苯硫脲嘗味的群體遺傳學調查

1、.1苯硫脲嘗味的群體遺傳學調查.21. 實驗目的v（1）測定人群中PTC 嘗味基因的表現(xiàn)型和基因型，理解孟德爾遺傳基因型與表現(xiàn)型的對應關系。v（2）了解酶切擴增多態(tài)序列（cleaved amplified polymorphic sequence，CAPS）（又稱為PCR-RFLP）技術的原理，學會用CAPS 技術檢測單核苷酸多態(tài)性v（SNPs）。在分子水平上測定PTC 嘗味的基因型。v（3）計算群體中PTC 嘗味的基因頻率，判斷群體是否達到Hardy-weiberg 平衡。.32. 實驗原理v苯硫脲（phenylthiocarbamide，PTC）是硫脲的苯基衍生物（圖2.1），為白色結晶粉

2、末，因含有硫代酰胺基（N-C=S）官能團而有苦澀味。能嘗出1/750,0001/50,000 PTC 濃度溶液味道的人（苦澀味，少數(shù)人感到甜味）稱為苯硫脲“嘗味者,只能嘗出PTC 濃度大于1/24,000 溶液的味道（甚至對PTC 的結v晶物也嘗不出苦味）的人稱為苯硫脲“味盲者（nontaster）”.4圖2.1 苯硫脲結構圖PTC 嘗味能力是受單基因控制的孟德爾遺傳性狀，是由位于7 號染色體上（7q35-7q36）的一種苦味味覺感受器基因TAS2R38 決定的，屬于常染色體不完全顯性遺傳。嘗味者中顯性基因T的純合子(TT)能嘗出1750,000 16,000,000的PTC 溶液的苦味，雜合

3、子(Tt) 只能嘗出1480,000l380,000 的PTC 溶液的苦味。因此可以利用對PTC 的嘗味能力測定家族中的基因傳遞和人群中的基因頻率。.5v2.2 人類苯硫脲嘗味的基因v人類的 PTC 嘗味基因Homo sapiens taste receptor, type 2, member38(TAS2R38)(NM_176817)，又名PTC、T2R38 或 T2R61。絕大多數(shù)嘗味者與味盲者的區(qū)別在于三處單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphisms，SNPs)：一處是145 位，味盲者為G145（編碼丙氨酸ala），嘗味者為C145（編碼脯氨酸pro）

4、；第二處是785 位，味盲者為T785（編碼纈氨酸val），嘗味者為C785（編碼丙氨酸ala）；第三處在886 位，味盲者為A886（編碼異亮氨酸ile），嘗味者為G886（編碼纈氨酸val）。因此味盲者PTC 多肽中三處對應的氨基酸分別是ala49、val262 和ile262，被稱為AVI 等位基因，而嘗味者的三處是pro49、ala262 和val262，被稱為PAV 等位基因（圖2.2，2.3）.6.7.8.9v味盲者的PTC 編碼區(qū)有五個限制性內切酶Fnu4H1 的識別位點（識別序列5-GCNGC-3），如果是嘗味者，則其第785 位SNP 恰好形成了一個額外的Fnu4H1 識別位

5、點（GCTGC）。因此可以利用這個SNP 造成的限制性位點多態(tài)性，設計引物擴增包含785 位SNP 位點的PTC 基因編碼區(qū)的一部分，然后用Fnu4H1切割擴增產(chǎn)物，根據(jù)是否能把擴增產(chǎn)物切開而判定是某個人的單倍型（haplotype）。.10v3. 實驗技術路線.11v4. 實驗步驟v4.1 講解實驗目的、實驗原理、實驗技術路線；實驗方法及注意事項；主要儀器設備使用方法、注意事項；（提前一周講解，給學生準備時間）（1）講解實驗目的、實驗原理、實驗技術路線。（2）講解口腔上皮細胞總DNA 的快速提取、基因PCR 擴增、DNA 電泳、PCR產(chǎn)物純化、DNA 酶切、遺傳學分析等實驗方法及注意事項。v

6、（3）講解高壓蒸氣滅菌鍋、高速離心機、小型瞬時離心機、電泳儀、水平電泳槽、渦旋振蕩器、磁力攪拌器、電子天平、PCR 儀、微波爐、紫外分光光度計、電磁爐、恒溫水浴鍋、恒溫干熱議、凝膠成像儀、制冰機、超凈工作臺、通風櫥、恒溫振蕩搖床、37培養(yǎng)箱、pH 計、微量移液器、冰箱、-80超低溫冰箱等主要儀器設備以及必須的電腦軟件的使用方法、注意事項；.12v4.2 PTC 嘗味能力的測定v4.2.1 實驗材料v4.2.1.1 主要儀器設備v高壓蒸氣滅菌鍋、磁力攪拌器、電子天平、超凈工作臺、恒溫水浴鍋、冰箱。潔凈、經(jīng)121高壓滅菌20min 的容量瓶、量筒、燒杯、螺口試劑瓶，一次性醫(yī)用無菌PE 手套、乳膠手

7、套、塑料滴管，一次性紙杯，記號筆。v4.2.1.2 試劑和材料v（1）材料：受試者為全體修讀遺傳學大實驗的學生。v（2）試劑：苯硫脲（PTC）結晶，娃哈哈純凈水.v4.2.1.3 溶液配制v（1）原液（1 號液）：稱取PTC 結晶0.65 g，加娃哈哈純凈水500 ml，在室溫(20左右)下溶解l2d（經(jīng)常搖晃）（或60水浴中1 h 充分溶解），PTC 濃度約為1750，過濾滅菌。v（2）稀釋液：用娃哈哈純凈水逐級稀釋原液214 倍，編為2-14 號（表4.1）。將配好的14 種濃度的PTC 溶液，過濾滅菌，分別置于滅菌過的100 ml 螺口試劑瓶中另取娃哈哈純凈水作為第15 號液。.13編號

8、1 2 3 4 5 6 7 8 9 101112131415濃度75015003000600012000240004800096000192000384000768000純凈水.144.2.2 實驗方法（1）讓受試者正坐，仰頭張嘴伸舌，用滴管滴23 滴 15 號液于受試者舌根部，讓受試者慢慢咽下反復咂嘴品味液體嘗味，然后用純凈水做同樣的試驗，交替給受試者嘗味，避免受試者的臆意猜測而影響結果的準確。（2）詢問受試者能否鑒別此兩種溶液的味道。（3）若不能鑒別或鑒別不準，則依次用 141 號溶液重復試驗，直到能明確鑒 別出PTC 的苦味為止。.15v（4）復嘗味3 次，3 次結果相同時，才是可靠。v

9、（5）記錄所品出苦味的液體的編號和稀釋濃度。 4.3 人口腔上皮細胞總DNA 的提取v4.3.1 實驗材料v4.3.1.1 主要儀器設備v高壓蒸氣滅菌鍋、磁力攪拌器、電子天平、超凈工作臺、恒溫水浴鍋、渦旋v振蕩器、高速離心機、恒溫振蕩搖床、微量移液器、電磁爐、冰箱、-80超低v溫冰箱、計時器、pH 計。v潔凈、經(jīng)121高壓滅菌20min 的量筒、燒杯、螺口試劑瓶、牙簽、1.5 mLv滅菌微量離心管、微量移液器吸頭（槍頭），離心管架，一次性醫(yī)用無菌PE 手v套、乳膠手套、口罩，記號筆。.16v4.3.1.2 試劑和材料v（1）材料：每實驗小組選取1 名受試者，用滅菌牙簽刮取口腔上皮細胞。v（2）

10、試劑：滅菌水，pH 標準液，細胞基因組DNA 提取試劑盒v4.3.2 實驗方法v（1）在1.5 ml 滅菌微量離心管中加入100 L 滅菌水。v（2）受試者用無菌牙簽輕刮口腔腮內側，刮下來的細胞在滅菌水中漂洗。v（3）渦旋振蕩器渦旋振蕩混勻10 s，v（4）離心機瞬時離心10 s。v（5）沸水浴中煮沸5 min。v（6）離心機13200rpm 離心2 min。v（7）基因組DNA 4C 保存?zhèn)?17v4.4 PCR 擴增PTC 基因片段v4.4.1 實驗材料v4.4.1.1 主要儀器設備v高壓蒸氣滅菌鍋、高速離心機、小型瞬時離心機、渦旋振蕩器、PCR 儀、vpH 計、制冰機、超凈工作臺、微量移

11、液器、冰箱、-80超低溫冰箱。v潔凈、經(jīng)121高壓滅菌20min 的1.5 mL 滅菌微量離心管、PCR 管、微量v移液器吸頭（槍頭），離心管架， PCR 管架，一次性醫(yī)用無菌PE 手套，塑料飯v盒，記號筆。v4.4.1.2 試劑和材料v（1）材料：每實驗小組受試者口腔上皮細胞基因組DNAv（2）試劑：Taq DNA 聚合酶，dNTPs，滅菌超純水，Tris 堿，Na2EDTA.2H2O，vpH 標準液（pH7.0）。vPCR 引物委托上海生工生物技術有限公司合成，預期擴增產(chǎn)物303 bp。v上游引物：hPTC Forward 5-aactggcagaataaagatctcaatttat-3v

12、下游引物：hPTC Reverse 5-aacacaaaccatcacccctatttt-3v4.4.1.3 溶液配制v（1）PCR 引物儲存液：將裝有引物干粉的離心管13200rpm 離心20s，按照引物v合成報告單的說明，在超凈臺中加入適量TE 緩沖液，溶解引物配制成100Mv濃儲液。v（2）PCR 引物工作液：取10L PCR 引物儲存液，滅菌水稀釋至100L，配制v制成10M 工作液。v（3）TE 緩沖液：10mmol/L Tris HCl pH8.0，1mmol/L EDTA pH8.0.18v4.4.2 實驗方法v（1）從制冰機中盛取碎冰（0C ），從冰箱中取出所需試劑，在碎冰中解

13、凍v（2）將試劑在渦旋振蕩器上渦旋振蕩混勻10 sv（3）13200rpm 離心10 s。v（4）在碎冰上按照配方和順序在PCR 管中配制PCR 緩沖液（為保持酶活性，v及PCR 擴增的特異性和效率，始終在低溫下配制）v滅菌超純水 31.5Lv10PCR Buffer（Mg2+ free） 5.0Lv25 mM MgCl2 3.0Lv10 mM dNTPs 1.0Lv10M hPTC Forward Primer 1.0Lv10M hPTC Forward Primer 1.0LvTaq DNA 聚合酶 1.0Lv（建議多位學生合配以上混合液，然后分裝43.5 ul）v受試者口腔上皮細胞基因組

14、DNA 6.5Lv總體積 50Lv（5）蓋蓋后用手指輕彈管壁，混勻液體，13200rpm 離心10 s（將液體甩到離心v管底部）。v（6）在管上做好標記后放入PCR 儀中（等待其它學生一起運行）。v（7）按下述程序設定運行PCR 儀：v94C 94C 55C 72C 72C 4Cv預變性5 min 變性30s 退火 30 s 延伸30s 延伸10 min 無限v40 個循環(huán)v（8）PCR 產(chǎn)物4C 保存?zhèn)溆?19v4.5 PTC 基因PCR 擴增產(chǎn)物的電泳檢測v4.5.1 實驗材料v4.5.1.1 主要儀器設備v高速離心機、小型瞬時離心機、電泳儀、水平電泳槽、電子天平、微波爐、v凝膠成像儀、制

15、冰機、超凈工作臺、通風櫥、微量移液器、冰箱、-80超低溫v冰箱。v潔凈、經(jīng)121高壓滅菌20min 的、微量移液器吸頭（槍頭），離心管架， PCRv管架，三角瓶，一次性醫(yī)用無菌PE 手套，記號筆，保鮮袋，微波爐用手套，三v角瓶，搪瓷盤。v4.5.1.2 試劑和材料v（1）材料：受試者PTC 基因PCR 產(chǎn)物v（2）試劑：Tris 堿，冰乙酸，Na2EDTA.2H2O，溴化乙錠，瓊脂糖，Marker Iv4.5.1.3 溶液配制v（1）50TAE 電泳緩沖液（儲存液，pH 約8.5）：Tris 堿 242g，57.1ml 冰乙酸，v37.2g Na2EDTA.2H2O，去離子水定容至1Lv（2）

16、1TAE 電泳緩沖液（工作液）：取50TAE 電泳緩沖液，去離子水稀釋50v倍v（3）0.5mg/ml 溴化乙錠（EB）（1000儲存液）：50mg 溴化乙錠溶于100mL ddvwater，4C 避光儲存）。v(4) 溴化乙錠（EB）工作液：0.5mg/ml EB（1000儲存液），去離子水稀釋1000v倍。（注：EB 為扁平分子，可以嵌入DNA，為潛在誘變劑，接觸時須帶一次性v醫(yī)用無菌PE 手套，但也不是洪水猛獸，不小心濺到皮膚上時，不會被皮膚吸收v只是停留在表面，用大量流水沖洗即可）。v4.5.2 實驗方法v（1）配制1.2%瓊脂糖凝膠：稱取0.6g 瓊脂糖粉，放入三角瓶，加入50ml

17、1TAEv電泳緩沖液，放入微波爐中加熱，并不斷取出混勻，注意觀察燒瓶中的瓊脂糖粉v末，直至完全熔解（燙，戴手套）。50ml 正好倒一塊大膠（切不可讓膠溶液溢出v到微波爐中?。?20v（2）將膠液置桌面上室溫冷卻致熱但不燙手（約50-60C）。v（3）把梳子插到凝膠灌制模具的正確位置后緩緩倒入膠溶液。膠溶液倒至與模v具的矮邊緣相平即可。在桌面上靜置10-20 分鐘待膠完全凝固。（剩下的膠溶液v封口后留待以后再熔化使用），小心拔出梳子，凝膠沒入電泳槽電泳液中，凝膠v上有樣品孔的一側要朝向電泳槽的負極。v（4）取1 片光面紙，點5L 滅菌水、2L 6加樣緩沖液，再加入5L PCR 產(chǎn)物v制成10L

18、 DNA 樣品。v（5）在凝膠上選擇相鄰的加樣孔。用10l 的吸液頭分別依次加入5L Marker Iv對照，各小組12L PCR 產(chǎn)物電泳樣品（互相比較）v（6）根據(jù)電泳槽的長度把電泳儀的電壓調至120V(10V/cm)，電泳2030min。（注v意正負電極的位置連接正確）。v（7）把凝膠小心放入盛有EB 的搪瓷盤中，染色10 分鐘后，取出用自來水浸泡v10min。v（8）放入凝膠成像系統(tǒng)中拍照。.21v4.6 PTC 基因PCR 產(chǎn)物酶切v4.6.1 實驗材料v4.6.1.1 主要儀器設備v高壓蒸氣滅菌鍋、高速離心機、小型瞬時離心機、渦旋振蕩器、磁力攪拌器、v恒溫水浴鍋、恒溫干熱議、制冰機

19、、紫外分光光度計、微量移液器、冰箱、-80v超低溫冰箱。v潔凈、經(jīng)121高壓滅菌20min 的1.5 mL 滅菌微量離心管、微量移液器吸v頭（槍頭），離心管架，一次性醫(yī)用無菌PE 手套，塑料飯盒，記號筆。v4.6.1.2 試劑和材料v（1）材料：受試者PTC 基因PCR 產(chǎn)物v（2）試劑：限制性內切酶Fnu4H1v4.6.2 實驗方法v（1） 提前2 h 將恒溫水浴鍋或恒溫干熱儀(或恒溫水浴鍋)電源打開，調節(jié)工作v溫度穩(wěn)定至37 C。v（2）從制冰機中盛取碎冰（0C ），從冰箱中取出所需試劑，在碎冰中解凍v（3）將試劑在渦旋振蕩器上渦旋振蕩混勻10 sv（4）瞬時離心10 s。v（5） 取1L

20、 受試者 PTC 基因純化DNA，用紫外分光光度計測定其260nm、v280nm 下的紫外吸光光度值，進行DNA 定量分析。v（6）在碎冰上按照配方和順序在1.5 mL 微量離心管中配制酶切緩沖液（為保持v酶活性及DNA 切割效率，始終在低溫下配制）：v滅菌超純水 補足15Lv10酶切緩沖液 1.5Lv5 units/L Fnu4H1 1LvPTC 基因純化DNA 1gv（根據(jù)DNA 定量結果加入適當體積溶液）v總體積 15Lv（7）37C 恒溫酶切過夜v（8）酶切產(chǎn)物4C 保存?zhèn)溆?22v4.7 PTC 基因酶切產(chǎn)物的電泳檢測v4.7.1 實驗材料v4.7.1.1 主要儀器設備v高速離心機、

21、小型瞬時離心機、電泳儀、水平電泳槽、電子天平、微波爐、v凝膠成像儀、制冰機、超凈工作臺、通風櫥、微量移液器、冰箱、-80超低溫v冰箱。v潔凈、經(jīng)121高壓滅菌20min 的微量移液器吸頭（槍頭），離心管架， 三v角瓶，一次性醫(yī)用無菌PE 手套，記號筆，保鮮袋，微波爐用手套，三角瓶，搪v瓷盤。v4.7.1.2 試劑和材料v（1）材料：受試者PTC 基因酶切產(chǎn)物v（2）試劑：Tris 堿，冰乙酸，Na2EDTA.2H2O，溴化乙錠，瓊脂糖， Marker Iv4.7.2 實驗方法v（詳見 4.5.2）v（1）配制2%瓊脂糖凝膠：稱取1g 瓊脂糖粉，放入三角瓶，加入50ml 1TAEv電泳緩沖液，放

22、入微波爐中加熱熔解，制膠。v（2）取1 片光面紙，點4L 滅菌水、1L 10加樣緩沖液，再加入5L PCR 產(chǎn)v物制成10L 對照DNA 樣品（一塊膠上點1 個PCR 產(chǎn)物對照即可）。v（3）將酶切產(chǎn)物（離心管中）中加入3L 6加樣緩沖液，混勻v（4）在凝膠上選擇相鄰的加樣孔。用10l 的吸液頭分別依次加入5L Marker Iv對照，10L PCR 產(chǎn)物對照，各小組10L 酶切產(chǎn)物電泳樣品（互相比較）v（4）70V，電泳6070min。（注意正負電極的位置連接正確）。v（5）凝膠EB 染色10 分鐘后，取出用自來浸泡10min。v（6）放入凝膠成像系統(tǒng)中拍照。.23v4.8 實驗結果遺傳學分

23、析v對照 DNA ladder Marker 的指示條帶位置，查看PCR 產(chǎn)物和酶切產(chǎn)物的泳道v中各有幾條帶（圖4.1）。PCR 產(chǎn)物預期只有一條約300 bp 的帶。酶切產(chǎn)物中如v果只有一條與PCR 產(chǎn)物同樣位置的帶，說明是tt 純合體（303 bp）；如果只有兩v條帶，一條暗淡，在前方較遠處（64 bp），另一條明亮比PCR 產(chǎn)物帶稍靠前（238vbp），說明是TT 純合體；如果有三條帶，一條明亮、與PCR 產(chǎn)物位置相同，另v一條比PCR 產(chǎn)物帶稍靠前，還有一條暗淡、在前方較遠處，則說明是Tt 雜合體v把該結果與此前的嘗味結果（嘗出苦味的PTC 濃度）對比（表4.4）。綜合v全班的PTC

24、基因型，計算基因頻率，用X2 檢驗本班群體是否處于遺傳平衡。.24v表4.4 PTC 嘗味能力調查表基因型 嘗味能力人數(shù)TTTttt總計.25v5. 實驗報告v查閱 PTC 嘗味研究文獻，按照科研論文的格式撰寫實驗論文，包括論文題v目、摘要（中英文）、前言、材料與方法、結果、討論、參考文獻。v6. 實驗擴展（選作）v請自行查閱 chimpanzee, lowland gorilla, orangutan, crab-eat-ing macaque (anvold world monkey), black-handed spider monkey (a new world monkey)的PTC 基因v和其SNP 位點以及有關PTG 基因起源與進化的學術論文（如下面的三篇論文），v討論PTC 基因的功能以及該基因的起源與進化。v1 Fisher, R.A.,