酶活測(cè)定方法

1、土壤酶活測(cè)定 取根際土壤為土壤樣品，同時(shí)挖取根系周?chē)?-20cm和20-40cm土樣，分層充分混合后作為非根際土壤樣品。充分混勻后取樣，用于土壤酶活性測(cè)定的土壤經(jīng)風(fēng)干后，過(guò)1mm篩，測(cè)定多酚氧化酶活性土樣過(guò)0.25mm篩。供微生物分析的鮮土樣裝入已消毒過(guò)的密封塑料袋，帶回實(shí)驗(yàn)室，磨細(xì)過(guò)2mm篩后，置于4冰箱內(nèi)保存?zhèn)錅y(cè)土壤微生物種群、數(shù)量等。蔗糖酶測(cè)定（比色法）1. 方法選擇及原理 蔗糖酶能酶促蔗糖水解生成葡萄糖和果糖。蔗糖酶活性的測(cè)定方法有用酶學(xué)的方法測(cè)量所產(chǎn)生的葡萄糖（滴定法或重量法）或是根據(jù)蔗糖的非還原性，用生成物（葡萄糖和果糖）能夠還原菲林溶液中的銅，再根據(jù)生成的氧化亞銅的量求出糖的含量

2、。也可根據(jù)蔗糖水解的生成物與某種物質(zhì)（3，5-二硝基水楊酸或磷酸銅）生成有色化合物進(jìn)行比色測(cè)定。還有一種方法，根據(jù)蔗糖液酶促反應(yīng)前后光偏振面的變化（旋光法）進(jìn)行測(cè)定。 目前，我國(guó)常用的主要是硫代硫酸鈉滴定法，它是測(cè)定土壤蔗糖酶活性的經(jīng)典方法。3，5-二硝基水楊酸比色法重現(xiàn)性較好，且手續(xù)較簡(jiǎn)便，適于成批樣品測(cè)定。 測(cè)定土壤蔗糖酶活性時(shí)，均以蔗糖為基質(zhì)，蔗糖液濃度范圍為5-20。在酸性介質(zhì)中，蔗糖酶活性最大。為保持該酶最適pH，多使用下列緩沖液：醋酸鹽緩沖液（pH4.5-5.5），磷酸鹽緩沖液（pH4.9-5.5），醋酸鹽-磷酸鹽緩沖液（pH5.5）。2. 試劑配制（1）3，5-二硝基水楊酸溶液：

3、稱(chēng)0.5g二硝基水楊酸，溶于20ml 2N氫氧化鈉和50ml水中，再加30g酒石酸鉀鈉，用水稀釋至100ml（不超過(guò)7天）。（2）pH5.5磷酸緩沖液：1/15M磷酸氫二鈉（11.867g Na2PO42H2O溶于1L蒸餾水中）0.5ml加1/15M 磷酸二氫鉀（9.078gKH2PO4溶于1L蒸餾水中）9.5ml即成。（3）8蔗糖溶液。（4）甲苯。（5）標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液：將葡萄糖先在50-58條件下，真空干燥至恒重。然后取500mg溶于100ml 12mmol苯甲酸溶液中（5mg還原糖/ml），即成標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液。標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：取0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7ml含

4、5mg還原糖/ml的標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液到50ml容量瓶中，與測(cè)定蔗糖酶活性同樣的方法進(jìn)行顯色。3. 試驗(yàn)步驟稱(chēng)取5g風(fēng)干土，置于50ml三角瓶中，注入15ml 8蔗糖溶液，5ml pH5.5磷酸緩沖液和5滴（0.25ml）甲苯。搖勻混合物后，放入恒溫箱，在37下培養(yǎng)24h。到時(shí)取出，迅速過(guò)濾。從中吸取濾液1ml，注入50ml容量量瓶中，加3ml 3，5-二硝基水楊酸，并在沸水的水浴鍋中加熱5min，隨即將容量瓶移至自來(lái)水流下冷卻3min。溶液因生成3-氨基-5-硝基水楊酸而呈橙黃色，最后用蒸餾水稀釋至50ml，并在分光光度計(jì)上于波長(zhǎng)508nm處進(jìn)行比色。為了消除土壤中原有的蔗糖、葡萄糖而引起的誤差

5、，每一土樣需做無(wú)基質(zhì)（無(wú)蔗糖）對(duì)照，整個(gè)試驗(yàn)需做無(wú)土壤對(duì)照。4. 結(jié)果計(jì)算蔗糖酶活性以24h后1g土壤葡萄糖的毫克數(shù)表示。葡萄糖（毫克）a50ts/ma顯色液中葡萄糖濃度（mg/ml），50顯色液體積（ml）；ts分取倍數(shù)（吸1ml濾液比色就是20/1）；m烘干土質(zhì)量（g）。脲酶測(cè)定(比色法)脲酶是對(duì)尿素轉(zhuǎn)化起關(guān)鍵作用的酶，它的酶促反應(yīng)產(chǎn)物是可供植物利用的氮源，它的活性可以用來(lái)表示土壤供氮能力。大多數(shù)細(xì)菌、真菌和高等植物具有脲酶。它是一種酰胺酶，能酶促有機(jī)質(zhì)分子中肽鍵的水解。土壤的脲酶活性與土壤的微生物數(shù)量、有機(jī)物質(zhì)含量、全氮和速效氮含量呈正相關(guān)。人們常用土壤的脲酶活性表征土壤的氮素狀況。土壤

6、脲酶是一種酰胺酶，能促進(jìn)土壤有機(jī)質(zhì)分子中酰胺鍵的水解，因此，在富含有機(jī)質(zhì)的土壤中，脲酶的活性一定高。脲酶是一種高度專(zhuān)性的酶，能酶促尿素的水解，因此可以測(cè)定產(chǎn)生的氨或二氧化碳的量，或測(cè)定基質(zhì)尿素的減量，以表示脲酶的活性。土壤中脲酶活性的測(cè)定是以脲素為基質(zhì)經(jīng)酶促反應(yīng)后測(cè)定生成的氨量，也可以通過(guò)測(cè)定未水解的尿素量來(lái)求得。本方法是測(cè)定生成的氨量。 試劑：（所用試劑至少為分析純，水最好用高純水）1）甲苯 2）10%尿素：稱(chēng)取10g尿素，用水溶至100ml。 3）檸檬酸鹽緩沖液（pH6.7）：184g檸檬酸溶于300ml蒸餾水；147.5g氫氧化鉀溶于500ml蒸餾水。將兩溶液合并，用1mol/LNaOH

7、將pH調(diào)至6.7，用水稀釋至1000毫升。 4）苯酚鈉溶液（1.35mol/L）：62.5g苯酚溶于少量乙醇，加2ml甲醇和18.5ml丙酮，用乙醇稀釋至100ml（A），存于冰箱中；27gNaOH溶于100ml水（B）。將AB溶液保存在冰箱中。使用前將兩溶液各20ml混合，用蒸餾水稀釋至100ml。 5）次氯酸鈉溶液：用水稀釋試劑，至活性氯的濃度為0.9%，溶液穩(wěn)定。(當(dāng)天配）6) 氮的標(biāo)準(zhǔn)溶液： 精確稱(chēng)取0.4717g硫酸銨溶于水并稀釋至1000ml，得到1ml含有0.1mg氮的標(biāo)準(zhǔn)液(100ppm)。標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：吸取配置好的氮標(biāo)準(zhǔn)溶液10ml，定容至100ml，即稀釋了10倍(10pp

8、m) （0.01mg/mL）。分別吸取該液1，3，5，7，9，11，13，15ml至50ml容量瓶，加水至20ml，再加入4ml苯酚鈉溶液和3ml次氯酸鈉溶液，隨加隨搖勻，充分搖蕩，放置20分鐘顯色，用水稀釋至刻度。1h內(nèi)將著色液在（紫外）分光光度計(jì)上于578nm處進(jìn)行比色測(cè)定，以標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，以光密度值為縱坐標(biāo)繪制曲線圖。 操作步驟：1) 稱(chēng)取5g風(fēng)干土樣于50ml三角瓶中 2) 向三角瓶中加入1ml甲苯（以能全部使土樣濕潤(rùn)為度）并放置15分鐘 3) 之后加入10ml 10尿素溶液和20ml檸檬酸緩沖液（PH6.7），并仔細(xì)混合 4) 將容量瓶放入37恒溫箱中，培養(yǎng)24h 5) 顯色

9、：吸取3ml濾液（可根據(jù)情況而定，比如1ml）于50ml容量瓶中，加入20ml蒸餾水，充分震蕩，再加入4ml苯酚鈉溶液和3ml次氯酸鈉溶液，隨加隨搖勻，充分搖蕩，放置20分鐘顯色，用水稀釋至刻度，溶液呈現(xiàn)（青定）酚的藍(lán)色。 6) 1h內(nèi)在（青定）酚的藍(lán)色在1h內(nèi)保持穩(wěn)定）在分光光度計(jì)上用1cm液槽，于578nm處將顯色液進(jìn)行比色測(cè)定。 7) 無(wú)土對(duì)照：不加土樣，其他操作與樣品實(shí)驗(yàn)相同。以檢驗(yàn)試劑純度，整個(gè)實(shí)驗(yàn)設(shè)置一個(gè)對(duì)照 8)無(wú)基質(zhì)對(duì)照：以等體積的水代替基質(zhì)（此為10ml尿素溶液），其他操作與樣品實(shí)驗(yàn)相同。每個(gè)土樣都設(shè)此對(duì)照。 結(jié)果計(jì)算：用供試樣品所得的消光值減去對(duì)照樣品消光值的差，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲

10、線求出氨態(tài)氮量。土壤脲酶活性以每1g土壤中NH3N的毫克數(shù)表示。Ure（X樣品X無(wú)土X無(wú)基質(zhì)）*V*n /m式中：Ure 土壤脲酶活性值 X樣品樣品實(shí)驗(yàn)的光密度值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上對(duì)應(yīng)的NH3N濃度 (mgNH3N/ml)X無(wú)土無(wú)土對(duì)照實(shí)驗(yàn)中的光密度值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上對(duì)應(yīng)的NH3N濃度(mgNH3N/ml)X無(wú)基質(zhì)無(wú)基質(zhì)對(duì)照實(shí)驗(yàn)中的光密度值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上對(duì)應(yīng)的NH3N濃度(mgNH3N/ml) V 顯色液體積（此為50mL）n 分取倍數(shù)（此為100/3）m 烘干土重（g）（鮮土要根據(jù)水分系數(shù)換算）注意事項(xiàng)：當(dāng)脲酶活性為3-80微克NH3-N時(shí)，本法能獲得可靠結(jié)果。當(dāng)脲酶活性小于3微克NH3-N，培養(yǎng)時(shí)間需

11、增至24小時(shí)（計(jì)算時(shí)應(yīng)考慮這一點(diǎn)） 磷酸酶測(cè)定(磷酸苯二鈉比色法)： 土壤磷酸酶是植物根系與微生物的分泌產(chǎn)物。磷酸酶與土壤P素轉(zhuǎn)化密切相關(guān)，是土壤P素肥力的指標(biāo)。1、試劑配制（1）5%磷酸苯二鈉（用緩沖液配制）（2）醋酸鹽緩沖液(pH=5.0)、硼酸鹽緩沖液（pH10.0）、檸檬酸鹽緩沖液（pH7.0）（3）氯代二溴對(duì)苯醌亞胺試劑：取0.125g 2,6-二溴苯醌氯酰亞胺，用10ml 96%乙醇溶解，貯于棕色瓶中，存放在冰箱里。保存的黃色溶液未變褐色之前均可使用。（4）酚的標(biāo)準(zhǔn)液：酚原液-取1g重蒸酚溶于蒸餾水中，稀釋至1L，貯于棕色瓶中。酚工作液-取10mL酚原液稀釋至1L（每mL含0.01

12、mg酚）。（5）甲苯（6）0.3%硫酸鋁溶液。緩沖溶液配制：(1)酸性磷酸酶:醋酸鹽緩沖液(pH=5.0)A：0.2M醋酸鈉溶液：16.4g 無(wú)水醋酸鈉（C2H3O2Na）溶于1000mL蒸餾水中，或是27.2g三水醋酸鈉（C2H3O2Na.3H2O）溶于1000mL水中。B：0.2M醋酸溶液：11.55mL醋酸定容于1000mL醋酸鹽緩沖液(pH=5.0)：7mLA3mLB混合即得（2）堿性磷酸酶：硼酸鹽緩沖液（pH10.0）硼砂氫氧化鈉緩沖液（pH10.0）：A：硼砂液：19.072g硼砂溶于1000mL蒸餾水中B：氫氧化鈉溶液：4g氫氧化鈉溶于1000mL蒸餾水中50mLA43mLB加水

13、稀釋至200mL，混勻即得（3）硼酸鹽緩沖液（pH9.0）A：0.05M硼砂溶液：19.07g硼砂（Na2B4O710H2O）溶于1000mL蒸餾水中B：0.2M硼酸溶液：12.37g硼酸（H3BO3）溶于1000mL蒸餾水中硼酸鹽緩沖液（pH9.0）：80mLA+20mLB混勻即得（4）中性磷酸酶：檸檬酸鹽緩沖液（pH7.0）A：0.1M檸檬酸溶液：21.01g檸檬酸. H2O（或是19.21gC6H8O7）溶于1000mL蒸餾水中B：0.2M磷酸氫二鈉：35.61g磷酸氫二鈉.2 H2O（53.63g磷酸氫二鈉.7 H2O或是71.7g磷酸氫二鈉.12 H2O）溶于1000mL蒸餾水中檸檬

14、酸鹽緩沖液（pH7.0）：3.63mLA+16.37mLB混勻即得標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：分別向50mL容量瓶中注入1，3， 5，7，9，11和13mL酚工作液，每瓶加入5mL緩沖液和4滴氯代二溴對(duì)苯醌亞胺試劑，顯色后稀釋至刻度，30min后比色測(cè)定。以光密度為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)繪成標(biāo)準(zhǔn)曲線。2、操作步驟：稱(chēng)取5土于200mL容量瓶中，加2.5mL甲苯，加塞塞緊輕搖15min。再加入20mL0.5%磷酸苯二鈉（中性磷酸酶用檸檬酸鹽緩沖液），仔細(xì)搖勻后放入恒溫箱，在37下培養(yǎng)24h。后于培養(yǎng)液中加入不100mL 0.3%硫酸鋁溶液并過(guò)濾。吸取3mL濾液于50mL容量瓶中，然后按繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線所述方法顯色。

15、用硼酸緩沖液時(shí)，呈現(xiàn)藍(lán)色，在分光光度計(jì)上于660nm處比色。磷酸酶活性以每克土壤的酚毫克數(shù)表示（若用P的毫克數(shù)表示，結(jié)果需乘0.32；若用P2O5的毫克數(shù)表示，需乘2.29）。過(guò)氧化氫酶測(cè)定(容量法)過(guò)氧化氫酶也叫接觸酶，能促進(jìn)過(guò)氧化氫對(duì)各種化合物的氧化。幾乎在所有的生物體內(nèi)部有過(guò)氧化氫酶，在某些細(xì)菌里，其數(shù)量約為細(xì)胞干重的1。土壤的過(guò)氧化氫酶活性，與土壤呼吸強(qiáng)度和土壤微生物活動(dòng)相關(guān)，在一定程度上反映了土壤微生物學(xué)過(guò)程的強(qiáng)度。原理過(guò)氧化氫酶過(guò)氧化氫酶的測(cè)定有測(cè)壓法和滴定法。測(cè)壓法是測(cè)定過(guò)氧化氫分解時(shí)析出的氧量(反應(yīng)式為： H2O2+H2O O2+H2O，方法簡(jiǎn)單，但準(zhǔn)確性較差。后者則是定量滴定

16、酶促反應(yīng)后剩余的過(guò)氧化氫量，反應(yīng)式為 2KMnO4+5H2O2+3H2SO42MnSO4+K2SO4+8H2O+5O2，此法測(cè)定結(jié)果較好。試劑(1) 0.3% H2O2：按1：100將30的H2O2用水稀釋。(2) 3N H2SO4（也就是1.5mol/l H2SO4）：以配1000ml為例，需要的濃硫酸的體積為1.5*98.08/1.83=80.39ml，可以取80ml。KMnO4的分子量=158.026,當(dāng)量=31.605.高錳酸鉀水溶液受到水中還原物和雜質(zhì)以及受日光直射等影響能分解析出棕色的含水的二氧化錳沉淀，而有濃度的改變。因此在配制其標(biāo)準(zhǔn)溶液時(shí)必須使用棕色瓶盛裝，以防日光直射作用.配

17、制后并應(yīng)放置一段時(shí)間，待與水中還原物完全作用后，濾去沉淀，然后進(jìn)行標(biāo)定，才能得到基本穩(wěn)定不易變化的標(biāo)準(zhǔn)溶液。(3) 0.1N KMnO4溶液：稱(chēng)取化學(xué)純高錳酸鉀3.161克，溶于l升無(wú)CO2蒸餾水（沸水）中，溶解后,在暗處放置一周, 然后用虹吸管將上部澄清溶液移于棕色瓶中(或用玻璃棉濾過(guò))保存，以備標(biāo)定.注：C(1/5 KMnO4)=0.1mol/l表示的就是0.1N KMnO4溶液。0.1N KMnO4溶液標(biāo)定（GB/T601-2002）稱(chēng)取0.2g（準(zhǔn)至0.0001g）于105110烘至恒重的基準(zhǔn)草酸鈉。溶于100mL（8+92）硫酸溶液中，用配制好的高錳酸鉀溶液c（1/5 KMnO4）=

18、0.1mol/l滴定，近終點(diǎn)時(shí)加熱至65，繼續(xù)滴定至溶液呈粉紅色保持30s，同時(shí)作空白試驗(yàn)（不加草酸鈉，其他一樣）。高錳酸鉀溶液標(biāo)準(zhǔn)濃度按下式計(jì)算c（1/5KMnO4）=m*1000/（V1-V2）*M 式中 c（1/5KMnO4）高錳酸鉀標(biāo)準(zhǔn)液之物質(zhì)的量濃度，mol/L； m草酸鈉之質(zhì)量，g； V1滴定草酸鈉消耗的高錳酸鉀溶液之用量，mL； V2空白試驗(yàn)用高錳酸鉀溶液之用量，mL；M草酸鈉的摩爾質(zhì)量的數(shù)值,單位為（g/mol）， M(1/2Na2C2O4)=66.999 或者c（1/5KMnO4）=m/（V1-V2）*0.067000.06700與1.00mL高錳酸鉀溶液c（1/5KMnO4

19、）=0.1mol/l相當(dāng)?shù)囊钥吮硎镜牟菟徕c的質(zhì)量。操作步驟：（1）取2.0 g土，置于100mL（或150ml）三角瓶中，并注入40mL蒸餾水和5mL 0.3H2O2溶液。（B）（2）同時(shí)設(shè)置對(duì)照，即三角瓶中注入40mL蒸餾水和5mL 0.3過(guò)氧化氫溶液，而不加土樣。（A）（3）將三角瓶放在往返式振蕩機(jī)上120r/min振蕩20min后，加入5mL3N硫酸，以穩(wěn)定未分解的過(guò)氧化氫。再將瓶中懸液用慢速濾紙過(guò)濾。吸取25mL濾液，用0.1N KMnO4滴定至淡粉紅色終點(diǎn)。結(jié)果計(jì)算用于滴定土壤濾液所消耗的高錳酸鉀量（毫升數(shù)）為B，用于滴定25mL原始的過(guò)氧化氫混合液所消耗的高錳酸鉀量（毫升數(shù)）為A。

20、以20min后1g土壤消耗的0.1N KMnO4溶液的毫升數(shù)表示（以20min后1g土壤中的過(guò)氧化氫的毫克數(shù)表示？）。土壤過(guò)氧化氫酶活性 =（A-B）T/dwt式中，T為高錳酸鉀滴定度的校正值。 dwt烘干土質(zhì)量（g）舉例KMnO4標(biāo)定：10mL 0.1mol/L 草酸用0.02mol/LKMnO4滴定，所消耗KMnO4體積數(shù)為19.49mL，由此計(jì)算出KMnO4標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為0.0205mol/L，即實(shí)際的KMnO4濃度。T-高錳酸鉀滴定度的矯正值 T=0.0205/0.02=1.026脫氫酶測(cè)定（比色法）（關(guān)松蔭）試劑1）1% TTC(三苯基四氮唑氯化物)2）CaCO33) 甲醇4）甲臢（

21、TPF）的標(biāo)準(zhǔn)溶液：用TTC還原配制。TTC標(biāo)準(zhǔn)溶液：稱(chēng)取50mg已烘干的TTC于50ml的容量瓶中，加水定容，得1mgTTC/ml的標(biāo)液（1000ug/ml）。標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：將TTC標(biāo)準(zhǔn)溶液配制成2、4、6、8、10、20、30 ug/ml的三苯基四唑氯化物溶液，分別加10mg NaHSO3還原，顯色后在分光光度計(jì)上于460nm處比色測(cè)定并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。操作步驟取20g土壤于50ml三角瓶中，加0.2g碳酸鈣?；靹蚝蠹?ml1%三苯基四唑氯化物，再加水至最大持水量的90%（5d），在恒溫恒濕培養(yǎng)箱中（30，相對(duì)濕度70%）培養(yǎng)24h。培養(yǎng)結(jié)束后，加25ml甲醇，振蕩5min，過(guò)濾。再用甲醇多次洗滌漏斗上的土壤，直至獲得無(wú)色濾液。合并濾液和洗液并定容50ml或100ml，在分光光度計(jì)上于460nm處比色（以甲醇做空白）。不加土及TTC做一個(gè)空白對(duì)照。結(jié)果計(jì)算酶活性表示：根據(jù)減去空白對(duì)照的光密度值查標(biāo)準(zhǔn)曲線即可求出產(chǎn)生的三苯基甲臢的量，該量（ug/g干土）即表示脫氫酶的