免疫熒光技術(shù)

1、 免疫熒光技術(shù)免疫熒光技術(shù) 威斯騰生物技術(shù)中心威斯騰生物技術(shù)中心 威斯騰生物成立威斯騰生物成立12周年慶周年慶主要內(nèi)容主要內(nèi)容技術(shù)原理技術(shù)原理1實(shí)驗(yàn)流程實(shí)驗(yàn)流程2注意事項(xiàng)注意事項(xiàng)3常見問題常見問題4 免疫熒光技術(shù)免疫熒光技術(shù)(immunofluorescence)技術(shù)原理技術(shù)原理將免疫學(xué)方法免疫學(xué)方法(抗原抗體特異結(jié)合)與熒光標(biāo)記技術(shù)熒光標(biāo)記技術(shù)結(jié)合起來研究特異蛋白抗原在研究特異蛋白抗原在細(xì)胞內(nèi)分布細(xì)胞內(nèi)分布的方法。由于熒光素所發(fā)的熒光可在熒光顯微鏡下檢出，熒光素受激發(fā)光的照射而發(fā)出明亮的熒光（黃綠色或桔紅色），可以看見熒光所在的細(xì)胞或組織，利用定量技術(shù)測(cè)定含量，從而可對(duì)抗原進(jìn)行細(xì)胞細(xì)胞定性和

2、定性和定位定位分析分析。根據(jù)實(shí)驗(yàn)方法分類：根據(jù)實(shí)驗(yàn)方法分類： 直接法 間接法 補(bǔ)體法 其他補(bǔ)體法：補(bǔ)體法：利用補(bǔ)體反應(yīng)，通過形成 抗原-抗體-補(bǔ)體復(fù)合物發(fā)射熒光。其他免疫熒光技術(shù)：其他免疫熒光技術(shù)： 時(shí)間分辨免疫熒光分析 熒光偏振免疫分析技術(shù)時(shí)間分辨免疫熒光測(cè)定時(shí)間分辨免疫熒光測(cè)定時(shí)間分辨熒光免疫測(cè)定（TRFIA）是一種非同位素免疫分析技術(shù)，它用鑭系元素標(biāo)記抗原或抗體，根據(jù)鑭系元素螯合物的發(fā)光特點(diǎn)，用時(shí)間分辨技術(shù)測(cè)量熒光，同時(shí)檢測(cè)波長(zhǎng)和時(shí)間兩個(gè)參數(shù)進(jìn)行信號(hào)分辨，可有效地排除非特異熒光的干擾，極大地提高了分析靈敏度。 熒光偏振免疫分析技術(shù)熒光偏振免疫分析技術(shù)熒光偏振免疫分析法(fluoresce

3、nce polarization immunoassay，F(xiàn)PIA)是一種定量免疫分析技術(shù)，其基本原理是熒光物質(zhì)經(jīng)單一平面的藍(lán)偏振光(485nm)照射后，吸收光能躍入激發(fā)態(tài)，隨后回復(fù)至基態(tài)，并發(fā)出單一平面的偏振熒光(525nm)。偏振熒光的強(qiáng)弱程度與熒光分子的大小呈正相關(guān)，與其受激發(fā)時(shí)轉(zhuǎn)動(dòng)的速度呈反相關(guān)。FPIA最適宜檢測(cè)小至中等分子物質(zhì)，常用于藥物、激素的測(cè)定。 激光共聚焦掃描顯微鏡激光共聚焦掃描顯微鏡（Confocal laser scanning microscopeConfocal laser scanning microscope，CLSMCLSM） 用激光作掃描光源，逐點(diǎn)、逐行、逐

4、面快速掃描成像，掃描的激光與熒光收集共用一個(gè)物鏡，物鏡的焦點(diǎn)即掃描激光的聚焦點(diǎn)，也是瞬時(shí)成像的物點(diǎn)。系統(tǒng)經(jīng)一次調(diào)焦，掃描限制在樣品的一個(gè)平面內(nèi)。調(diào)焦深度不一樣時(shí)，就可以獲得樣品不同深度層次的圖像，這些圖像信息都儲(chǔ)于計(jì)算機(jī)內(nèi)，通過計(jì)算機(jī)分析和模擬，就能顯示細(xì)胞樣品的立體結(jié)構(gòu)。激光共聚焦掃描顯微鏡既可以用于觀察細(xì)胞形態(tài)，也可以用于細(xì)胞內(nèi)生化成分的定量分析、光密度統(tǒng)計(jì)以及細(xì)胞形態(tài)的測(cè)量, 配合焦點(diǎn)穩(wěn)定系統(tǒng)可以實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)時(shí)間活細(xì)胞動(dòng)態(tài)觀察。熒光顯微鏡的不足之處：熒光顯微鏡的不足之處：1、無法實(shí)現(xiàn)對(duì)熒光、透射光的同時(shí)采集，無法實(shí)現(xiàn)多重?zé)晒獾耐瑫r(shí)采集和共定位。2、熒光的散射光太強(qiáng)，造成實(shí)際分辨率的大大下降。3

5、、熒光漂白及對(duì)細(xì)胞組織的照射損傷。4、無法對(duì)樣品進(jìn)行斷層掃描，完成3D的工作。5、濾鏡對(duì)熒光信號(hào)衰減大，靈敏度和熒光強(qiáng)度不夠。6、可以觀察活細(xì)胞和組織，但是細(xì)胞或組織內(nèi)機(jī)構(gòu)高度重疊。7、只能在二維壞境下觀察。8、樣品不能太厚。9、放大倍率小。 熒光常見基礎(chǔ)術(shù)語(yǔ)：熒光常見基礎(chǔ)術(shù)語(yǔ)：熒光物質(zhì)：熒光物質(zhì)：某些物質(zhì)在特定波長(zhǎng)范圍內(nèi)的光線照射下，可發(fā)出波長(zhǎng)比照射光長(zhǎng)的光線，即熒光。受激發(fā)后能產(chǎn)生熒光的物質(zhì)稱為熒光物質(zhì)或熒光素。激發(fā)光：激發(fā)光：能特異性地激發(fā)某種熒光素的一定波長(zhǎng)范圍內(nèi)的光線稱為該熒光素的激發(fā)光。熒光探針：熒光探針：能產(chǎn)生熒光的特異性生物染料（PI，DAPI）、標(biāo)有熒光素的特異性蛋白結(jié)合物（

6、熒光抗體）。自發(fā)熒光：自發(fā)熒光：組織和細(xì)胞中某些成分受激發(fā)時(shí)可發(fā)出熒光，即自發(fā)熒光。漂白：漂白：熒光物質(zhì)受激發(fā)時(shí)，其發(fā)射熒光的能力逐漸下降并最終喪失，即漂白現(xiàn)象。多激光器系統(tǒng)（多通道激光檢測(cè)）：多激光器系統(tǒng)（多通道激光檢測(cè)）：在可見光范圍內(nèi)使用多譜線氬離子激光器，發(fā)射波長(zhǎng)為457nm、488nm和514nm的藍(lán)綠光，氦氖綠HeNe（G）激光器提供發(fā)射波長(zhǎng)為543nm的綠光，氦氖紅HeNe（R）激光器發(fā)射波長(zhǎng)為633nm的紅光，新的405nm的半導(dǎo)體激光器的出現(xiàn)可以提供近紫外譜線。 目前常用于標(biāo)記抗體的熒光素有以下幾種：目前常用于標(biāo)記抗體的熒光素有以下幾種：異硫氰酸熒光異硫氰酸熒光(fluore

7、scein isothiocyanate, FITC) FITC純品為黃色或橙黃色結(jié)晶粉末，易溶于水和酒精溶劑。有兩種異構(gòu)體，其中異構(gòu)體型在效率、穩(wěn)定性與蛋白質(zhì)結(jié)合力等方面都更優(yōu)良。FITC分子量為389.4，最大吸收光波長(zhǎng)為490495nm，最大發(fā)射光波長(zhǎng)為520530nm，呈現(xiàn)明亮的黃綠色熒光黃綠色熒光。FITC在冷暗干燥處可保存多年，是目前應(yīng)用最廣泛的熒光素。其主要優(yōu)點(diǎn)是人眼對(duì)黃綠色較為敏感，通常切片標(biāo)本中的綠色熒光少于紅色。四乙基羅丹明四乙基羅丹明(rhodamine, RB200) RB200為橘紅色粉末，不溶于水，易溶于酒精和丙酮，性質(zhì)穩(wěn)定，可長(zhǎng)期保存。最大吸收光波長(zhǎng)為 570nm

8、，最大發(fā)射光波長(zhǎng)為595600nm，呈現(xiàn)橘紅色熒光橘紅色熒光。四甲基異硫氰酸羅丹明四甲基異硫氰酸羅丹明(tetramethyl rhodamine isothiocynate, TRITC) TRITC為羅丹明的衍生物，呈紫紅色粉末，較穩(wěn)定。最大吸收光波長(zhǎng)為 550nm，最大發(fā)射光波長(zhǎng)為620nm，呈現(xiàn)橙紅色熒光橙紅色熒光，與FITC的翠綠色熒光對(duì)比鮮明，可配合用于雙重標(biāo)記或?qū)Ρ热旧?。因其熒光淬滅慢，也可用于單?dú)標(biāo)記染色。酶作用后產(chǎn)生熒光的物質(zhì)酶作用后產(chǎn)生熒光的物質(zhì)某些化合物本身無熒光效應(yīng)，一旦經(jīng)酶作用便形成具有強(qiáng)熒光的物質(zhì)。某些化合物本身無熒光效應(yīng)，一旦經(jīng)酶作用便形成具有強(qiáng)熒光的物質(zhì)。例如，

9、4-甲基傘酮-D半乳糖苷受-半乳糖苷酶的作用分解成4-甲基傘酮，后者可發(fā)出熒光，激發(fā)光波長(zhǎng)為360nm，發(fā)射光波長(zhǎng)為450nm。其他如堿性磷酸酶的底物4-甲基傘酮磷酸鹽和辣根過氧化物酶的底物對(duì)羥基苯乙酸等。鑭系鑭系鑭系螯合物某些3價(jià)稀土鑭系元素如銪（Eu3）、鋱（Tb3）、鈰（Ce3）等的螯合物經(jīng)激發(fā)后也可發(fā)射特征性的熒光，其中以Eu3 應(yīng)用最廣。Eu3螯合物的激發(fā)光波長(zhǎng)范圍寬，發(fā)射光波長(zhǎng)范圍窄，熒光衰變時(shí)間長(zhǎng)，最適合用于分辨熒光免疫測(cè)定。藻紅蛋白藻紅蛋白（P-phycoerythrin，PE）PE是在紅藻中所發(fā)現(xiàn)的一種可進(jìn)行光合作用的自然熒光色素，分子量為240kD的蛋白，最大吸收峰為564

10、 nm，當(dāng)使用488 nm激光激發(fā)時(shí)其發(fā)射熒光峰值約為576 nm，對(duì)于單激光器的流式細(xì)胞儀來說，推薦使用58521nm的帶通濾光片，雙激光器的流式細(xì)胞儀推薦使用57513nm的帶通濾光片。FL2探測(cè)器檢測(cè)PE。多甲藻葉綠素蛋白多甲藻葉綠素蛋白 （PerCP）PerCP是在甲藻和薄甲藻的光學(xué)合成器中發(fā)現(xiàn)的，是一種蛋白復(fù)合物，分子量約為35kD，最大激發(fā)波長(zhǎng)的峰值在490nm附近，當(dāng)被488nm氬離子激光激發(fā)后，發(fā)射光的峰值約為677nm。FL3探測(cè)器檢測(cè)PerCP。碘化丙啶碘化丙啶（ propidium iodide，PI）可選擇性地嵌入核酸（DNA、RNA）的雙螺旋堿基對(duì)中。在對(duì)DNA染色時(shí)

11、，需用RNase對(duì)細(xì)胞進(jìn)行處理，以排除RNA對(duì)DNA熒光定量精度的影響。在488nm波長(zhǎng)激發(fā)下，PI的發(fā)射光譜為610-620nm。 FL2探測(cè)器檢測(cè)PI。 細(xì)細(xì)胞爬片免疫熒光實(shí)驗(yàn)流程胞爬片免疫熒光實(shí)驗(yàn)流程1. 細(xì)胞爬片的制作； 2. 固定（4%的多聚甲醛）； 3. 細(xì)胞膜通透（0.5%Triton X-100，20min）；4. 封閉（6%山羊血清，30min）； 5. 一抗孵育（一抗?jié)舛龋瑵窈校?過夜，PBS漂洗）； 6. 二抗孵育（二抗種屬，濕盒，室溫1h，避光，PBS漂洗）；7. 復(fù)染核（DAPI，避光，5min，PBS漂洗）；8. 封片（熒光淬滅劑的封片液）；9. 熒光顯微鏡下觀察采

12、集圖像。1. 1. 細(xì)胞的固定細(xì)胞的固定【固定的定義】【固定的定義】將新鮮的活體組織或細(xì)胞，立即加入固定液中，以此使細(xì)胞保持原有形態(tài)、結(jié)構(gòu)的一種方法?！竟潭ǖ囊饬x】【固定的意義】1、組織和細(xì)胞的蛋白質(zhì)凝固，終止內(nèi)源性或外源性酶反應(yīng)，原位保存抗原，避免抗原失活或彌散。2、停止細(xì)胞中的生化反應(yīng)，固定其中的各種生化物質(zhì)狀態(tài)，防止細(xì)胞死亡后出現(xiàn)自溶分解。3、使細(xì)胞中蛋白質(zhì)、脂肪、糖、酶等成分轉(zhuǎn)變?yōu)椴蝗苄晕镔|(zhì)，以保持生前形態(tài)。4、固定細(xì)胞形態(tài)，防止其變形或破裂。5、使組織內(nèi)各種物質(zhì)產(chǎn)生不同的折光率，便于觀察和鑒定。6、使不同組織成分對(duì)染料有不同的親和力，便于染色。免疫熒光實(shí)驗(yàn)流程中一些注意事項(xiàng)免疫熒光實(shí)

13、驗(yàn)流程中一些注意事項(xiàng)【固定液的選擇】【固定液的選擇】2 2、冰凍切片制備：、冰凍切片制備：建議用新鮮組織，否則組織細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)破壞，易使抗原彌散。建議用新鮮組織，否則組織細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)破壞，易使抗原彌散。選用干凈鋒利的刀片、組織一定要冷凍適度等，防止裂片和脫片嚴(yán)重。選用干凈鋒利的刀片、組織一定要冷凍適度等，防止裂片和脫片嚴(yán)重。 3 3、血清封閉：、血清封閉：為防止內(nèi)源性非特異性蛋白抗原的結(jié)合，需要在一抗孵育前先用血清（與二抗來源一致）為防止內(nèi)源性非特異性蛋白抗原的結(jié)合，需要在一抗孵育前先用血清（與二抗來源一致）封閉，減弱背景著色。封閉，減弱背景著色。封閉是血清與非特異性位點(diǎn)結(jié)合，以消除非特異性染

14、色，提高目的蛋白的準(zhǔn)確性和降低封閉是血清與非特異性位點(diǎn)結(jié)合，以消除非特異性染色，提高目的蛋白的準(zhǔn)確性和降低背景。背景。血清封閉的時(shí)間是可以調(diào)整的，一般血清封閉的時(shí)間是可以調(diào)整的，一般30min30min。 4 4、一抗孵育條件：、一抗孵育條件：在免疫熒光實(shí)驗(yàn)中最重要，包括孵育時(shí)間和抗體濃度；在免疫熒光實(shí)驗(yàn)中最重要，包括孵育時(shí)間和抗體濃度；一抗孵育溫度有幾種：一抗孵育溫度有幾種：4 4度、室溫、度、室溫、3737度，其中度，其中4 4度效果最佳；度效果最佳；孵育時(shí)間：這與溫度、抗體濃度有關(guān)，一般孵育時(shí)間：這與溫度、抗體濃度有關(guān)，一般3737度度1-2h1-2h，而，而4 4度過夜和從冰箱拿出后度

15、過夜和從冰箱拿出后3737度復(fù)溫度復(fù)溫45min45min；具體條件還要摸索。具體條件還要摸索。 6 6、復(fù)染：、復(fù)染：目的是形成細(xì)胞輪廓，從而更好地對(duì)目標(biāo)蛋白進(jìn)行定位；目的是形成細(xì)胞輪廓，從而更好地對(duì)目標(biāo)蛋白進(jìn)行定位；一般常用一般常用DAPIDAPI復(fù)染。復(fù)染。 7 7、封片：、封片：為了長(zhǎng)期保存，我們一般用緩沖甘油等封片，此外還有專門的抗熒光萃滅封片液；為了長(zhǎng)期保存，我們一般用緩沖甘油等封片，此外還有專門的抗熒光萃滅封片液；避免產(chǎn)生氣泡。避免產(chǎn)生氣泡。5 5、二抗孵育條件：、二抗孵育條件：二抗一般室溫或二抗一般室溫或3737度度30min-1h30min-1h，具體時(shí)間需要摸索；，具體時(shí)間

16、需要摸索；而濃度一般有工作液，若是濃縮液還要摸索濃度；而濃度一般有工作液，若是濃縮液還要摸索濃度；切記要避光反應(yīng)；切記要避光反應(yīng)；但在免疫熒光中我們一般先把二抗?jié)舛群头跤龝r(shí)間先定下，然后去摸索一抗?jié)舛群偷诿庖邿晒庵形覀円话阆劝讯節(jié)舛群头跤龝r(shí)間先定下，然后去摸索一抗?jié)舛群头跤龝r(shí)間；孵育時(shí)間；最后，熒光素標(biāo)記的二抗隨著保存時(shí)間的延長(zhǎng)，可能后有大量的游離熒光素殘留，最后，熒光素標(biāo)記的二抗隨著保存時(shí)間的延長(zhǎng)，可能后有大量的游離熒光素殘留，需要注意配制時(shí)小包裝和并進(jìn)行適當(dāng)?shù)碾x心。需要注意配制時(shí)小包裝和并進(jìn)行適當(dāng)?shù)碾x心。 8 8、切片清洗：、切片清洗：為了防止一抗、二抗等試劑殘留而引起非特異性染色，所

17、以適當(dāng)?shù)丶訌?qiáng)清洗（延長(zhǎng)時(shí)間為了防止一抗、二抗等試劑殘留而引起非特異性染色，所以適當(dāng)?shù)丶訌?qiáng)清洗（延長(zhǎng)時(shí)間和增多次數(shù)）尤為重要，一般在一抗的清洗是和增多次數(shù)）尤為重要，一般在一抗的清洗是5min5min* *3 3次；次；注意（注意（1 1）單獨(dú)沖洗，防止交叉反應(yīng)造成污染。）單獨(dú)沖洗，防止交叉反應(yīng)造成污染。 （2 2）溫柔沖洗，防止切片的脫落；）溫柔沖洗，防止切片的脫落； （3 3）沖洗的時(shí)間要足夠，才能徹底洗去結(jié)合的物質(zhì)。）沖洗的時(shí)間要足夠，才能徹底洗去結(jié)合的物質(zhì)。 （4 4）PBSPBS的的PHPH和離子強(qiáng)度的使用和要求，建議和離子強(qiáng)度的使用和要求，建議PHPH在在7.4-7.67.4-7.6

18、濃度是濃度是0.01M0.01M。（中性及弱鹼性條件（中性及弱鹼性條件（PH7-8PH7-8）有利于免疫復(fù)合物的形成，而酸性條件則有利于分解；）有利于免疫復(fù)合物的形成，而酸性條件則有利于分解； 低離子強(qiáng)度有利于免疫復(fù)合物的形成，而高離子強(qiáng)度則有利于分解）低離子強(qiáng)度有利于免疫復(fù)合物的形成，而高離子強(qiáng)度則有利于分解） 9 9、拍照：、拍照：封好片和用指甲油封固，保持避光和濕度；封好片和用指甲油封固，保持避光和濕度；正確使用熒光顯微鏡，防止紫外線對(duì)眼睛的損害；正確使用熒光顯微鏡，防止紫外線對(duì)眼睛的損害；檢查時(shí)間每次以檢查時(shí)間每次以12h12h為宜，超過為宜，超過90min90min，超高壓汞燈發(fā)光強(qiáng)

19、度逐漸下降，熒光減弱；，超高壓汞燈發(fā)光強(qiáng)度逐漸下降，熒光減弱；激發(fā)光長(zhǎng)時(shí)間的照射，會(huì)發(fā)生熒光的衰減和淬滅現(xiàn)象；所以最多不得超過激發(fā)光長(zhǎng)時(shí)間的照射，會(huì)發(fā)生熒光的衰減和淬滅現(xiàn)象；所以最多不得超過23h23h；熒光顯微鏡光源壽命有限，標(biāo)本應(yīng)集中檢查，以節(jié)省時(shí)間，保護(hù)光源。后欲再啟用熒光顯微鏡光源壽命有限，標(biāo)本應(yīng)集中檢查，以節(jié)省時(shí)間，保護(hù)光源。后欲再啟用時(shí)，須待燈光充分冷卻后才能點(diǎn)燃，一天中應(yīng)避免數(shù)次點(diǎn)燃光源，關(guān)閉汞燈至少在時(shí)，須待燈光充分冷卻后才能點(diǎn)燃，一天中應(yīng)避免數(shù)次點(diǎn)燃光源，關(guān)閉汞燈至少在開啟開啟15-3015-30分鐘后；分鐘后；時(shí)效性：標(biāo)本染色后立即觀察，因時(shí)間久了熒光會(huì)逐漸減弱。若將標(biāo)本放

20、在聚乙烯時(shí)效性：標(biāo)本染色后立即觀察，因時(shí)間久了熒光會(huì)逐漸減弱。若將標(biāo)本放在聚乙烯塑料袋中塑料袋中4 4保存，可延緩熒光減弱時(shí)間，防止封裱劑蒸發(fā)；保存，可延緩熒光減弱時(shí)間，防止封裱劑蒸發(fā)；使用的玻片等載體，都必須厚度均勻，無明顯的自發(fā)熒光，如果使用油鏡，還必須使用的玻片等載體，都必須厚度均勻，無明顯的自發(fā)熒光，如果使用油鏡，還必須保證鏡油為無熒光鏡油；保證鏡油為無熒光鏡油；電源最好裝穩(wěn)壓器，否則電壓不穩(wěn)不僅會(huì)降低汞燈的壽命，也會(huì)影響鏡檢的效果。電源最好裝穩(wěn)壓器，否則電壓不穩(wěn)不僅會(huì)降低汞燈的壽命，也會(huì)影響鏡檢的效果。免疫熒光技術(shù)常見問題免疫熒光技術(shù)常見問題1 1、石蠟切片和冰凍切片的比較？、石蠟切

21、片和冰凍切片的比較？ （1 1）要求做冰凍切片的不一定能做石蠟切片，因?yàn)樽魇炃衅瑫r(shí)要高溫烤片，可能）要求做冰凍切片的不一定能做石蠟切片，因?yàn)樽魇炃衅瑫r(shí)要高溫烤片，可能會(huì)破壞組織的抗原性，如果組織的抗原性較穩(wěn)定，則可作石蠟切片；但是要求做石蠟會(huì)破壞組織的抗原性，如果組織的抗原性較穩(wěn)定，則可作石蠟切片；但是要求做石蠟切片的，可作冰凍切片。切片的，可作冰凍切片。 （2 2）冰凍切片的優(yōu)點(diǎn)是能夠較好的保存組織的抗原免疫活性，做免疫熒光時(shí)不需抗）冰凍切片的優(yōu)點(diǎn)是能夠較好的保存組織的抗原免疫活性，做免疫熒光時(shí)不需抗原修復(fù)這一步。缺點(diǎn)是細(xì)胞內(nèi)易形成冰晶而破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，可能會(huì)使抗原彌散；切片原修復(fù)這一步。

22、缺點(diǎn)是細(xì)胞內(nèi)易形成冰晶而破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，可能會(huì)使抗原彌散；切片厚度較石蠟的厚，做的片子沒石蠟的漂亮。當(dāng)你買一抗時(shí)，目錄上都寫著做什么樣的厚度較石蠟的厚，做的片子沒石蠟的漂亮。當(dāng)你買一抗時(shí)，目錄上都寫著做什么樣的切片，如果它寫著只能做冰凍，就不能做石蠟，如寫著兩者都可，那就都能做。切片，如果它寫著只能做冰凍，就不能做石蠟，如寫著兩者都可，那就都能做。 （3 3）石蠟切片的優(yōu)點(diǎn)可以保持組織細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)，且容易存放在室溫，而冰凍切）石蠟切片的優(yōu)點(diǎn)可以保持組織細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)，且容易存放在室溫，而冰凍切片比較麻煩，一定要存在片比較麻煩，一定要存在-80-80度的低溫冰箱中。由于石蠟切片可以切到度的低溫冰

23、箱中。由于石蠟切片可以切到4 4微米左右，抗微米左右，抗體容易滲透到組織中去，而且得到的顏色體容易滲透到組織中去，而且得到的顏色/ /形態(tài)都較冰凍切片好。形態(tài)都較冰凍切片好。 2 2、一抗的選擇要點(diǎn)和技巧是什么？、一抗的選擇要點(diǎn)和技巧是什么？ （1 1）單克隆和多克隆抗體的選擇。由一種克隆產(chǎn)生的特異性抗體叫做單克隆抗體。單克隆）單克隆和多克隆抗體的選擇。由一種克隆產(chǎn)生的特異性抗體叫做單克隆抗體。單克隆抗抗體能目標(biāo)明確地與單一的特異抗原決定簇結(jié)合，就像導(dǎo)彈精確地命中目標(biāo)一樣。另一方面，體能目標(biāo)明確地與單一的特異抗原決定簇結(jié)合，就像導(dǎo)彈精確地命中目標(biāo)一樣。另一方面，即使是同一個(gè)抗原決定簇，在機(jī)體內(nèi)

24、也可以由好幾種克隆來產(chǎn)生抗體，形成好幾種單克隆抗即使是同一個(gè)抗原決定簇，在機(jī)體內(nèi)也可以由好幾種克隆來產(chǎn)生抗體，形成好幾種單克隆抗體混雜物，稱為多克隆抗體。在抗原抗體反應(yīng)中，一般單克隆抗體特異性強(qiáng)，但親和力相對(duì)體混雜物，稱為多克隆抗體。在抗原抗體反應(yīng)中，一般單克隆抗體特異性強(qiáng)，但親和力相對(duì)小，檢測(cè)抗原靈敏度相對(duì)就低；而多克隆抗體特異性稍弱，但抗體的親和力強(qiáng)，靈敏度高，小，檢測(cè)抗原靈敏度相對(duì)就低；而多克隆抗體特異性稍弱，但抗體的親和力強(qiáng)，靈敏度高，但易出現(xiàn)非特異性染色（可以通過封閉等避免）。但易出現(xiàn)非特異性染色（可以通過封閉等避免）。 （2 2）應(yīng)用范圍的選擇。有的一抗只能用于）應(yīng)用范圍的選擇。有

25、的一抗只能用于Western blottingWestern blotting，或免疫組化、免疫熒光、免，或免疫組化、免疫熒光、免疫疫沉淀等；甚至表明石蠟切片或冰凍切片。沉淀等；甚至表明石蠟切片或冰凍切片。 （3 3）種屬反應(yīng)性的選擇（）種屬反應(yīng)性的選擇（species reactivityspecies reactivity）。這一點(diǎn)很重要，表明這種抗體可能）。這一點(diǎn)很重要，表明這種抗體可能存存在種屬差異，且這種抗體適合檢測(cè)哪種種屬動(dòng)物體內(nèi)的抗原。在種屬差異，且這種抗體適合檢測(cè)哪種種屬動(dòng)物體內(nèi)的抗原。 （4 4）種屬來源，一般兔來源的多是多克?。欢∈髞碓吹亩嗍菃慰寺?，但也有另外。根）種屬來

26、源，一般兔來源的多是多克??；而小鼠來源的多是單克隆，但也有另外。根據(jù)此來源來選擇相應(yīng)的二抗。據(jù)此來源來選擇相應(yīng)的二抗。 （5 5）生產(chǎn)廠家的選擇。如）生產(chǎn)廠家的選擇。如santa Cruzsanta Cruz公司抗體一般公司抗體一般1ml1ml，價(jià)格，價(jià)格21002100元左右；而元左右；而chemiconchemicon公司一抗一般公司一抗一般100ul100ul，價(jià)格，價(jià)格28002800元左右。這兩個(gè)廠家的同一種抗體它的實(shí)際效價(jià)穩(wěn)定是不元左右。這兩個(gè)廠家的同一種抗體它的實(shí)際效價(jià)穩(wěn)定是不同的，我一般用后者抗體做免疫組化效果較好，而前者做同的，我一般用后者抗體做免疫組化效果較好，而前者做We

27、stern blottingWestern blotting效果還可以。效果還可以。 3 3、在什么情況下使用、在什么情況下使用Triton-X100Triton-X100 （1 1）Triton X-100Triton X-100化學(xué)名稱為聚乙二醇辛基苯基醚，是一種去污劑。在免疫組織化學(xué)名稱為聚乙二醇辛基苯基醚，是一種去污劑。在免疫組織化學(xué)（化學(xué)（10um10um厚切片）和免疫細(xì)胞化學(xué)中一般用厚切片）和免疫細(xì)胞化學(xué)中一般用Triton X-100 Triton X-100 作為細(xì)胞通透劑，作為細(xì)胞通透劑，在膜上打孔。在膜上打孔。 （2 2）其作用原理：）其作用原理：Triton X-100

28、Triton X-100 可以溶解細(xì)胞膜、細(xì)胞核膜、細(xì)胞器膜上的脂可以溶解細(xì)胞膜、細(xì)胞核膜、細(xì)胞器膜上的脂質(zhì)而使抗體及大分子結(jié)構(gòu)的物質(zhì)進(jìn)入胞漿和胞核內(nèi)，故在細(xì)胞免疫組化時(shí)尤為推質(zhì)而使抗體及大分子結(jié)構(gòu)的物質(zhì)進(jìn)入胞漿和胞核內(nèi)，故在細(xì)胞免疫組化時(shí)尤為推薦使用，這樣抗體就能順利進(jìn)入胞內(nèi)與相應(yīng)抗原結(jié)合。薦使用，這樣抗體就能順利進(jìn)入胞內(nèi)與相應(yīng)抗原結(jié)合。 （3 3）Triton X-100Triton X-100既是一種表面活性劑，也有抗氧化作用。既是一種表面活性劑，也有抗氧化作用。4 4、封閉血清的選擇原則是什么？、封閉血清的選擇原則是什么？ （1 1）膜上或切片上有剩余的位點(diǎn)可以非特異性吸附抗體，造成后

29、續(xù)結(jié)果的假）膜上或切片上有剩余的位點(diǎn)可以非特異性吸附抗體，造成后續(xù)結(jié)果的假陽(yáng)性！陽(yáng)性！ （2 2）封閉血清一般是和二抗同一來源的，血清中動(dòng)物自身的抗體，預(yù)先能和）封閉血清一般是和二抗同一來源的，血清中動(dòng)物自身的抗體，預(yù)先能和組織中有交叉反應(yīng)的位點(diǎn)發(fā)生結(jié)合，否則在后面的步驟中如果和二抗發(fā)生結(jié)組織中有交叉反應(yīng)的位點(diǎn)發(fā)生結(jié)合，否則在后面的步驟中如果和二抗發(fā)生結(jié)合，會(huì)造成背景。合，會(huì)造成背景。 （3 3）也可以用小牛血清、）也可以用小牛血清、BSABSA、羊血清等，但不能與一抗來源一致。、羊血清等，但不能與一抗來源一致。5 5、抗體孵育條件的比較？、抗體孵育條件的比較？ （1 1）一抗孵育溫度有幾種：

30、）一抗孵育溫度有幾種：4 4度、室溫、度、室溫、3737度，其中度，其中4 4度效果最佳；孵育時(shí)間：這與溫度效果最佳；孵育時(shí)間：這與溫度、抗體濃度有關(guān)，一般度、抗體濃度有關(guān)，一般3737度度1-2h1-2h，而，而4 4度過夜和從冰箱拿出后度過夜和從冰箱拿出后3737度復(fù)溫度復(fù)溫45min45min。 （2 2）二抗一般室溫或）二抗一般室溫或3737度度30min-1h30min-1h，具體時(shí)間需要摸索。，具體時(shí)間需要摸索。 6 6、一抗、一抗4 4度孵育后為什么要進(jìn)行度孵育后為什么要進(jìn)行3737度復(fù)溫？度復(fù)溫？ （1 1）一方面，防止切片從）一方面，防止切片從4 4度直接放入度直接放入PBS

31、PBS易脫片；易脫片； （2 2）另一方面，使抗原抗體結(jié)合更穩(wěn)定。一般不需要，但對(duì)表達(dá)較弱的抗原可能有，）另一方面，使抗原抗體結(jié)合更穩(wěn)定。一般不需要，但對(duì)表達(dá)較弱的抗原可能有，4 4度和度和3737度時(shí)分子運(yùn)動(dòng)方式不同，前者分子碰撞機(jī)率和運(yùn)動(dòng)速度小于后者，后者結(jié)合更度時(shí)分子運(yùn)動(dòng)方式不同，前者分子碰撞機(jī)率和運(yùn)動(dòng)速度小于后者，后者結(jié)合更快，但敏感性也提高了并易造成非特異染色。快，但敏感性也提高了并易造成非特異染色。7 7、如何最大限度地降低組織非特異性染色？、如何最大限度地降低組織非特異性染色？ （1 1）縮短一抗）縮短一抗/ /二抗孵育時(shí)間、稀釋抗體來控制。這是最重要的一條。二抗孵育時(shí)間、稀釋抗

32、體來控制。這是最重要的一條。 （2 2）一抗用多克隆抗體易出現(xiàn)非特異性著色，建議試用單克隆抗體看看。）一抗用多克隆抗體易出現(xiàn)非特異性著色，建議試用單克隆抗體看看。 （3 3）非特異性組分與抗體結(jié)合，這需要通過延長(zhǎng)二抗來源的動(dòng)物免疫血清封閉時(shí)）非特異性組分與抗體結(jié)合，這需要通過延長(zhǎng)二抗來源的動(dòng)物免疫血清封閉時(shí)間和適當(dāng)增加濃度來加強(qiáng)封閉效果；間和適當(dāng)增加濃度來加強(qiáng)封閉效果； （4 4）適當(dāng)增加）適當(dāng)增加PBSPBS沖洗次數(shù)和浸洗時(shí)間，在一抗、二抗孵育之后的浸洗尤為重要；沖洗次數(shù)和浸洗時(shí)間，在一抗、二抗孵育之后的浸洗尤為重要； （5 5）防止標(biāo)本染色過程中出現(xiàn)干片，這容易增強(qiáng)非特異性著色。）防止標(biāo)本染色過程中出現(xiàn)干片，這容易增強(qiáng)非特異性著色。8 8、背景染色較深的原因有哪些？、背景染色較深的原因有哪些？ （1 1）抗體濃度過高：一抗?jié)舛冗^高是常見的原因之一。解決辦法是，每次使用新抗體）抗體濃度過高：一抗?jié)舛冗^高是常見的原因之一。解決辦法是，每次使用新抗體前應(yīng)當(dāng)對(duì)其工作濃