系統(tǒng)性紅斑狼瘡皮損角質(zhì)形成細胞體外培養(yǎng)及細胞學特性觀察

1、系統(tǒng)性紅斑狼瘡皮損角質(zhì)形成細胞體外培養(yǎng)及細胞學特性觀察                  作者：賴寬 曾凡欽 魏菁 郭慶 何嘉輝 譚國珍 李伯有 【摘要】  【目的】 體外培養(yǎng)系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)皮損部位角質(zhì)形成細胞(KC)，觀察其細胞學特性。 【方法】 原代培養(yǎng)SLE皮損和正常皮膚的角質(zhì)形成細胞，倒置顯微鏡觀察細胞的形態(tài)特點，免疫熒光法進行角蛋白檢測并計算細胞純度;兩步消化法純化細胞;CCK-8(cell co

2、unting Kit-8)評價細胞的增殖情況，繪制生長曲線。流式細胞儀觀察細胞的生長周期和凋亡情況?！窘Y果】 使用K-SFM(serum-free keratinocyte medium)無血清培養(yǎng)基能成功體外培養(yǎng)SLE皮損的角質(zhì)形成細胞，呈鋪路石樣。結合人工純化，能達到 > 95%的純度;與正常對照相比，SLE皮損角質(zhì)形成細胞進入指數(shù)生長期較遲(7 d vs. 4 d)，但進入后增長迅速，S期比例為： (40.68 ± 1.81)% vs. (34.43 ± 1.24)%(P < 0.05);凋亡率高：(6.08 ± 0.72)% vs. (4.32

3、 ± 0.44)%(P < 0.05)?！窘Y論】 SLE皮損角質(zhì)形成細胞培養(yǎng)難度大，細胞的生物學行為存在異常，可能為SLE發(fā)病的獨立、始發(fā)因素，其致病機制值得深入研究和探討。 【關鍵詞】  SLE; 角質(zhì)形成細胞; CCK-8; 凋亡; 細胞周期 Abstract： 【Objective】 To observe the cytologic characteristics of keratinocytes (KC) from lesion of systemic lupus erythematosus (SLE) patients in vitro. 【Methods】

4、 KC from lesions of SLE patients and healthy people (control group) were cultured in vitro and identified by detecting Pan cytokeratin with immunofluorescence. Features of the keratinocytes were analyzed with invert microscope. Two-step digestion when passaging was used to purify cell line. CCK-8 wa

5、s used to assay growth kinetics of the keratinocytes and come up with a growing curve after continuous analysis for two weeks. Cell circle and apoptosis were observed by flow cytometry. 【Results】 KC was cultured in vitro successfully. Concerning passage 2， over 95% of the cells from primary culture

6、were positive for cytokeratin. Comparing with KC from healthy people， KC from SLE lesions needed more time (7 d vs. 4 d) to reach exponential growth phase (EGP)， but grew faster in EGP. Both cell count at S phase and apoptosis rate of KC from SLE lesions elevated， when comparing with that of the con

7、trol group. 【Conclusion】 Keratinocytes from lesions of SLE patients are abnormal cytologically. It might be a vital cause of skin lesion of SLE， and a priming of SLE.    皮膚損害具有特征性而常見。據(jù)統(tǒng)計，55% 85% SLE患者出現(xiàn)皮膚損害1，這種損害出現(xiàn)得早2，往往在系統(tǒng)損害發(fā)生之前就出現(xiàn)，故為狼瘡早期診斷的重要線索。SLE可出現(xiàn)多種皮損，主要為紅斑，包括常見的碟形紅斑、播散性紅斑，

8、肢端紅斑等，發(fā)病機制尚未明朗，相關研究少。對狼瘡皮損發(fā)病機制的認識有助于進一步解析狼瘡的發(fā)病機理，為狼瘡的診斷及治療提供依據(jù)和參考。本課題組之前通過蛋白組研究發(fā)現(xiàn)3：SLE皮損角質(zhì)形成細胞表達多種異常蛋白，推測與狼瘡的發(fā)病相關。紅斑狼瘡皮膚損害究竟是繼發(fā)癥狀還是始發(fā)、獨立的致病因素，值得深入研究和探討。本實驗通過原代培養(yǎng)系統(tǒng)性紅斑狼瘡皮損的角質(zhì)形成細胞，觀察其細胞學特性，發(fā)現(xiàn)SLE患者皮損角質(zhì)形成細胞的生物學行為存在異常，可能為狼瘡皮疹發(fā)生的重要原因，也可能與狼瘡的發(fā)病密切相關。 1 材料和方法 1.1 材 料 1.1.1 標 本 10例SLE皮損標本取自我科門診或住院患者，均為確診SLE的女

9、性患者(系統(tǒng)性紅斑狼瘡1982年診斷標準)，且具有皮膚損害(紅斑)，平均年齡28.3(S = 5.1)歲，標本均取自背部，狼瘡帶試驗(lupus band test，LBT)陽性;10例正常表皮標本取自我院門診手術室，為接受手術治療的脂肪瘤或粉瘤女性患者，平均年齡27.4(S = 5.5)歲，標本也均取自背部，表皮健康。患者知情并同意。 1.1.2 主要設備 美國Shellab CO2培養(yǎng)箱;日本Nikon 熒光倒置顯微鏡;流式細胞儀(FACScan，BD Biosciences); Labsystems Dragon酶標儀(Wellscan MK 3)。 1.1.3 試 劑 Dispase(

10、分散酶)、K-SFM(serum-free keratinocyte medium)購自美國GIBCO公司;鼠抗人角蛋白一抗(mouse anti-Pan cytokeratin)及熒光二抗購自武漢博士德公司;CCK-8(cell counting kit-8)購自日本同仁公司;凋亡檢測試劑盒購自奧地利Bender Medsystems公司。 1.2 方 法 1.2.1 角質(zhì)形成細胞的原代培養(yǎng) 標本去除皮下組織后剪成8 mm × 3 mm大小，稀釋5倍的雙抗PBS(含青霉素/鏈霉素，500 U/mL)浸泡1 h后，PBS清洗3次。加入1.6 U/mL dispase中4 消化過夜。第

11、2天剝離表皮置于2.5 g/L胰蛋白酶 + 0.2 g/L EDTA(1：1)中消化10 min，含100 mL/L FBS(fetal bovine serum，胎牛血清)的DMEM培養(yǎng)基終止消化，反復吹打后過篩，得角質(zhì)形成細胞懸液，低速離心(1 000 × g， 5 min)，K-SFM重懸后，按1 × 105/mL濃度接種6孔板，置于37 、5% CO2培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。    1.2.2 細胞傳代及純化 細胞培養(yǎng)至 > 70%融合時予傳代，先用2.5 g/L胰蛋白酶預消化6 min，在成纖維細胞、老化的角質(zhì)形成細胞(貼壁

12、能力差)被消化而浮起，具活力的角質(zhì)形成細胞(貼壁能力強)收縮、變圓，但尚未浮起時，吸走消化液，以去除成纖維細胞及老化的角質(zhì)形成細胞;然后再用2.5 g/L胰蛋白酶 + 0.2 g/L EDTA(1 1) 混合液消化3 min， > 90% 角質(zhì)形成細胞浮起時，含血清(FBS 100 mL/L)完全DMEM培養(yǎng)基終止消化。經(jīng)PBS洗滌后，K-SFM重懸，調(diào)整細胞懸液濃度，接種、傳代。 1.2.3 角質(zhì)形成細胞的鑒定及純度計算 胰酶消化第一代原代細胞接種于48孔板，于指數(shù)生長期進行免疫熒光檢測：40 g/L多聚甲醛溶液固定細胞后，10 mL/L的triton處理5 min，30 mL/L B

13、SA(bovine serum albumin，牛血清白蛋白) 37 封閉半小時后加抗人角蛋白一抗(mouse anti-Pan cytokeratin)，4 過夜，PBS洗3次，二抗孵育1 h，DAPI染色5 min后，熒光顯微鏡下觀察、計數(shù)。純度評價：隨機取5個互不重疊的高倍視野(200 ×)，分別于綠色和藍色熒光下，計算(胞漿)免疫熒光陽性細胞數(shù)和總的細胞數(shù)(細胞核數(shù))，并根據(jù)結果計算陽性細胞占總細胞數(shù)的比例。 1.2.4 生長曲線 第二代角質(zhì)形成細胞以5 × 103/孔接種于96 孔板，每孔加CCK-8 10 L，37 孵育3 h后，酶標儀檢測D (450 nm)。

14、每48 h檢測一次，連續(xù)14 d于同一時間點進行觀察，每組設4個復孔。 1.2.5 細胞周期及凋亡 使用流式細胞儀分析第二代指數(shù)生長期角質(zhì)形成細胞的細胞周期和凋亡情況。首先按2.5 × 104/cm2密度接種6孔板，培養(yǎng)至第7天時(70%融合)消化細胞，制備成濃度為1 × 106/mL單細胞懸液，70%凍乙醇 -20 過夜，第2天PI(碘化丙啶)染色后，流式細胞儀進行DNA含量測定，細胞周期分析。凋亡檢測則用binding buffer制成2 × 105/mL濃度細胞懸液，采用FITC標記的AnnexinV(鈣磷脂結合蛋白)和PI雙染后上流式細胞儀進行檢測。每組平

15、衡實驗3次。 1.2.6 統(tǒng)計學分析 實驗數(shù)據(jù)以x ± s表示，使用SPSS 16.0進行統(tǒng)計分析，兩組數(shù)據(jù)間比較采用t檢驗，P < 0.05為有統(tǒng)計學意義。2 結 果 2.1 角質(zhì)形成細胞的原代培養(yǎng) 原代培養(yǎng)約第24小時可見圓形或橢圓形角質(zhì)形成細胞貼壁，同時可見少量蜘蛛狀或樹根狀細胞(圖1)。48 h小集落形成。集落逐漸增大，向外擴增、延伸，并互相融合，最終可連接成片，呈典型的“鋪路石”狀(圖2)。達70%融合時，進行傳代培養(yǎng)。傳代后，細胞生長加快。    2.2 角質(zhì)形成細胞的鑒定和純度計算 角質(zhì)形成細胞胞漿顯示亮綠色熒光(圖 3)。

16、熒光顯微鏡下計數(shù)并進行純度計算，SLE皮損角質(zhì)形成細胞和正常對照組的陽性率分別為：(96.8 ± 1.9)% vs.(97.5 ± 1.27)%(t = -1.04，P > 0.05)。 2.3 生長曲線 對比SLE皮損角質(zhì)形成細胞和正常對照組角質(zhì)形成細胞的生長曲線(圖 4)，SLE皮損角質(zhì)形成細胞進入指數(shù)生長期慢(7 d vs. 4 d)，但進入指數(shù)增長期后，其增殖能力較正常皮膚角質(zhì)形成細胞強，生長迅速(曲線斜率大)。 2.4 細胞周期及凋亡分析 與正常皮膚角質(zhì)形成細胞相比，SLE皮損角質(zhì)形成細胞 S 期細胞比例為：(40.68 ± 1.81)% vs.

17、(34.43 ± 1.24)% (t = 9.005，P < 0.01)(圖5A，B);同時，指數(shù)生長期凋亡率為：(6.08 ± 0.72)% vs.(4.32 ± 0.44)%(t = 6.606，P < 0.01)(圖6A，B)。 3 討 論 作為系統(tǒng)性紅斑狼瘡最常見的損害之一，皮膚損害因出現(xiàn)早，且與病情密切相關4，在狼瘡的診斷及治療中有著重要的意義。皮損的狀況可以直接反映狼瘡的活動情況，為判斷病情，也為療效的觀察提供了重要的臨床線索。在狼瘡皮損發(fā)病機制的研究方面，過去集中在免疫復合物的沉積5-6，及其繼發(fā)的血管病變。本科室先前研究發(fā)現(xiàn)：皮損內(nèi)沉積

18、的DNA抗原與循環(huán)免疫復合物中的抗原并不完全相同7，提示皮膚組織的異?？赡転橐l(fā)紅斑狼瘡的獨立因素，是狼瘡引起皮膚損害，還是皮膚改變誘發(fā)了狼瘡?值得深入研究。我們利用蛋白組技術對系統(tǒng)性狼瘡皮損角質(zhì)形成細胞的蛋白質(zhì)進行全面分析發(fā)現(xiàn)3：與正常相比較，紅斑狼瘡患者皮損角質(zhì)形成細胞中存在多種異常蛋白，提示紅斑狼瘡皮損角質(zhì)形成細胞存在異常，可能為狼瘡皮損乃至狼瘡發(fā)病的重要因素。為進一步了解系統(tǒng)性紅斑狼瘡皮損角質(zhì)形成細胞的異常情況，掌握其生物學特性，本研究通過體外培養(yǎng)系統(tǒng)性紅斑狼瘡皮損部位的角質(zhì)形成細胞，觀察其細胞學特性，并與正常皮膚來源的角質(zhì)形成細胞進行比較。 因為標本量少(一般從病理取材的過程中取得)

19、，且本身處于病態(tài)(基底細胞液化)，所以SLE皮損角質(zhì)形成細胞原代培養(yǎng)難度大，適當增加標本量，取低年齡段患者( < 30歲)及盡量縮短胰酶的消化時間有助于提高成功率。使用dispase可以很好地分離真表皮(推薦4 消化過夜)，得到純度較高的角質(zhì)形成細胞，傳代過程中，通過不含EDTA的胰酶預消化，去除樹根狀細胞和老化的角質(zhì)形成細胞，實現(xiàn)對角質(zhì)形成細胞的人工純化，并且可以減少消化對細胞的損傷，提高傳代后的貼壁率。實驗通過對角蛋白的熒光染色、計數(shù)，證實第二代角質(zhì)形成細胞純度 > 95%，SLE組和正常對照組間差異無統(tǒng)計學意義。    通過CCK-8觀

20、察角質(zhì)形成細胞的增殖情況并繪制生長曲線我們發(fā)現(xiàn)：相同條件下，SLE皮損的角質(zhì)形成細胞較正常角質(zhì)形成細胞進入指數(shù)生長期慢(7 d vs. 4 d)，但一旦進入指數(shù)生長期，其增殖速度較正常角質(zhì)形成細胞快。細胞周期分析也支持這一結果，檢測指數(shù)生長期中角質(zhì)形成細胞的細胞周期發(fā)現(xiàn)：SLE皮損角質(zhì)形成細胞處于S期細胞比例高，提示增長、分裂較正常角質(zhì)形成細胞快。凋亡分析發(fā)現(xiàn)，與正常角質(zhì)形成細胞相比，SLE皮損角質(zhì)形成細胞凋亡率高，這可能與快速增殖有關8。結合先前研究結果，我們可以假設：SLE皮損角質(zhì)形成細胞進入指數(shù)生長期后，處于異常的高增長與高凋亡狀態(tài)，其凋亡所產(chǎn)生的細胞碎片、成分(含有多種異常蛋白)成為自

21、身抗原，經(jīng)過抗原提呈系統(tǒng)的處理、提呈，激活機體的免疫系統(tǒng)，引起自身免疫的發(fā)生。進入指數(shù)生長期緩慢可能與繼發(fā)的炎癥攻擊和損傷有關。因此，角質(zhì)形成細胞的異常生物學行為可能是SLE發(fā)病(或SLE皮損發(fā)病)的原發(fā)、始動因素，值得進一步深入研究。 本實驗從細胞學的角度研究了SLE皮損角質(zhì)形成細胞體外培養(yǎng)的基本生物學特性，為進一步研究狼瘡皮損乃至狼瘡的發(fā)病提供一些基礎的信息，為下一步研究作鋪墊。 【參考文獻】  曾凡欽，許德清. 紅斑狼瘡 M. 北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2003：253.Vilar MJ， Bezerra EL， Sato EI. Skin is the most freque

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