打靶載體構(gòu)建

1、利用同源重組技術(shù)進(jìn)行打靶載體的構(gòu)建孔 冬小鼠遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)室南京大學(xué)模式動(dòng)物研究所基本原理傳統(tǒng)意義上的打靶載體的構(gòu)建受基因組DNA上限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)的強(qiáng)烈局限?？紤]到后期利用Southern雜交進(jìn)行陽(yáng)性克隆篩選時(shí)的內(nèi)切酶是否可以區(qū)分重組和野生型染色體，同時(shí)顧及同源臂兩端的內(nèi)切酶是否能與常用載體的多克隆位點(diǎn)相匹配，最后可供我們進(jìn)行選擇的打靶區(qū)域往往非常有限。而近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的基于噬菌體的大腸桿菌同源重組系統(tǒng)為我們擺脫這種束縛提供了一個(gè)有效的平臺(tái)。高效、省時(shí)、靈活是該系統(tǒng)的三大特點(diǎn)。2004年底小鼠129品系BAC文庫(kù)末端測(cè)序的完成更為這一技術(shù)的應(yīng)用提供了巨大的便利。大腸桿菌中同源重組的研究由來(lái)已久，

2、其原理如圖1所示。圖1而Neal G. Copeland, Nancy A. Jenkins 以及 Donald L. Court實(shí)驗(yàn)室所采用的噬菌體RED系統(tǒng)較之前代又有以下優(yōu)勢(shì)：高效；所需同源序列由500bp 降至45bp；低突變率。為使此系統(tǒng)能便利的應(yīng)用于條件性基因敲除打靶載體的構(gòu)建，他們建立了兩個(gè)大腸桿菌菌株EL250、EL350；三個(gè)質(zhì)粒 pL253、pL451、pL452 （圖譜見(jiàn)附錄）。兩個(gè)菌株中的gam 基因以及RED重組酶基因exo和bet均受溫度敏感性抑制子cI857的嚴(yán)格調(diào)控。抑制子在32處于活化狀態(tài)，而其在42的短暫失活能使其控制的基因迅速表達(dá)。此外，EL250中的Fl

3、pe 及EL350中的Cre重組酶基因則受阿拉伯糖誘導(dǎo)的PBAD啟動(dòng)子的調(diào)控，在阿拉伯糖的參與下進(jìn)行表達(dá)。這兩個(gè)菌株可以有效地去除loxP 或 FRT重組位點(diǎn)間的NEO篩選框。質(zhì)粒 pL253、pL451、pL452均來(lái)源于pBlue/Script 載體，分別用于打靶載體的骨架，loxPFRT-NEO-FRT、或loxP-NEO-loxP片段的PCR擴(kuò)增。利用此系統(tǒng)構(gòu)建條件性打靶載體的基本步驟如圖2所示。自Sanger 研究所定購(gòu)的129 BAC克隆被裝入DH108菌株以瓊脂為載體進(jìn)行郵寄。為使后續(xù)操作易于進(jìn)行，我們首先從100200 Kb的BAC中將包含左右同源臂的目的片段（約1020Kb）

4、套取下來(lái)（見(jiàn)圖3A）。pL253 載體中的兩段同源序列各長(zhǎng)500bp，是以129基因組DNA為模板，用PCR的方法獲得，經(jīng)內(nèi)切酶消化后連接克隆入pL253載體。利用介于兩段同源序列之間的線性化位點(diǎn)進(jìn)行線性化的pL253載體在EL350中與BAC發(fā)生同源重組。陽(yáng)性克隆可用氨芐青霉素篩選獲得。插入loxP位點(diǎn)的原理如圖3B所示。包含兩段各長(zhǎng)80bp同源序列的loxP-NEO/Kan-loxP 片段同樣以PCR制備，所不同的是該同源序列包含在PCR的引物進(jìn)行合成。同源重組后的質(zhì)粒同時(shí)具有氨芐青霉素和卡那霉素抗性。重新將質(zhì)粒抽提物轉(zhuǎn)入EL350中可以去除菌株中其它未發(fā)生重組的質(zhì)粒。加入阿拉伯糖后Cre

5、重組酶的表達(dá)可以將loxP位點(diǎn)間的NEO剪切掉，從而只留下一個(gè)loxP。同樣道理我們可以在EL250中插入第二個(gè)loxP。FRTNEO/KanFRT 留在載體中可用于ES細(xì)胞的篩選。最終的載體用測(cè)序的方法進(jìn)行驗(yàn)證。圖2圖3實(shí)驗(yàn)技術(shù)以下以基因MLCK(myosin light chain kinase)為例，其載體構(gòu)建過(guò)程如圖4E 所示。129 小鼠品系 BAC 克隆的查詢及訂購(gòu)1 前往，點(diǎn)擊Mouse（如箭頭所示）。2 在Search框內(nèi)尋找目的基因，例如p53。3 在檢索結(jié)果中選則所要的項(xiàng)。4 點(diǎn)擊View gene in genomic location后面的鏈接。5 滾動(dòng)頁(yè)面到圖示位置，

6、點(diǎn)擊DAS Source，選擇129S7/AB2.2 clones和BAC ends選項(xiàng)。6 點(diǎn)擊close menu，等待頁(yè)面刷新。滾動(dòng)頁(yè)面到圖示位置，綠色和紅色（代表在克隆內(nèi)不同的方向）的線條都代表包含Trp53的BAC克隆，左邊線條下是克隆號(hào)。7 任選一個(gè)克隆比如bMQ358p19，點(diǎn)擊克隆號(hào)出現(xiàn)下拉菜單，點(diǎn)擊DAS LINK: bMQ358p09。8 滾動(dòng)頁(yè)面到圖示位置，點(diǎn)擊MTA required（箭頭所示處）9 從Sanger定購(gòu)BAC需完成兩部分表格：（1）網(wǎng)上電子表格 （2）MTA表格，此表格需傳真并郵寄原樣。登陸 網(wǎng)站查詢目的基因。 BAC 的抽提及純化 試劑：Solutio

7、n I:Tris-HCl0.05 MEDTA 0.01 MpH 8.0Solution II:SDS1% NaOH0.2 MSolution III:KAc5 MpH 5.5步驟:1搜集細(xì)菌。9000 rpm 離心10分鐘，倒掉上清；2加入 5ml 預(yù)冷的Solution I及 20ul 25mg/ml RNaseA，重懸；3加入5ml SolutionII,上下顛倒 510次，室溫放置10 分鐘；4加入 5ml 預(yù)冷的 SolutionIII，上下顛倒 510次， 冰放置10 分鐘；510，000 rpm 離心10 分鐘，收集上清到新離心管，如仍有白色沉淀物懸浮，重復(fù)離心一次；6加入12ml

8、 異丙醇，振蕩器混勻；710，000 rpm離心10分鐘，倒掉上清，留下白色DNA沉淀；8重懸入 500 ul SolutionI，加等體積1：1 酚氯仿，振蕩器混勻；912，000 rpm 離心5分鐘，將上層吸入新的1.5 ml離心管中，注意不要吸入白色沉淀；10加50ul 3M NaAc pH 5.2, 以及350 ul 異丙醇，混勻并在12，000 rpm離心10分鐘；11 倒掉上清，加入500ul 70 乙醇，12，000 rpm離心 5分鐘；12倒掉上清，將DNA沉淀在空氣中涼干；13用100 ul MilliQ 水溶解DNA。電轉(zhuǎn)感受態(tài)細(xì)菌的制備及BAC電轉(zhuǎn)1. 接種單克隆EL35

9、0/EL250至3 ml LB培養(yǎng)基中，32 240 rpm 培養(yǎng)1216 小時(shí)； 2. 第二天，將過(guò)夜菌液1ml 接種到 50ml LB培養(yǎng)基，32 240rpm培養(yǎng)23 小時(shí)至OD6000.50.7；3. (如只轉(zhuǎn)BAC而不進(jìn)行同源重組，此步省略) 將10ml菌液分裝到200ml錐形瓶，置于42水浴搖床中（約40rpm）保溫15分鐘；4. 將錐形瓶置于冰上20分鐘，此間將pH7.4 MilliQ水，以及電轉(zhuǎn)杯，離心管置于冰上預(yù)冷；5. 于4離心機(jī)3，500 rpm 離心5分鐘將菌液沉淀；6. 以1ml 冰水將菌體輕輕重懸，3，500 rpm離心5分鐘，倒掉上清；7. 重復(fù)步驟6 三次；8.

10、 倒掉上清，余下約50ul用以懸浮菌體；9. 將此感受態(tài)細(xì)菌與100400 ng DNA（必須溶于MilliQ）混合并轉(zhuǎn)入預(yù)冷的0.1cM電轉(zhuǎn)杯中，置于冰上準(zhǔn)備轉(zhuǎn)化；10. 設(shè)置BIORAD電轉(zhuǎn)儀，1.75KV，25uF，200,進(jìn)行電轉(zhuǎn)；11. 電擊后，迅速加入500 ul SOC并于32保溫30分鐘；12 將菌液均勻的涂在相應(yīng)的LB瓊脂板上，于32保溫1220小時(shí)PCR引物設(shè)計(jì)及PCR純化MI-L 5- GCGGCCGCTGTCCCTACTCCTAATTTGTCC -3MI-R 5- AAGCTTAGTGTGTTGGGGACATGGCT -3MII-L 5- AAGCTTGCAAACCTC

11、AGACATCAGGG-3MII-R 5- ACTAGTGGGAAGCACCTGAAATCTGG-3Ploxp L 5-TGAAGTACCCAAGGACTACAAGAAAGGTTCATGAGGAAATAAATGGCTGGCAGTCACTGGTAAGAGGAGAGTTTGAAGGTGAATTCCTGCAGCCCAATTCCGATC-3Ploxp R 5-CTGACTGGAAAAGGAGCCAGATACATATTGGCAAGCTCTGGTCTCCTCAGCCCAGCCTCCTGACTCCTCCACCATGTCTGGCTCTAGAACTAGTGGATCCCCTCG -3Pfrt L: 5-AGCAG

12、TCTGCTAGCCTTGGGACCCCTGTACCCACTGTCCTCCTGACTTCTTGTCTAATCTTATCTTTTTAACATATAAATTCGACGGTATCGATAAGCTTGATATCGAATTCC-3Pfrt R: 5-CCCCATGATTTGCCTCTAGTAGTGTAGAAACAGGAAAGATGAATGAATGGATGGGAGTAAGACCATTTTCTGTTTTCTTATCGCTCTAGAACTAGTGGATCCACCTAATAACTTC-3其中MI，M II兩對(duì)引物用于擴(kuò)增兩段各長(zhǎng)500bp同源序列I 和II。PCR產(chǎn)物與T載體連接，然后分別用Not I ,Hin

13、d III 和HindIII，SpeI 將片段I 和II切下來(lái)，同時(shí)連入Not I, Spe I酶切過(guò)的PL253載體，這樣就構(gòu)建好了用于套取目的片段的載體I-II-PL253。其中Hind III將用于該載體線性化。PLoxp這對(duì)引物用于擴(kuò)增兩端各長(zhǎng)80bp同源序列的loxP-NEO/Kan-loxP 片段，而引物Pfrt用來(lái)擴(kuò)增兩端各長(zhǎng)80bp同源序列的FRTNEO/KanFRT片段。以上PCR產(chǎn)物以及酶切片段均用 QIAquick Gel Extrcction Kit 純化。 套取BAC中的目的片段將轉(zhuǎn)入BAC的EL350制備成電轉(zhuǎn)感受態(tài)，同時(shí)將線性化的載體I-II-PL253轉(zhuǎn)入其中（

14、100200ng/50 ul感受態(tài)菌）。電轉(zhuǎn)后的菌用Amp+ 的LB板篩選。其中發(fā)生準(zhǔn)確交換而形成的質(zhì)粒MLCK-PL253的酶切圖譜如圖4A 所示。插入loxP-NEO/Kan-loxP 片段 將上述含有MLCK-PL253的EL350制備成電轉(zhuǎn)感受態(tài)，并將純化的loxP-NEO/Kan-loxP片段轉(zhuǎn)入其中（100200ng/50 ul感受態(tài)菌）。電轉(zhuǎn)后用Amp+ Kan+ 的LB板篩選。為了得到插入loxP-NEO/Kan-loxP 片段的純的質(zhì)粒MLCK-PL253 1stLoxp,我們還需將上面篩選得到的質(zhì)粒重新轉(zhuǎn)入EL350中，并用Amp+ Kan+ 篩選。質(zhì)粒MLCK-PL253

15、 1stLoxp的酶切圖譜如圖4B所示。Cre介導(dǎo)的loxP 位點(diǎn)間NEO片段的去除1. 將含有l(wèi)oxP-NEO/Kan-loxP質(zhì)粒的EL350克隆接種到3ml LB培養(yǎng)基（Amp+ Kan+）中, 32 240rpm 培養(yǎng)1216小時(shí)；2. 第二天，將1ml 過(guò)夜菌液轉(zhuǎn)入10ml LB，32 培養(yǎng) 23小時(shí)至OD6000.5;3. 加入100ul 10% L(+)-阿拉伯糖，繼續(xù)培養(yǎng)1小時(shí)；4. 將菌液稀釋后分別涂在氨芐青霉素和卡那霉素LB瓊脂板上，32培養(yǎng)過(guò)夜5. 氨芐青霉素板上的克隆應(yīng)遠(yuǎn)遠(yuǎn)多于卡那霉素板。在前者上挑取幾個(gè)克隆培養(yǎng)并用PCR，酶切或測(cè)序方法進(jìn)行驗(yàn)證。 其中NEO去除后的質(zhì)

16、粒MLCK-PL253 1stLoxP pop out的酶切圖譜如圖4C所示。插入FRTNEO/KanFRT片段 將質(zhì)粒MLCK-PL253 1stLoxp pop out轉(zhuǎn)入EL250，并制備成電轉(zhuǎn)感受態(tài)，同時(shí)將純化的片段FRTNEO/KanFRT轉(zhuǎn)入其中（100200ng/50 ul感受態(tài)菌）。電轉(zhuǎn)后的菌用Amp+ Kan+進(jìn)行篩選。得到的質(zhì)粒再轉(zhuǎn)入EL250，通過(guò)Amp+ Kan+ 篩選得到純的目的載體。插入該片段的質(zhì)粒 MLCK-PL253 1stLoxP 2ndLoxP的酶切圖譜如圖4D所示。 目的載體經(jīng)過(guò)測(cè)序，確認(rèn)正確后就可用于ES細(xì)胞的電轉(zhuǎn)。圖4 (A) MLCK-PL253酶切

17、圖譜 (lane 1, HindIII; lane 2, EcoRI). (B) MLCK-PL253 1stLoxP酶切圖譜(lane 2, HindIII; lane 3, EcoRI). (C) MLCK-PL253 1stLoxP pot out酶切圖譜(lane 2, HindIII; lane 3, EcoRI). (D) MLCK-PL253 1stLoxP 2ndLoxP 酶切圖譜(lane 2, HindIII; lane 3, EcoRI). (E) MLCK 打靶載體構(gòu)建過(guò)程. M 代表Marker EcoR 14 digest. 實(shí)驗(yàn)試劑及耗材參考文獻(xiàn)1. Lee, E

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