含萘環(huán)結(jié)構(gòu)的手性Salen-Mn(III)配合物與DNA的相互作用-

1、含萘環(huán)結(jié)構(gòu)的手性Salen-Mn(III配合物與DNA的相互作用11彭斌1,巢暉2,計亮年21湖南科技大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院,湖南湘潭(4112012中山大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院,廣東廣州(510275E-mail: bpeng摘要:合成了含萘環(huán)結(jié)構(gòu)的手性Salen-Mn(III配合物,Mn(IIIL+Cl (L = N,N- bis- (2- hydroxynaphthalene-1-carbaldehyde-(1R,2R-(-diaminocyclohexane (R 和N,N-bis- (2 - hydroxynaphthalene-1-carbaldehyde-(1S,2S-(+- diamino-

2、 cyclohexane (S ,運用紫外光譜滴定和粘度實驗,研究了配合物與DNA 的插入作用。并通過凝膠電泳觀察了配合物對pBR322 DNA的斷裂情況,結(jié)果表明配合物以插入模式與DNA結(jié)合,呈現(xiàn)出手性差異;在H2O2存在下,配合物能夠使pBR322 DNA斷裂。關(guān)鍵詞:錳配合物;Salen配體;DNA 作用中圖分類號:O611.31.引言近幾十來,過渡金屬配合物與DNA的相互作用受到很大的關(guān)注1-4,這些配合物涉及了多種形式,如:金屬-卟啉、金屬-多吡啶、金屬-大環(huán)和金屬-Salen配合物等5-7。這些配合物可以通過多種模式(插入、靜電、溝面結(jié)合等與DNA結(jié)合,其中插入模式能夠較明顯的引起

3、體系的一系列物化性質(zhì)的改變,對于發(fā)展DNA探針、足跡試劑以及化學(xué)核酸酶都是很有意義的8,9。近些年來,過渡金屬配合物與DNA的非共價結(jié)合的研究,在多吡啶和卟啉方面做了大量的工作,發(fā)現(xiàn)很多配合物具有插入DNA并使其斷裂的能力。相對而言,在Salen-金屬配合物方面的工作相對較少,研究發(fā)現(xiàn),Salen與一些過渡金屬形成的配合物在氧化/還原劑的存在下,也能夠斷裂DNA10。Dennis J. Gravert 和 John H. Griffin 11-12合成了一些含有手性的金屬錳(III的配合物,發(fā)現(xiàn)它們在與DNA作用時,不但有空間選擇性,而且還具有手性選擇性。不過,這些配合物的配體基本是以苯環(huán)為剛

4、性平面,插入DNA堿基面中的能力不強,主要以溝面結(jié)合為主。我們設(shè)想如果以萘環(huán)代替苯環(huán),擴大相應(yīng)的芳香剛性平面,有可能使Salen-金屬配合物與DNA的作用具有新的性質(zhì)。在本文中,合成了含萘環(huán)結(jié)構(gòu)的手性Salen-Mn(III配合物,Mn(IIIL+Cl (L = N,N- bis-(2-hydroxynaphthalene-1-carbaldehyde-(1R,2R-(-diaminocyclohexane (R 和N,N-bis-(2-hydroxynaphthalene-1-carbaldehyde-(1S,2S-(+- diamino- cyclohexane (S ,并通過光譜、粘度測

5、定等方法研究配合物與DNA的作用,通過凝膠電泳觀察了配合物對pBR322 DNA的斷裂情況,結(jié)果表明配合物以插入模式與DNA結(jié)合,呈現(xiàn)出手性差異;在H2O2存在下,配合物能夠使pBR322 DNA斷裂。2. 實驗部分2.1 實驗材料小牛胸腺DNA(CT-DNA,BR,華美生物工程公司;pBR 322 DNA,BR,上海生工1本課題得到國家自然科學(xué)基金(20771105和湖南科技大學(xué)科研啟動基金資助。生物工程公司;溴化乙錠(EB,AR級,Fluka公司產(chǎn)品;瓊脂糖,高強度DNA級,進(jìn)口分裝。(1R, 2R-(-1,2-diaminocyclohexane 和 (1S,2S-(+-1,2-diam

6、inocyclohexane。其它試劑和溶劑均為分析純產(chǎn)品。配體和配合物的合成路線見圖1。CHO+2H2 2CH3CH2OH50o C2hr reflux2+圖1 配體和配合物合成路線圖2.2 配體和配合物的合成Salen配體的合成參照文獻(xiàn)12進(jìn)行。在圓底燒瓶中放入0.85克(5 mmol2-hydroxy-1-naphthaldehyde,加入無水乙醇(10 ml,溫?zé)?使萘醛完全溶解。在攪拌下,滴加(1R, 2R-(-1,2-diaminocyclohexane 或(1S,2S- (+ -1,2-diaminocyclohexane 的乙醇溶液(0.064克,1.06 mmol樣品溶于10

7、 ml無水乙醇中,溶液逐漸變成橙黃色,并有黃色沉淀生產(chǎn),繼續(xù)攪拌1小時,冷卻到室溫后,過濾,真空干燥,用氯仿-乙醇重結(jié)晶,得到黃色針狀晶體:N,N-bis-(2-hydroxynaphthalene-1- carbaldehyde -(1R,2R-(-diaminocyclohexane (Salen R和N,N-bis-(2- hydroxynaphthalene -1- carbaldehyde - (1S,2S-(+- diaminocyclohexane (Salen S。產(chǎn)率:75%。元素分析:Found: C, 79.68; H, 6.31; N, 6.62。Calc. For C

8、28H26N2O2: C, 79.59; H, 6.20; N, 6.63%. ES-MS: m/z = 423 (M+1。 IR (KBr, /cm-1: 3011(m,2944(s,2863(m,1628(s,1602(sh,1547(m,1526(w, 1493(w,1479(w,1451(w,1403(m,1367(sh,1350(m,1314(m,1246 (m,1187(m,1143(m,1094(m,1035(w,860(m,828(m。1H NMR (ppm, CDCl3: 14.66( s , 2H , OH, 6.85(dd, 2H , ArH , 7.52(dd, 2H

9、, ArH, 7.45(dd, 2H , ArH,7.13(dd, 2H , ArH, 7.30(dd, 2H , ArH, 7.72(dd, 2H, ArH, 8.75(s, 2H , CH=N, 3.41(s,Chiral-2H, 2.10-1.49(m , 8H , CH2。配合物的合成參照文獻(xiàn)13,14進(jìn)行。在氬氣保護(hù)下,將配體(0.12 g, 0.27 mmol溶于5 ml丙酮中,然后滴加氫氧化鈉的乙醇溶液(0.02 g, 0.54 mmol,15分鐘后,加入Mn(OAc2·4H2O (0.134 g, 0.54 mmol,回流,攪拌1.5小時后,停止氬氣,加入LiCl (

10、0.104 g, 0.54 mmol,然后向溶液中鼓入空氣,繼續(xù)反應(yīng)30分鐘。冷卻,旋蒸掉部分溶劑,加入25 ml 冷水,過濾沉淀,用冷水、丙酮和乙醇洗滌,真空干燥。用乙醇重結(jié)晶,得到Mn(IIIL+Cl棕色粉末,產(chǎn)率:50%。元素分析:Found: C, 65.71; H, 4.65; N, 5.52。Calc. For C28H24N2O2MnCl: C, 65.83; H, 4.73; N, 5.48. ES-MS: m/z = 475 (M-Cl. IR (KBr, /cm-1: 3436(m, 2933(w, 1617(s, 1603(s, 1540(m, 1508(w, 1452(

11、w,1431(w, 1393(m, 1339(s, 1307(m, 1214(w, 1189(m, 1144(w,1095(w, 981(m, 830(m,759(m, 569(s。2.3 DNA 結(jié)合實驗2.3.1 紫外光譜滴定參比池和樣品池中分別加入3 mL的緩沖液和20 µM 的配合物溶液,分次向參比池和樣品池中分別加入相同體積的DNA母液,使DNA 與配合物濃度比值DNA/Ru按一定的比例遞增,直至扣除稀釋效應(yīng)后吸收峰不再減色。每次混和均勻約5分鐘后,在200800 nm范圍記錄樣品的紫外可見光譜。2.3.2 粘度實驗DNA樣品的粘度使用烏氏粘度計測量。測量粘度時,溫度恒定在

12、28.0 (± 0.1°C。相對粘度按 = ( t t0/t0計算,t0為緩沖液流經(jīng)毛細(xì)管所需的時間,t為DNA樣品(含濃度不等的配合物流經(jīng)毛細(xì)管所需的時間。以(/01/3對r(r = Ru/DNA作圖。0為不含配合物的DNA樣品的相對粘度。2.3.3 瓊脂糖凝膠電泳實驗電泳反應(yīng)液是由Tris緩沖溶液配制。向含有pBR 322 DNA的溶液中加入一定濃度的配合物溶液,1 mM H2O2過氧化氫,混勻,使反應(yīng)液的終體積保持在10 µL。37下恒溫培育5 h 后,加入溴酚蘭溶液使反應(yīng)終止。最后將此電泳反應(yīng)液在5 × TBE電泳緩沖液中,1 %的瓊脂糖凝膠平板

13、上,于70 V,50 mA的恒壓恒流下電泳,然后以0.5 µg/ml溴化乙錠為顯色劑,用Kodak DC 40/120凝膠自動成像分析系統(tǒng)分析產(chǎn)物。3. 結(jié)果和討論3.1 電子吸收光譜滴定吸收光譜是研究配合物與DNA作用最常用的方法之一。通常,配合物與DNA結(jié)合后,其電子結(jié)構(gòu)會受到DNA的微擾,導(dǎo)致配合物的紫外可見光譜發(fā)生一系列的變化,對于不同類型的配合物或同類型的配合物不同結(jié)合方式,吸收光譜的變化程度不同。一般來講,當(dāng)小分子配合物以插入模式與DNA作用時,其吸收光譜會出現(xiàn)一定的減色效應(yīng)和峰位紅移現(xiàn)象。這是因為插入配體與DNA的堿基對發(fā)生電子堆積后,使其*空軌道與堿基的電子軌道發(fā)生偶

14、合,能級下降,從而導(dǎo)致*躍遷能減小,產(chǎn)生紅移現(xiàn)象。同時,偶合后的軌道因部分填充電子,使躍遷幾率減小,產(chǎn)生減色效應(yīng)。 A b s o r b a n c eWavelenth/nmA b s o r b a n c eWavelenth/nm圖2 配合物與DNA 作用的紫外光譜滴定圖圖2是配合物Salen R (a 和配合物Salen S (b在滴加DNA 前后的電子吸收光譜圖,隨著DNA 濃度的增加,配合物R 、配合物S 的吸收光譜均出現(xiàn)了明顯的減色效應(yīng), 當(dāng)DNA/Mn 比率為13時,配合物R 的332 nm 峰減色約39.3%。對于配合物S ,在相同條件下,其332 nm 峰約減色32.6

15、%。該光譜變化特征表明配合物可能以插入方式與DNA 作用,與其它一些Salen 配合物(以苯環(huán)為基本結(jié)構(gòu)的變化是不同的15,16。另外,從圖中看出,配合物S 與DNA 作用似乎弱于配合物R 。為了定量比較配合物與DNA 的結(jié)合強弱,通過電子吸收光譜滴定實驗,以配合物在332 nm 的吸光度的變化,按下列方程式17分別算出配合物與DNA 作用的結(jié)合常數(shù)K (見圖2中的小插圖。DNA/(a - b = DNA/(a - f + 1/Kb (b - f 式中DNA代表DNA 的濃度,a ,f 和b 分別代表在各DNA 濃度下的、游離的和與DNA 結(jié)合飽和時配合物的摩爾吸光系數(shù)。Kb 可由擬合直線與y

16、 軸相交的截距求得。計算結(jié)果為:配合物R 的為(1.26 ± 0.12 × 104 M -1,而配合物S 的為 (1.09± 0.13 × 104 M -1。配合物R 與DNA 的結(jié)合常數(shù)略大于配合物S 。此結(jié)果表明,Salen 的手性橋接基團(tuán)對配合物與DNA 的結(jié)合有影響。3.2 配合物與DNA 相互作用的粘度研究為了進(jìn)一步分析配合物與DNA 的作用形式,我們做了粘度測量。在缺少晶體結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)的條件下,粘度測試是檢測配合物與DNA 以何種模式結(jié)合的最有效的方法,其結(jié)果比光譜數(shù)據(jù)更具說服力36。將配合物R 、S 分別加入到DNA 溶液后,引起的DNA 粘度

17、的變化情況表示于圖4.5中。 (/01/3Mn/DNA圖4 配合物對DNA 粘度的影響從圖中可見,隨著兩個配合物的濃度增加,DNA 的粘度也是逐步升高,再次說明配合物以插入模式與DNA 結(jié)合。從DNA 粘度的增加幅度看,配合物R >配合物S ,這也反映了它們與DNA 的結(jié)合強度,與前面的電子吸收光譜滴定實驗得到的結(jié)果一致。3.3 凝膠電泳法研究配合物對質(zhì)粒DNA 的斷裂反應(yīng)凝膠電泳是研究核酸和蛋白質(zhì)等生物大分子的一項重要技術(shù),因為其操作簡單、快速和靈敏等優(yōu)點,而成為分離鑒定和提純核酸的首選方法,在斷裂DNA 實驗中主要用到此方法。對不同構(gòu)型的DNA ,在電泳中的遷移率是不同的,質(zhì)粒DNA

18、 中存在的三種構(gòu)型。其中共價閉環(huán)的超螺旋Form I 的結(jié)構(gòu)最為緊密,遷移率最大,走在最前面。線形的Form III 走在其次。而開環(huán)缺刻的Form II 由于結(jié)構(gòu)比較松散,走在最后面。作者觀察了Salen -Mn 配合物在37下溫育5個小時及過氧化氫存在下對DNA 的斷裂情況,發(fā)現(xiàn)這兩個配合物都可以將pBR 322 DNA 有form I 轉(zhuǎn)化為form II ;而只有過氧化氫存在時,沒有觀察到DNA 的明顯斷裂。說明Salen -Mn 在氧化劑存在下,表現(xiàn)出化學(xué)核酸酶活性。同時,我們注意到,這兩個配合物在斷裂pBR 322 DNA 時,并沒有表現(xiàn)出明顯的手性差異(圖5。圖5 配合物和H 2

19、O 2存在下,pBR322 DNA 的凝膠電泳圖Lane 0, DNA alone; Lane 1, DNA + H 2O 2 (1 mmol/L; lane 2, 3, 6, DNA + H 2O 2 + complex R : 20, 40, 80mol/L; lane 4, 5, 7, DNA + H 2O 2 + complex S : 20, 40, 80 mol/L.4. 結(jié)論合成了含萘環(huán)結(jié)構(gòu)手性橋接基團(tuán)的Mn -Salen 配合物,運用吸收光譜、粘度法和凝膠電泳實驗研究了配合物與DNA 的相互作用。實驗結(jié)果指出這些配合物能夠與DNA 通過插 入模式結(jié)合，這兩個配合物與 CT DN

20、A 的結(jié)合存在顯著的手性差異，說明 Salen 的橋接基團(tuán) 對配合物與 DNA 的結(jié)合是有影響的。此外，這兩個配合物在氧化劑 H2O2 存在下，能夠使 將 pBR 322 DNA 由 form I 轉(zhuǎn)化為 form II。 參考文獻(xiàn) 1. J.K. Barton, Comments Inorg. Chem. 3 (1985 321-348. 2 P.G. Schultz, J.S. Taylor, P.B. Dervan, J. Am. Chem. Soc. 104 (1982 6861-6863. 3 M. Gielen, E.R.T. Tiekink (Eds., Metallothera

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