表皮生長因子受體單克隆抗體抗肺癌作用的研究

1、    表皮生長因子受體單克隆抗體抗肺癌作用的研究        摘要：目的實驗觀察表皮生長因子受體單克隆抗體(EGFR McAb)egf/r3對肺癌的治療作用。方法體外細(xì)胞增殖抑制實驗采用MTT法，裸鼠體內(nèi)移植瘤采用同時治療(T1組)與延后治療(T2組)兩種方案。結(jié)果egf/r3 McAb對高表達(dá)EGFR的SPC-A1和A549肺癌細(xì)胞體外均具有增殖抑制作用，并呈劑量依賴性；以SPC-A1進行裸鼠皮下移植做體內(nèi)實驗，至治療結(jié)束，T1組50 %成瘤(3/6)，對照組100 %

2、成瘤(6/6)；至實驗結(jié)束，T1組與T2組瘤體抑制率分別為75 %與67 %，瘤重抑制率分別為65 %與47 %。病理切片顯示治療組腫瘤組織局部壞死，電鏡示線粒體凝縮、嵴斷裂、溶解。結(jié)論egf/r3 McAb部分抑制肺癌細(xì)胞成瘤，明顯延緩已成瘤肺癌生長，具有一定的抗肺癌作用。其體內(nèi)抗瘤效果強于體外，可能與宿主免疫系統(tǒng)參與瘤細(xì)胞溶解有關(guān)。關(guān)鍵詞：肺腫瘤；表皮生長因子受體；單克隆抗體；免疫治療中分類號：R73-362文獻標(biāo)識碼：A文章編號：1000-7431(2000)01-0035-03EFFICACY OF EPIDERMAL GROWTH FACTORRECEPTOR ANTIBODY AG

3、AINST LUNG CANCER IN VITRO AND IN NUDE MICEREN Xin-ling（Department of Respiratory Disease,Xijing Hosptial,Fourth Military Medical University,Xian 710032,China）SHEN Li-ying（Department of Respiratory Disease,Xijing Hosptial,Fourth Military Medical University,Xian 710032,China）JIN Bo-quan（Department of

4、 Respiratory Disease,Xijing Hosptial,Fourth Military Medical University,Xian 710032,China）Abstract：ObjectiveTo investigate the effect of epidermal growth factor receptor (EGFR) monoclonal antibody (McAb egf/r3) against lung cancer.MethodsInhibition of cell growth in vitro was observed by MTT assay.

5、The effect of antibody on growth of tumor xenografts in nude mice was investigated with group T1 treating at the time of tumor inoculation and group T2 treating of established tumors. ResultsThe egf/r3 McAb inhibited the cell growth dose-dependently on both lung cancer cell lines SPC-A1 and A549.At

6、the end of treatment 50 %(3/6) sites in group T1 were tumor free,while 100 %(6/6) sites in control group had tumor forming. At the end of experiment,the inhibition rates of tumor size and of tumor weight in group T1 were 75 % and 65 % respectively, and in group T2 were 67 % and 47 % respectively. Pa

7、thologic examination showed that the treated tumor was necrosed.Under electronic microscope,the mitochondria appeared condensed and its creases disappeared.ConclusionThese results suggested that the antibody could partly inhibit lung cancer formation, retard the growth of cancer cells. The antibody

8、was found to have substantially a better antitumor activity in vivo than that in vitro,it is perhaps due to the supplementary host immune functions by the IgG2a McAb.Key words：Lung cancerEpidermal growth factor receptorMonoclonal antibodyImmunotherapy肺癌細(xì)胞的無限增殖是一個復(fù)雜的生物學(xué)過程，其機理尚未完全闡明。近年來，有關(guān)表皮生長因子受體(epi

9、dermal growth factor receptor,EGFR)研究工作主要在乳腺癌、卵巢癌、陰道上皮癌以及頭頸部腫瘤等惡性組織中進行，結(jié)果表明EGFR的過度表達(dá)與某些腫瘤的發(fā)生和預(yù)后不良有關(guān)1，國外應(yīng)用EGFR單克隆抗體(EGFR McAb)開展的腫瘤實驗性治療也多是在上述腫瘤中進行。肺癌存在EGFR的過度表達(dá)，但是就EGFR與肺癌的發(fā)生、發(fā)展、預(yù)后以及組織特異性的關(guān)系等諸多方面尚未達(dá)成共識2，尤其是針對EGFR的肺癌治療研究報道甚少。作者曾應(yīng)用流式細(xì)胞儀分析肺癌細(xì)胞株EGFR的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)肺癌細(xì)胞系存在EGFR的表達(dá)，并可能存在著生長因子自分泌環(huán)，提示EGFR及其配體在肺癌的發(fā)生發(fā)

10、展中可能發(fā)揮了重要的調(diào)控作用。為此，作者應(yīng)用egf/r3 McAb進一步開展了體外及裸鼠體內(nèi)抗肺癌作用的實驗研究，為探索肺癌分子免疫治療的新途徑積累資料。材料和方法一、肺癌細(xì)胞系、實驗動物及主要試劑肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549和SPC-A1分別引自第四軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院和生物技術(shù)中心，肺巨細(xì)胞癌細(xì)胞系PLA-801引自北京解放軍301醫(yī)院病理科3。BALB/c(nu/nu)裸鼠由第四軍醫(yī)大學(xué)動物中心提供。EGFR McAb egf/r3由古巴分子免疫中心提供，IG2 McAb(腹水)由第四軍醫(yī)大學(xué)免疫學(xué)教研室提供，RPMI 1640培養(yǎng)基購自美國GIBCO公司，四唑鹽(MTT)購自美國SIGMA公司，

11、胎牛血清(FCS)由中國浙江金華生物制品公司生產(chǎn)。二、體外細(xì)胞增殖抑制實驗采用MTT法4。取對數(shù)生長期的SPC-A1和A549細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液，活細(xì)胞計數(shù)98 %，以2×103/孔接種于96孔板，用1% FCS RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，細(xì)胞貼壁后加入不同濃度的egf/r3 McAb，繼續(xù)培養(yǎng)4天，在570 nm波長測各孔吸光值A(chǔ)。按下列公式計算抑制率：結(jié)果以每組5孔的均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示。三、egf/r3 McAb裸鼠體內(nèi)抗瘤實驗選擇BALB/c(nu/nu)68周齡裸小鼠24只(平均體重18.6 g±1.7 g)，雌雄兼用。取對數(shù)生長期S

12、PC-A1細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液，按7×106/只，將細(xì)胞接種于裸鼠側(cè)腹部皮下血供豐富的部位，按隨機分組設(shè)計將動物分成4組，分組及給藥方法見表1。對照組，同時治療組，無關(guān)抗體組裸鼠于接種24 h后開始治療，延后治療組于第6天移植瘤體積直徑約0.5 cm時開始治療。肉眼觀察出瘤情況，第6天開始用游標(biāo)卡尺測量腫瘤長徑(a)，短徑(b)，每3天測量1次，至實驗結(jié)束。表1動物分組及給藥方法分組動物數(shù)量藥物給藥途徑藥量(/次/只)總藥量給藥方法對照組6PBSIP0.2 ml1.8 ml1次/日同時治療組6egf/r3IP1 mg(0.2 ml)9 mg1次/日延后治療組6egf/r3IP1 mg

13、(0.2 ml)4 mg2次/周無關(guān)抗體組6IG2IP0.2 ml1.8 ml1次/日腫瘤完全抑制作為0，按下列公式計算腫瘤體積和瘤體抑制率： 至第21天對照組動物瘤體直徑約0.8 cm1.0 cm，動物開始死亡時結(jié)束實驗，處死動物，摘除移植瘤稱重，按下列公式計算瘤重抑制率：四、腫瘤病理形態(tài)學(xué)觀察摘除移植瘤，常規(guī)HE染色，做病理檢查。體外實驗收集經(jīng)100 g/ml egf/r3 McAb處理48 h的SPC-A1細(xì)胞，以PBS處理的做對照，反復(fù)洗滌、離心、加入1% 戊二醛固定12 h以上，然后將細(xì)胞團塊切成細(xì)條狀，PBS輕洗滌，1% 鋨酸固定60 min，取出后浸入PBS 30 min，取出行

14、丙酮梯度脫水、包埋、聚合、制成超薄切片，透射電鏡觀察并照相。五、統(tǒng)計學(xué)處理數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)，組間比較采用團體t檢驗。結(jié)果一、egf/r3 McAb對人肺癌細(xì)胞系增殖的影響用不同劑量的egf/r3 McAb處理3株肺癌細(xì)胞系，均可見一定程度的增殖抑制，McAb濃度在0.001 g/ml時這種抑制作用即出現(xiàn)，并隨抗體濃度增高而增加，在500 g/ml時，抑制率均達(dá)到35%左右，呈劑量依賴性(見1)，經(jīng)egf/r3 McAb處理的肺癌細(xì)胞死亡較少。1egf/r3 McAb對培養(yǎng)肺癌細(xì)胞增殖的影響二、egf/r3 McAb對裸鼠體內(nèi)移植瘤的治療作用本實驗對照組、無關(guān)抗體

15、治療組及延后治療組裸鼠全部出瘤。同時治療組3只動物分別于皮下移植SPC-A1細(xì)胞后第5、6、7天瘤塊消失，第9天治療結(jié)束，一半(3/6)部位未觸及瘤組織塊，成瘤率為50 % ，另3只動物腫瘤體積明顯小于對照組(見表2)，第21天實驗結(jié)束，同時治療組1只動物始終未見腫瘤生長，解剖局部未見殘余腫瘤組織。與對照組相比，同時治療組腫瘤生長緩慢，尤其以治療期間最明顯，第6天瘤體抑制率達(dá)到85%，第21天，瘤體抑制率仍然達(dá)到75 %，瘤重抑制率為67 %。延后治療組，與對照組相比，腫瘤生長緩慢，第21天瘤體抑制率為65 %，瘤重抑制率為47 %。表2egf/r3對裸鼠SPC-A1移植瘤形成的抑制作用動物數(shù)

16、腫瘤形成腫瘤形成率腫瘤體積(cm3)*對照組666/60.50±0.22同時治療組633/60.06±0.10*延后治療組666/60.32±0.08*無關(guān)抗體組666/60.44±0.18*P0.01，與對照組相比，為接種腫瘤后第9天測量。 三、腫瘤形態(tài)學(xué)變化對照組移植瘤體積較大，表面粗糙，可見多個結(jié)節(jié)，同時治療組與延后治療組腫瘤體積小，瘤表面光滑，部分腫瘤可見中央壞死，無多結(jié)節(jié)現(xiàn)象。常規(guī)HE染色顯示，兩治療組部分腫瘤組織結(jié)構(gòu)疏松，呈局灶性壞死改變，以同時治療組變化更明顯。體外培養(yǎng)的SPC-A1，透射電鏡檢查發(fā)現(xiàn)胞漿內(nèi)線粒體明顯增多、凝縮、嵴溶解、胞漿

17、溶酶體增多。討論目前，對肺癌采取的綜合治療措施的療效遠(yuǎn)不能令人滿意。因此，尋找新方法、探索新途徑就成為當(dāng)務(wù)之急。隨著分子生物學(xué)及免疫學(xué)的發(fā)展，促使人們從分子免疫水平對腫瘤的發(fā)病機理、生物學(xué)行為等方面進行深入研究。近20年的研究發(fā)現(xiàn)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的異常與腫瘤發(fā)生、發(fā)展有密切關(guān)系，其中酪氨酸激酶途徑尤為人們重視。表皮生長因子受體具有酪氨酸蛋白激酶活性，其介導(dǎo)的信號途徑在細(xì)胞生長與分化中有重要作用。研究表明EGFR在人類許多上皮源性惡性腫瘤組織表達(dá)增強，人肺癌尤其是NSCLC有過表達(dá)現(xiàn)象。過度表達(dá)的EGFR不斷將表皮生長因子的刺激導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)，引起細(xì)胞持續(xù)分裂增殖，最終導(dǎo)致腫瘤發(fā)生。腫瘤組織EGFR在發(fā)病早

18、期即出現(xiàn)高表達(dá)，且具有全程表達(dá)、特異性強、突變少、相對穩(wěn)定等特點，因此有望成為腫瘤細(xì)胞新的表面標(biāo)志物?？紤]到EGFR在肺癌表達(dá)的特點及其介導(dǎo)的自分泌環(huán)(autocrine loop)在肺癌發(fā)生發(fā)展中的調(diào)控作用，針對EGFR進行肺癌分子免疫治療成為可能。EGFR McAb能特異性地識別EGFR，阻斷其介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，打斷自分泌環(huán)路，從而抑制腫瘤生長。本實驗所用3株肺癌細(xì)胞系均存在EGFR的表達(dá)5及生長因子自分泌環(huán)。體外實驗表明egf/r3 McAb對3株肺癌細(xì)胞系均有輕度增殖抑制作用并呈劑量依賴性。體外EGFR McAb對腫瘤細(xì)胞主要表現(xiàn)為抑制性而非毒性，與文獻報告一致5。值得注意的是，盡管3株

19、肺癌細(xì)胞系EGFR的表達(dá)存在明顯差異(SPC-A1、A549高表達(dá)，PLA-801低表達(dá))6，但egf/r3 McAb對它們卻表現(xiàn)出相似的抑制作用，提示雖然PLA-801 EGFR表達(dá)低，但其介導(dǎo)的自分泌環(huán)可能仍然在PLA-810細(xì)胞增殖中發(fā)揮了重要的調(diào)控作用。體內(nèi)實驗時，該抗體部分抑制肺癌細(xì)胞成瘤，明顯延緩已成瘤肺癌細(xì)胞的增殖速度，顯示egf/r3 McAb對肺癌的明顯治療效果，尤其是延后治療方式更符合臨床發(fā)病情況，此實驗結(jié)果對今后開展臨床工作更具有實用價值。對egf/r3 McAb體內(nèi)外抗瘤效果進行比較發(fā)現(xiàn)，在體外主要表現(xiàn)為抑制性的，在體內(nèi)卻表現(xiàn)出殺傷性(瘤細(xì)胞壞死)，抗瘤效果明顯優(yōu)于體外

20、，提示egf/r3單抗在體內(nèi)可能激活了宿主免疫系統(tǒng)參與抗瘤作用，這可能與egf/r3 McAb為IgG2a亞類有關(guān)7,8?；痦椖浚罕菊n題部分為中國-古巴協(xié)作項目基金資助作者簡介：任新玲，女，醫(yī)學(xué)碩士，主治醫(yī)師，講師。作者單位：任新玲（第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院呼吸內(nèi)科，西安，710032）沈麗英（第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院呼吸內(nèi)科，西安，710032）戚好文（第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院呼吸內(nèi)科，西安，710032）金伯泉（第四軍醫(yī)大學(xué)免疫學(xué)教研室）馬進（第四軍醫(yī)大學(xué)空醫(yī)系）參考文獻：1Baselga J,Menclelsohn J.The epidermal growth factor receptor as a target for therapy in breast carcinomaJ.Br Cancer Res Treat,1994,29(1):1272Rusch V,Baselga J,Cordon-Cardo C, et al. Differential expression of the epidermal growth factor receptor and its ligands in primary non-small