到8h ,混合配比發(fā)酵產(chǎn)酸速度、產(chǎn)酸量均有優(yōu)勢,可以迅速使環(huán)境pH 下降,抑制雜菌生長,而且后期不致使酸度過酸,采用混合菌種發(fā)酵,尤其是同型發(fā)酵菌與異型發(fā)酵菌混合發(fā)酵,可使產(chǎn)品風(fēng)味更突出9. 經(jīng)多次實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證,結(jié)果一致,均顯示出以1:1與2:1效果較好,其中1:1比2:1略有優(yōu)勢,最后選擇1:1為最佳菌株配比. 表2 腌制榨菜風(fēng)味比較試驗(yàn)組 感觀評分主要風(fēng)味特點(diǎn) 自然發(fā)酵 82 微黃色,有明顯發(fā)酵香味,脆,酸咸適中 Lact .280 黃色,香味較淡,較軟,偏咸Lact .677 黃色,香氣不足,較脆,偏酸Lact .8 79 黃色,香氣不足,較脆,偏酸Lact .2

15、: Lact .8(1:185 微黃色,發(fā)酵香味濃郁,脆嫩,酸咸適中 Lact .2: Lact .6(1:283微黃色,有發(fā)酵香氣,脆,酸咸適中2.4 榨菜發(fā)酵試驗(yàn)通過上述試驗(yàn)得到的2組較優(yōu)配比Lact .2: Lact .6(1:2和Lact .2:Lact .8(1:1,進(jìn)一步以榨菜為發(fā)酵基質(zhì),進(jìn)行接種發(fā)酵試驗(yàn)和產(chǎn)品感觀評定比較,并以單菌種為發(fā)酵對照,見表2. 試驗(yàn)結(jié)果表明,單菌種發(fā)酵風(fēng)味不及混合菌種發(fā)酵,混合發(fā)酵劑發(fā)酵后榨菜產(chǎn)品在風(fēng)味和脆感上與自然發(fā)酵質(zhì)量相 圖4 Lact .2與Lact .6混合發(fā)酵OD 值變化圖5 Lact .2與Lact .6混合發(fā)酵pH 值變化 圖6 Lact

16、 .2與Lact .8混合培養(yǎng)OD 值曲線圖7 Lact .2與Lact .8混合發(fā)酵pH 值變化 320 寧波大學(xué)學(xué)報(bào)(理工版 2006當(dāng),質(zhì)量更穩(wěn)定,其中Lact.2:Lact.8(1:1組合發(fā)酵感觀評定略優(yōu)于Lact.2:Lact.6(1:2組合,故最后選擇Lact.2:Lact.8=1:1作為發(fā)酵劑.3結(jié)論(1從榨菜等腌制原料中分離出8株乳酸菌菌株,從產(chǎn)酸及發(fā)酵風(fēng)味角度分析,確定了Lact.8、Lact.6和Lact.2為混合發(fā)酵用菌株.(2由Lact.6或Lact.8與Lact.2的混合配比實(shí)驗(yàn),通過產(chǎn)酸及生長性能比較,得出最佳發(fā)酵劑菌株配比為Lact.2:Lact.6(1:2和La

17、ct.2:Lact.8(1:1.(3由混合菌株發(fā)酵劑通過榨菜腌制和感觀評定結(jié)果,兩者風(fēng)味與自然發(fā)酵氣味和脆感相當(dāng),質(zhì)量更穩(wěn)定,經(jīng)綜合比較,最后選擇Lact.2:Lact.8(1:1為榨菜發(fā)酵腌制用發(fā)酵劑.參考文獻(xiàn):1陳有容, 楊鳳瓊. 降低腌制蔬菜亞硝酸鹽含量方法的研究進(jìn)展J. 上海水產(chǎn)大學(xué)學(xué)報(bào), 2004, 13(1:67-70. 2吳祖芳, 劉璞, 翁佩芳. 榨菜加工中乳酸菌技術(shù)的應(yīng)用及研究進(jìn)展J. 食品與發(fā)酵工業(yè), 2005, 31(8:73-76. 3趙玲艷, 鄧放明, 楊撫林. 自然發(fā)酵辣椒中優(yōu)良乳酸菌的分離與鑒定J. 食品研究與開發(fā), 2004, 25(3:105- 108.4賀稚

18、非, 向瑞璽, 李洪軍, 等. 橄欖菜直投式乳酸菌發(fā)酵劑的研究J. 四川食品與發(fā)酵, 2005(1:1-6.5周德慶. 微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)手冊M. 上海: 上?？茖W(xué)技術(shù)出版社, 1986.6曹方, 何連芳, 劉茵. 乳酸菌在腌制酸菜中最適發(fā)酵條件的研究J. 中國調(diào)味品, 2003(6:26-30.7楊曉暉, 籍保平, 李博, 等. 泡菜中優(yōu)良乳酸菌的分離鑒定及其發(fā)酵性能的研究J. 食品科學(xué), 2005, 26(50: 130-134.8黃業(yè)傳, 曾凡坤. 榨菜葉酸菜發(fā)酵劑的選擇J. 食品與機(jī)械, 2004, 20(1:5-7.9沈國華, 盧英, 何丁喜, 等. 純菌接種發(fā)酵技術(shù)在腌漬蔬菜加工上的應(yīng)用

19、研究(二純菌接種發(fā)酵技術(shù)最佳發(fā)酵模式的確定與應(yīng)用J. 中國調(diào)味品, 2002(6:24- 36.Screening Lactic Acid Bacteria Starter for New Type of Fermented Vegetable ProductsLIU Pu, WENG Pei-fang, WU Zu-fang(Faculty of Life Science and Biotechnology, Ningbo University, Ningbo 315211, ChinaAbstract:Some strands of lactic acid bacteria were obtained by separating from some natural pickled vegetable products, such as pickled mustard tuber, etc. From observing cell char