低乙醇脫氫酶活性的抗老化啤酒

1、低乙醇脫氫酶活性的抗老化啤酒酵母工程菌的構(gòu)建蔡 勇1 母 茜1 王肇悅2 張博潤(rùn)2 晏本菊1* (1. 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)與理學(xué)院 雅安 625014) (2. 中國(guó)科學(xué)院微生物研究所 北京 100101)摘 要: 采用自克隆技術(shù), 破壞啤酒酵母工業(yè)菌株YSF31的ADH2基因, 在ADH2基因位點(diǎn)插入來(lái)源于YSF31的編碼-谷氨酰半胱氨酸合成酶的GSH1基因和銅抗性篩選標(biāo)記CUP1基因。通過(guò)銅抗性篩選轉(zhuǎn)化子, 經(jīng)PCR和乙醇脫氫酶 (ADH) 活性測(cè)定驗(yàn)證, 獲得了1株啤酒酵母工程菌。10°P麥芽汁發(fā)酵實(shí)驗(yàn)顯示, 自克隆菌株的乙醇脫氫酶活性是受體菌的65%, 谷胱甘肽含量比受體菌

2、YSF31的高34%。其他發(fā)酵指標(biāo)并沒(méi)有發(fā)生明顯改變。由于DNA操作過(guò)程中沒(méi)有外源基因介入, 因此啤酒酵母工程菌為生物安全的自克隆菌株, 具有重要的應(yīng)用價(jià)值。關(guān)鍵詞: 啤酒酵母工業(yè)菌株, 谷胱甘肽, 乙醇脫氫酶, 自克隆Construction of Self-cloning Industrial Brewing Yeast with High-glutathione Production and Low-ADH II Enzyme ActivityCAI Yong1 MU Qian1 WANG Zhao-Yue2 ZHANG Bo-Run2 YAN Ben-Ju1*(1. College o

3、f Life Sciences, Sichuan Agricultural University, Yaan 625014) (2. Institute of Microbiology, Chinese Academy of Science, Beijing 100101)Abstract: Self-cloning strains of industrial brewing yeast were constructed by integrating Saccharomyces cerevisiae genes, -glutamylcysteine synthetase gene (GSH1)

4、 and copper resistant gene (CUP1) into the locus of alcohol dehydrogenase II (ADH II) gene (ADH2). The self-cloning strains were selected for their resistance to CuSO4 and identified by PCR amplification. The results of ADH II and glutathione (GSH) assay from fermentation with the self-cloning strai

5、ns in 500ml conical flask showed that ADH II activity decreased to 65% and GSH content was 1.3 fold compared with that of host yeasts. The self-cloning strains do not contain any heterologous DNA; they may be more acceptable to the public.Keywords: Industrial brewing yeast, Glutathione, Alcohol dehy

6、drogenase II, Self-cloning乙醛(CH3CHO)是啤酒中主要的風(fēng)味物質(zhì)之一1。一般啤酒中的含量為5 mg/L12 mg/L。國(guó)外優(yōu)質(zhì)啤酒的乙醛含量多在3 mg/L以下。低濃度的乙醛使啤酒具有芳香味, 高濃度則產(chǎn)生像青草或者蘋(píng)果腐爛的味道2。乙醛含量已成為國(guó)內(nèi)啤酒風(fēng)味改良的瓶頸。降低啤酒中乙醛的含量, 主要有兩種手段：一是通過(guò)對(duì)發(fā)酵工藝的改進(jìn)降低乙醛含量; 二是通過(guò)代謝工程, 修飾工業(yè)菌株的代謝途徑達(dá)到降低乙醛含量的目的。關(guān)于前者有大量的文獻(xiàn)報(bào)道, 但由于啤酒生產(chǎn)對(duì)發(fā)酵條件要求嚴(yán)格, 使此類(lèi)工藝改進(jìn)很難在生產(chǎn)中應(yīng)用。國(guó)內(nèi)外對(duì)啤酒酵母(Saccha- romyces cer

7、evisiae)開(kāi)展的代謝工程有大量報(bào)道, 但針對(duì)乙醛含量開(kāi)展的代謝工程研究報(bào)道很少。隨著對(duì)啤酒酵母中乙醛代謝途徑的揭示, 以及相關(guān)基因的克隆, 利用基因工程的手段對(duì)乙醛代謝過(guò)程進(jìn)行修飾已成為可能。谷胱甘肽是三肽小分子, 具有抗氧化的功能, 對(duì)細(xì)胞有保護(hù)作用。增加谷胱甘肽的含量可以提高啤酒的抗老化能力3。g-谷氨酰半胱氨酸合成酶基因GSH1所編碼的g-谷氨酰半胱氨酸合成酶是谷胱甘肽合成途徑中的限速步驟, 增強(qiáng)-谷氨酰半胱氨酸合成酶的活性可以達(dá)到增加谷胱甘肽含量的目的4。在發(fā)酵后期, 發(fā)酵液中的葡萄糖不足的情況下, 啤酒酵母ADH2基因編碼的ADH II (alcohol dehydrogena

8、se II)催化乙醇脫氫生成乙醛, 乙醛氧化生成乙酸鹽進(jìn)入三羧酸循環(huán), 為酵母生長(zhǎng)提供物質(zhì)和能量5。ADH2基因在這個(gè)代謝途徑中是個(gè)關(guān)鍵基因。將基因GSH1通過(guò)同源重組插入到啤酒酵母的ADH2基因位點(diǎn), 成功構(gòu)建了1株低乙醇脫氫酶活性的抗老化啤酒酵母工程菌, 為構(gòu)建低乙醛的啤酒酵母工程菌提供一定的依據(jù)和基礎(chǔ)。1材料與方法1.1 菌株和質(zhì)粒 大腸桿菌(Escherichia coli)DH5用于克隆實(shí)驗(yàn)。啤酒酵母YSF31由青島啤酒集團(tuán)提供。質(zhì)粒YEp352(ampR URA3)是大腸桿菌/酵母菌穿梭載體。含有CUP1基因的質(zhì)粒pYCUP和含有GSH1的質(zhì)粒pGF-2均由實(shí)驗(yàn)室保存。1.2 培養(yǎng)

9、基和工具酶 大腸桿菌培養(yǎng)及所用培養(yǎng)基參照常規(guī)方法6。培養(yǎng)酵母菌用YEPD培養(yǎng)基按常規(guī)配制7。限制性?xún)?nèi)切酶、T4 DNA連接酶、DNA聚合酶均購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司。1.3 遺傳操作 大腸桿菌轉(zhuǎn)化按氯化鈣法進(jìn)行6。啤酒酵母總DNA的提取按文獻(xiàn)7的方法進(jìn)行, 啤酒酵母的遺傳轉(zhuǎn)化按文獻(xiàn)8的方法進(jìn)行。1.4 引物合成與PCR擴(kuò)增根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道的ADH2基因序列9設(shè)計(jì)引物：P1：5¢-CAAGAATTCAGCACAACAATACCAGTCC G-3¢和P2：5¢-GGCAAGCTTAACATTGATGATACC CTGGG-3¢。劃線部分為EcoR和Hind

10、的識(shí)別位點(diǎn)。以YSF31的總DNA為模板, 進(jìn)行高保真的PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)參數(shù)為：94變性40 s; 56退火 1 min, 72延伸2 min, 30個(gè)循環(huán); 72延伸15 min。1.5 自克隆菌株的構(gòu)建1.5.1 酵母菌轉(zhuǎn)化：采用完整細(xì)胞轉(zhuǎn)化法, 在含6 mmol/L CuSO4的YEPD平板上篩選轉(zhuǎn)化子。1.5.2 PCR驗(yàn)證自克隆菌株：用于PCR擴(kuò)增的引物見(jiàn)表1。PCR反應(yīng)體系為25 L, 2 L 10×PCR buffer, 1.2 mmol/L MgCl2, 200 mol/L dNTP, 400 ng模板DNA, 0.2 mol/L 引物, 和1.5 U Taq聚

11、合酶。反應(yīng)參數(shù)：94預(yù)變性5 min; 94變性40 s, 55退火1 min, 72延伸3 min, 30個(gè)循環(huán); 72延伸15 min。表1 引物列表Table 1 List of primersPrimersSequence 5¢3¢CUP1-1CGCTATACGTGCATATGTTCCUP1-2ATCTGTTGTACTATCCGCTTGSH1-1ATCTCATATTGACTTCCTTGSH1-2TACAAGATCTAACAGGAGCA1.6 遺傳穩(wěn)定性分析將待測(cè)菌在YEPD斜面上活化, 然后轉(zhuǎn)到5 mL YEPD培養(yǎng)基中(沒(méi)有選擇壓力), 28培養(yǎng), 每24 h轉(zhuǎn)接

12、1次, 共轉(zhuǎn)接5次后, 取菌液涂布YEPD平皿, 28培養(yǎng)至長(zhǎng)出單菌落。分別挑取100個(gè)單菌落于無(wú)菌水中, 饑餓4 h后, 分別接種在YEPD及含6 mmol/L CuSO4 的YEPD培養(yǎng)基平皿上, 28培養(yǎng)48 h, 測(cè)定單菌落對(duì)CuSO4的抗性。1.7 谷胱甘肽含量測(cè)定 參照文獻(xiàn)10測(cè)定GSH含量。1.8 乙醇脫氫酶活性測(cè)定 參考文獻(xiàn)11。1.9 小試發(fā)酵實(shí)驗(yàn)將酵母菌接入5 mL麥芽汁培養(yǎng)基, 25培養(yǎng)12 h, 以10 的接種量接種于10 mL麥芽汁培養(yǎng)基, 25培養(yǎng)36 h, 培養(yǎng)液全部接于270 mL麥芽汁中, 12 靜置培養(yǎng)20 d。2 結(jié)果2.1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建重組質(zhì)粒pACG

13、的構(gòu)建：以YSF31的總DNA為模板, PCR擴(kuò)增出大小1.7 kb的ADH2基因。用EcoR和Hind酶切PCR產(chǎn)物, 插入質(zhì)粒YEp352的EcoR和Hind位點(diǎn)。獲得質(zhì)粒pYA。用Sac和Sal酶切質(zhì)粒pYCUP得到CUP1基因, 用Sal和Sph酶切質(zhì)粒pGF-2得到GSH1, 上述兩基因插入到質(zhì)粒pYA的Sac和Sph位點(diǎn)。獲得質(zhì)粒Pacg (圖1)。 酶切分析表明重組質(zhì)粒pACG構(gòu)建正確 (圖2)。該重組質(zhì)粒中ADH2基因內(nèi)部約0.5 kb的DNA片段被CUP1和GSH1替換。圖1 重組質(zhì)粒pACG的構(gòu)建Fig. 1 Construction of recombinant plas

14、mid pACG2.2 酵母菌的轉(zhuǎn)化與篩選用Pvu酶切重組質(zhì)粒pACG得到1個(gè)6.2 kb大小的DNA片段。此片段含有銅抗性基因CUP1和-谷氨酰半胱氨酸合成酶基因GSH1, 兩端含有克隆的ADH2基因的5¢端和3¢端序列。用此DNA片段轉(zhuǎn)化啤酒酵母YSF31, 使該片段與染色體在ADH2位點(diǎn)發(fā)生同源重組。通過(guò)細(xì)胞對(duì)硫酸銅的抗性篩選到轉(zhuǎn)化子。2.3 轉(zhuǎn)化子的驗(yàn)證2.3.1 PCR擴(kuò)增驗(yàn)證：自克隆菌株的1個(gè)ADH2基因位點(diǎn)的部分序列被CUP1基因和GSH1基因替代, 而受體菌的該位點(diǎn)是完整的ADH2基因序列。以受體菌和自克隆菌株的總DNA為模板, 用引物組合CUP1-1/CU

15、P1-2, GSH1-1/GSH1-2, CUP1-1/GSH1-1進(jìn)行PCR擴(kuò)增。結(jié)果顯示, 受體菌和自克隆菌株都擴(kuò)增出分別代表CUP1基因和GSH1基因的1.1 kb和4.2 kb的條帶, 另外自克隆菌株的CUP1-1/GSH1-1引物組合還擴(kuò)增出1條大約5.3 kb的條帶, 而受體菌沒(méi)有擴(kuò)增出該條帶(圖3)。說(shuō)明CUP1基因和GSH1基因被連接整合到了自克隆菌株的染色體上。圖2 質(zhì)粒pACG的酶切驗(yàn)證圖Fig. 2 Digestion patterns of plasmid pACGM: DNA marker; 1: EcoR酶切; 2: Sca酶切; 3: Sal酶切; 4: Nco酶

16、切; 5: EcoR酶切M: DNA marker; 1: EcoR; 2: Sca; 3: Sal; 4: Nco; 5: EcoR圖3 受體菌和轉(zhuǎn)化子的PCR分析Fig. 3 PCR analysis of self-cloning strains and their hostsM: DNA marker; 1,2,5,6所用引物為: CUP1-1/ CUP1-2; 3,7所用引物為: GSH1-1/ GSH1-2; 4,8, CUP1-1/ GSH1-1; 1,5所用模板為: 陰性對(duì)照; 24所用模板為: YSF31總DNA; 68所用模板為: 自克隆菌株總DNAM: DNA marke

17、r; Primers for lane 1,2,5,6: CUP1-1/CUP1-2; Primers for lane 3,7: GSH1-1/GSH1-2; lane 4,8, CUP1-1/GSH1-1; DNA templates for lane 1,5: Negative control; DNA templates for lane 2-4, DNA of YSF31; DNA templates for lane 6-8: DNA of self-cloning strain2.3.2 ADH酶活測(cè)定：按參考文獻(xiàn)10, 對(duì)受體菌和自克隆菌株進(jìn)行培養(yǎng)并誘導(dǎo)酶活。酶活測(cè)定結(jié)果顯示,

18、 自克隆菌株的乙醇脫氫酶活性是受體菌的65。說(shuō)明自克隆菌株染色體上的ADH2基因至少有一個(gè)被插入破壞。2.4 遺傳穩(wěn)定性分析按方法所述, 分別挑選受體菌和自克隆菌株的單菌落各100個(gè), 進(jìn)行遺傳穩(wěn)定性分析。結(jié)果顯示, 受體菌的100個(gè)單菌落在YEPD培養(yǎng)基上都能生長(zhǎng), 而在含有6 mmol/L CuSO4的YEPD培養(yǎng)基上不能生長(zhǎng)。自克隆菌株的100個(gè)單菌落在YEPD培養(yǎng)基和含有6 mmol/L CuSO4的YEPD培養(yǎng)基上均能生長(zhǎng)。結(jié)果說(shuō)明, 自克隆菌株有很強(qiáng)的遺傳穩(wěn)定性。2.5 自克隆菌株的小型發(fā)酵實(shí)驗(yàn)按方法所述進(jìn)行小試實(shí)驗(yàn), 每4天取樣檢測(cè), 結(jié)果顯示(圖4), 第8天自克隆菌株的谷胱甘

19、肽含量比受體菌YSF31的高34?？梢?jiàn)GSH1基因拷貝數(shù)的增加使谷胱甘肽合成提高。而ADH2基因的破壞, 使ADH II酶活性明顯降低, 自克隆菌株的酶活是受體菌的65。自克隆菌株的其他發(fā)酵指標(biāo)如-N氨基酸同化率、真正發(fā)酵度等與受體菌基本相同(表2)。由CO2減重實(shí)驗(yàn)和真正發(fā)酵度的檢測(cè)結(jié)果可以看出, 自克隆菌株的發(fā)酵速度和發(fā)酵度基本沒(méi)有發(fā)生變化, 說(shuō)明遺傳修飾沒(méi)有影響酵母的發(fā)酵能力。圖4 自克隆菌株和受體菌的谷胱甘肽含量和ADH酶活比較Fig. 4 GSH content and ADH II activity of the self-cloning strain and host表2發(fā)酵指標(biāo)

20、的檢測(cè)Table 2 Fermentation profilesProfilesYSF31Self-cloning strainCO2 weight reducing (g/L)11.8410.32Flocculation (%)88.6688.70-N-amino acid assimilation (%)53.6053.12Real degree fermentation (%)67.3066.903 討論本研究通過(guò)同源重組, 使酵母染色體上ADH2基因內(nèi)部DNA片段被CUP1基因和GSH1基因所取代, 獲得1株低ADH酶活, 高GSH含量的啤酒酵母工程菌, 并初步測(cè)定了工程菌的生理生化指

21、標(biāo)。在ADH2基因內(nèi)部插入的GSH1基因, 使啤酒酵母工程菌的GSH含量增加。由于GSH是水溶性的小分子多肽, 在啤酒發(fā)酵期間, 酵母細(xì)胞生成的部分GSH能分泌到發(fā)酵液。在發(fā)酵后期, 部分酵母細(xì)胞發(fā)生自溶, 這也能使部分GSH釋放到發(fā)酵液中, 因此在成品啤酒中的GSH含量也就相應(yīng)增加, 提高啤酒的抗老化能力。ADH2基因被破壞, ADH酶活降低, 理論上將使酵母在發(fā)酵后期氧化乙醇的能力變?nèi)? 減少后期乙醛生成的量。同時(shí)菌株的發(fā)酵能力并沒(méi)有明顯的變化, 這為下一步低乙醛含量工程菌的獲得提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)和基礎(chǔ)。經(jīng)過(guò)遺傳修飾的啤酒酵母用來(lái)發(fā)酵生產(chǎn)啤酒, 其生物安全性是個(gè)重要的問(wèn)題。本研究利用自克隆技術(shù)

22、, 有針對(duì)地對(duì)啤酒酵母進(jìn)行遺傳修飾。而且整個(gè)遺傳操作過(guò)程中涉及到的銅抗性篩選標(biāo)記基因CUP1和-谷氨酰半胱氨酸合成酶基因GSH1均來(lái)源于啤酒酵母YSF31本身, 沒(méi)有任何外源基因的參與, 所以具有生物安全性。獲得的基因工程菌具有重要的應(yīng)用價(jià)值。參 考 文 獻(xiàn)1 Margalith PZ. Flavor Microbiology. Springfield, Illinois: Charles C Thomas Publishers, 1981, pp.233-234.2 Adams MR, Moss MO. Food Microbiology. Cambridge, UK: Royal Soci

23、ety of Chemistry, 1995, p.290.3 Orna CH, Gisela S. Roles of the glutathione- and thioredoxin- dependent reduction systems in the Escherichia coli and Saccharomyces cerevisiae responses to oxidative stress. Ann Rev Microbiol, 2000, 54: 439-461.4 Fu XY, He XP, Guo XN, et al. Increasing glutathione for

24、mation by functional expression of the -glutamyl- cysteine synthetase gene in Saccharomyces cerevisiae. Biotechnology Letters, 2004, 26(5): 415-417.5 Michael GS, Shelley GD, Michael S, et al. Microbial synergy via an ethanol- triggered pathway. Mol Cell Biol, 2004, 24(9): 3874-3884.6 Sambrook J, Fri

25、tseh EF, Maniatis T. Molecular cloning- a laboratory manual. 3rd Ed. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001, p.33.7 Burke D, Dawson D, Stearns T. Methods in yeast genetics-A cold spring harbor laboratory course manual. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2000, pp.109-111.8 Schiestl RH, Gietz RD. High efficiency transformatio