硝酸還原酶測定方法(共3頁)_第1頁
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文檔簡介

1、精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上硝酸還原酶活力的測定1原理硝酸還原酶（ nitrate reductase,NR ），是植物氮素同化的關(guān)鍵酶，它催化植物體內(nèi)的硝酸鹽還原為亞硝酸鹽（NO3+NADH+H NO2+NAD+H 2 O ）。產(chǎn)生的亞硝酸鹽與對氨基苯磺酸（或?qū)Π被交酋０罚┘? 萘胺（或萘基乙烯二胺）在酸性條件下定量生成紅色偶氮化合物。其反應(yīng)如下：     生成的紅色偶氮化合物在 540 nm 有最大吸收峰，可用分光光度法測定。硝酸還原酶活性可由產(chǎn)生的亞硝態(tài)氮的量表示。一般單位鮮重以ug/(g·h) 為單位。NR 的測定可分為活體法和離體法。活體法步驟簡單，適合

2、快速、多組測定。離體法復(fù)雜，但重復(fù)性較好。 藥品配制1) 0.1mol/L pH為7.5的磷酸緩沖液: 稱取Na2HPO4·12H2O 30.0905g, NaH2 PO4·2H2O 2.4965g, 溶解并定容至1000ml.2) 0.2 mol/L KNO3溶液: 2.5275g KNO3用pH為7.5的磷酸緩沖液溶解并定容至100 ml.3) 30%三氯乙酸：75.0g 三氯乙酸用水定容至250mL。4) 硝酸試劑的配制: 0.5g -萘胺加水煮沸1-2分鐘,趁熱加入1.25g 對氨基苯磺酸,再加250 ml冰醋酸,加水定容至500mL.保存于暗處.2酶活性測定1)

3、稱樣: 從田間取回新鮮葉片，用水洗凈，吸干水份，用打孔器打出直徑 0.5cm 的葉圓片，用蒸餾水沖洗葉圓片 1 2 次，用吸水紙把水吸干后，稱取等重葉圓片4份，每份重 0.5 g ，放入50mL的三角瓶中。2) 抽提: 正常處理向每個三角瓶中先后加入5mL磷酸緩沖液溶和5mL硝酸溶液；對照處理先加1mL三氯乙酸,再加其它兩種溶液。在黑暗的條件下用真空泵反復(fù)抽提30分鐘.3) 放置: 在黑暗,25條件下放置30分鐘.4) 終止反應(yīng): 正常處理向三角瓶中加入1mL三氯乙酸；對照處理不加三氯乙酸。然后吸取反應(yīng)液 2mL，然后各加8 mL硝酸試劑.30分鐘后用分光光度計在 540 nm 波長下比色.3計算公式NR活性ug/(g·h) B*11*10/（2*m*h） B:比色液中濃度ug/g·h M:樣品質(zhì)量 g H:時間 （小時）硝酸還原酶活力的測定稱4份，0.500g/份，放入50mL的三角瓶中,正常3份，對照1份。正常5ml磷酸緩沖液5ml硝酸鉀溶液對照1ml三氯乙酸5ml磷酸緩沖液溶5ml硝酸鉀溶液黑暗，真空泵抽提30分鐘黑暗,25條件下放

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