分子生物復(fù)習(xí)寶典

1、分子生物學(xué)葵花寶典編者按：以下內(nèi)容幾乎包含了分子生物學(xué)的所有重點(diǎn)，但肯定要大于考試范圍，望各位同學(xué)在周四課結(jié)束后，根據(jù)老師的重點(diǎn)復(fù)習(xí)。1、基因:能夠表達(dá)和產(chǎn)生蛋白質(zhì)和RNA的DNA序列，是決定遺傳性狀的功能單位。2、基因組:細(xì)胞或生物體的一套完整單倍體的遺傳物質(zhì)的總和。3、端粒:以線(xiàn)性染色體形式存在的真核基因組DNA末端都有一種特殊的結(jié)構(gòu)叫端粒。該結(jié)構(gòu)是一段DNA序列和蛋白質(zhì)形成的一種復(fù)合體，僅在真核細(xì)胞染色體末端存在。4、操縱子:是指數(shù)個(gè)功能上相關(guān)的結(jié)構(gòu)基因串聯(lián)在一起，構(gòu)成信息區(qū)，連同其上游的調(diào)控區(qū)（包括啟動(dòng)子和操縱基因）以及下游的轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)所構(gòu)成的基因表達(dá)單位，所轉(zhuǎn)錄的RNA為多順?lè)醋印?/p>

2、5、順式作用元件:是指那些與結(jié)構(gòu)基因表達(dá)調(diào)控相關(guān)、能夠被基因調(diào)控蛋白特異性識(shí)別和結(jié)合的特異DNA序列。包括啟動(dòng)子、上游啟動(dòng)子元件、增強(qiáng)子、加尾信號(hào)和一些反應(yīng)元件等。6、反式作用因子:是指真核細(xì)胞內(nèi)含有的大量可以通過(guò)直接或間接結(jié)合順式作用元件而調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄活性的蛋白質(zhì)因子。在反式作用因子中，可直接或間接結(jié)合RNA聚合酶的，稱(chēng)為轉(zhuǎn)錄因子。轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子結(jié)構(gòu)TF DNA結(jié)合域 酸性活域轉(zhuǎn)錄激活域脯氨酸富含域谷氨酰胺富含域蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)結(jié)合域 （二聚化結(jié)構(gòu)域）7、啟動(dòng)子:是RNA聚合酶特異性識(shí)別和結(jié)合的DNA序列。8、增強(qiáng)子:位于真核基因中遠(yuǎn)離轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)，能明顯增強(qiáng)啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄效率的特殊DNA序列。它可位

3、于被增強(qiáng)的轉(zhuǎn)錄基因的上游或下游，也可相距靶基因較遠(yuǎn)。9、基因表達(dá):是指生物基因組中結(jié)構(gòu)基因所攜帶的遺傳信息經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)錄、翻譯等一系列過(guò)程，合成特定的蛋白質(zhì)，進(jìn)而發(fā)揮其特定的生物學(xué)功能和生物學(xué)效應(yīng)的全過(guò)程。10信息分子:調(diào)節(jié)細(xì)胞生命活動(dòng)的化學(xué)物質(zhì)。其中由細(xì)胞分泌的調(diào)節(jié)靶細(xì)胞生命活動(dòng)的化學(xué)物質(zhì)稱(chēng)為細(xì)胞間信息分子；而在細(xì)胞內(nèi)傳遞信息調(diào)控信號(hào)的化學(xué)物質(zhì)稱(chēng)為細(xì)胞內(nèi)信息分子。11、受體:是存在于靶細(xì)胞膜上或細(xì)胞內(nèi)能特異識(shí)別生物活性分子并與之結(jié)合，進(jìn)而發(fā)生生物學(xué)效應(yīng)的的特殊蛋白質(zhì)。12、分子克隆:在體外對(duì)DNA分子按照即定目的和方案進(jìn)行人工重組，將重組分子導(dǎo)入合適宿主，使其在宿主中擴(kuò)增和繁殖，以獲得該DNA分子

4、的大量拷貝。13、蛋白激酶:是指能夠?qū)⒘姿峒瘓F(tuán)從磷酸供體分子轉(zhuǎn)移到底物蛋白的氨基酸受體上的一大類(lèi)酶。14、蛋白磷酸酶:是具有催化已經(jīng)磷酸化的蛋白質(zhì)分子發(fā)生去磷酸化反應(yīng)的一類(lèi)酶分子，與蛋白激酶相對(duì)應(yīng)存在，共同構(gòu)成了磷酸化和去磷酸化這一重要的蛋白質(zhì)活性的開(kāi)關(guān)系統(tǒng)。15、基因工程:有目的的通過(guò)分子克隆技術(shù)，人為的操作改造基因，改變生物遺傳性狀的系列過(guò)程。16、 載體:能在連接酶的作用下和外源DNA片段連接并運(yùn)送DNA分子進(jìn)入受體細(xì)胞的DNA分子。17、轉(zhuǎn)化:指質(zhì)粒DNA或以它為載體構(gòu)建的重組DNA導(dǎo)入細(xì)菌的過(guò)程。18、感染:以噬菌體、粘性質(zhì)粒和真核細(xì)胞病毒為載體的重組DNA分子，在體外經(jīng)過(guò)包裝成具有

5、感染能力的病毒或噬菌體顆粒，才能感染適當(dāng)?shù)募?xì)胞，并在細(xì)胞內(nèi)擴(kuò)增。19、轉(zhuǎn)導(dǎo):指以噬菌體為載體，在細(xì)菌之間轉(zhuǎn)移DNA的過(guò)程，有時(shí)也指在真核細(xì)胞之間通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)移和獲得細(xì)胞DNA的過(guò)程。20、轉(zhuǎn)染:指病毒或以它為載體構(gòu)建的重組子導(dǎo)入真核細(xì)胞的過(guò)程。21、DNA變性:在物理或化學(xué)因素的作用下，導(dǎo)致兩條DNA鏈之間的氫鍵斷裂，而核酸分子中的所有共價(jià)鍵則不受影響。22、DNA復(fù)性:當(dāng)促使變性的因素解除后，兩條DNA鏈又可以通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合形成DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)。23、退火:指將溫度降至引物的TM值左右或以下，引物與DNA摸板互補(bǔ)區(qū)域結(jié)合形成雜交鏈。24、筑巢PCR:先用一對(duì)外側(cè)引物擴(kuò)增含目的基因的

6、大片段，再用內(nèi)側(cè)引物以大片段為摸板擴(kuò)增獲取目的基因?？梢蕴岣逷CR的效率和特異性。25、原位PCR:以組織固定處理細(xì)胞內(nèi)的DNA或RNA作為靶序列，進(jìn)行PCR反應(yīng)的過(guò)程。26、定量PCR:基因表達(dá)涉及的轉(zhuǎn)錄水平的研究常需要對(duì)mRNA進(jìn)行定量測(cè)定，對(duì)此采用的PCR技術(shù)就叫定量PCR。27、基因打靶:是指通過(guò)DNA定點(diǎn)同源重組，改變基因組中的某一特定基因，從而在生物活體內(nèi)研究此基因的功能。28、DNA芯片:DNA芯片技術(shù)是指在固相支持物上原位合成寡核苷酸或者直接將大量的DNA探針以顯微打印的方式有序地固化于支持物表面，然后與標(biāo)記的樣品雜交，通過(guò)對(duì)雜交信號(hào)的檢測(cè)分析，即可獲得樣品的遺傳信息。由于常用

7、計(jì)算機(jī)硅芯片作為固相支持物，所以稱(chēng)為DNA芯片。29、錯(cuò)義突變:DNA分子中堿基對(duì)的取代，使得mRNA的某一密碼子發(fā)生變化，由它所編碼的氨基酸就變成另一種的氨基酸，使得多肽鏈中的氨基酸順序也相應(yīng)的發(fā)生改變的突變。30、無(wú)義突變:由于堿基對(duì)的取代，使原來(lái)可以翻譯某種氨基酸的密碼子變成了終止密碼子的突變。31、同義突變:堿基對(duì)的取代并不都是引起錯(cuò)義突變和翻譯終止，有時(shí)雖然有堿基被取代，但在蛋白質(zhì)水平上沒(méi)有引起變化，氨基酸沒(méi)有被取代，這是因?yàn)橥蛔兒蟮拿艽a子和原來(lái)的密碼子代表同一個(gè)氨基酸的突變。32、移碼突變:在編碼序列中，單個(gè)堿基、數(shù)個(gè)堿基的缺失或插入以及片段的缺失或插入等均可以使突變位點(diǎn)之后的三聯(lián)

8、體密碼閱讀框發(fā)生改變，不能編碼原來(lái)的蛋白質(zhì)的突變。33、癌基因:是細(xì)胞內(nèi)控制細(xì)胞生長(zhǎng)的基因，具有潛在的誘導(dǎo)細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的特性。當(dāng)癌基因結(jié)構(gòu)或表達(dá)發(fā)生異常時(shí)，其產(chǎn)物可使細(xì)胞無(wú)限制增殖，導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。包括病毒癌基因和細(xì)胞癌基因。34、細(xì)胞癌基因:存在于正常的細(xì)胞基因組中，與病毒癌基因有同源序列，具有促進(jìn)正常細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、分化和發(fā)育等生理功能。在正常細(xì)胞內(nèi)未激活的細(xì)胞癌基因叫原癌基因，當(dāng)其受到某些條件激活時(shí)，結(jié)構(gòu)和表達(dá)發(fā)生異常，能使細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化。35、病毒癌基因:存在于病毒（大多是逆轉(zhuǎn)錄病毒）基因組中能使靶細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化的基因。它不編碼病毒結(jié)構(gòu)成分，對(duì)病毒無(wú)復(fù)制作用，但是當(dāng)受到外界的條件激

9、活時(shí)可產(chǎn)生誘導(dǎo)腫瘤發(fā)生的作用。36、基因診斷:以DNA或RNA為診斷材料，通過(guò)檢查基因的存在、結(jié)構(gòu)缺陷或表達(dá)異常，對(duì)人體的狀態(tài)和疾病作出診斷的方法和過(guò)程。37、RFLP:即限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性，個(gè)體之間DNA的核苷酸序列存在差異，稱(chēng)為DNA多態(tài)性。若因此而改變了限制性?xún)?nèi)切酶的酶切位點(diǎn)則可導(dǎo)致相應(yīng)的限制性片段的長(zhǎng)度和數(shù)量發(fā)生變化，稱(chēng)為RFLP。38、基因治療:一般是指將限定的遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)入患者特定的靶細(xì)胞，以最終達(dá)到預(yù)防或改變特殊疾病狀態(tài)為目的治療方法。39、反義RNA:堿基序列正好與有意義的mRNA互補(bǔ)的RNA稱(chēng)為反義RNA?？梢宰鳛橐环N調(diào)控特定基因表達(dá)的手段。40、核酶:是一種可以催化RNA切

10、割和RNA剪接反應(yīng)的由RNA組成的酶，可以作為基因表達(dá)和病毒復(fù)制的抑制劑。41、三鏈DNA:當(dāng)某一DNA或RNA寡核苷酸與DNA高嘌呤區(qū)可結(jié)合形成三鏈，能特異地結(jié)合在DNA的大溝中，并與富含嘌呤鏈上的堿基形成氫鍵。42、SSCP:單鏈構(gòu)象多態(tài)性檢測(cè)是一種基于DNA構(gòu)象差別來(lái)檢測(cè)點(diǎn)突變的方法。相同長(zhǎng)度的單鏈DNA，如果堿基序列不同，形成的構(gòu)象就不同，這樣就形成了單鏈構(gòu)象多態(tài)性。43、管家基因:在生物體生命的全過(guò)程都是必須的，且在一個(gè)生物個(gè)體的幾乎所有細(xì)胞中持續(xù)表達(dá)的基因。44、基因表達(dá)就是基因的轉(zhuǎn)錄及翻譯，也包括RNA基因的轉(zhuǎn)錄。基因表達(dá)的規(guī)律性包含時(shí)間特異性和空間特異性?；虮磉_(dá)的方式有組成性

11、表達(dá)及可誘導(dǎo)或可阻遏表達(dá)。誘導(dǎo)和阻遏表達(dá)：可誘導(dǎo)基因在特定環(huán)境中表達(dá)增強(qiáng)的過(guò)程，稱(chēng)為誘導(dǎo)(induction)。如果基因?qū)Νh(huán)境信號(hào)應(yīng)答是被抑制，這種基因是可阻遏基因。可阻遏基因表達(dá)產(chǎn)物水平降低的過(guò)程稱(chēng)為阻遏(repression)?；虮磉_(dá)的調(diào)控（control of gene expression）是指對(duì)基因組中某一個(gè)基因或一些功能相近的基因表達(dá)的開(kāi)啟、關(guān)閉和表達(dá)強(qiáng)度的直接調(diào)節(jié)。它是生物在進(jìn)化過(guò)程中逐漸形成的精確而靈敏的生存和應(yīng)變能力。原核生物基因表達(dá)轉(zhuǎn)錄激活調(diào)控通常通過(guò)操縱子模式實(shí)現(xiàn)，并且以負(fù)性調(diào)節(jié)為主。而真核生物基因表達(dá)調(diào)控則更復(fù)雜，多是通過(guò)反式作用因子（轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子）與順式反應(yīng)元件（啟

12、動(dòng)子、增強(qiáng)子、沉默子）的相互作用而實(shí)現(xiàn)的，大多數(shù)是正性調(diào)節(jié)。45、SD序列:轉(zhuǎn)錄出的mRNA要進(jìn)入核糖體上進(jìn)行翻譯，需要一段富含嘌呤的核苷酸序列與大腸桿菌16S rRNA3，末端富含嘧啶的序列互補(bǔ)，是核糖體的識(shí)別位點(diǎn)。46、反義核酸技術(shù):是通過(guò)合成一種短鏈且與DNA或RNA互補(bǔ)的，以DNA或RNA為目標(biāo)抑制翻譯的反義分子，干擾目的基因的轉(zhuǎn)錄、剪接、轉(zhuǎn)運(yùn)、翻譯等過(guò)程的技術(shù)。47、核酸探針:探針是指能與某種大分子發(fā)生特異性相互作用，并在相互作用之后可以檢測(cè)出來(lái)的生物大分子。核酸探針是指能識(shí)別特異堿基順序的帶有標(biāo)記的一段DNA或RNA分子。48、周期蛋白:是一類(lèi)呈細(xì)胞周期特異性或時(shí)相性表達(dá)、累積與分

13、解的蛋白質(zhì)，它與周期素依賴(lài)性激酶共同影響細(xì)胞周期的運(yùn)行。49、CAP:是大腸桿菌分解代謝物基因活化蛋白，這種蛋白可將葡萄糖饑餓信號(hào)傳遞個(gè)許多操縱子，使細(xì)菌在缺乏葡萄糖時(shí)可以利用其他碳源。50、順?lè)醋樱╟istron）在反式構(gòu)型中不能互補(bǔ)的各突變型所占有的那部分DNA片斷（見(jiàn)互補(bǔ)測(cè)驗(yàn)）。51、結(jié)構(gòu)域 是指超二級(jí)結(jié)構(gòu)在空間上進(jìn)一步聚集形成的緊密穩(wěn)定的在蛋白質(zhì)分子上明顯可分的類(lèi)似球狀的結(jié)構(gòu)。52、分子生物學(xué)（molecular biology）是在分子水平上研究生命現(xiàn)象、生命本質(zhì)、生命活動(dòng)及其規(guī)律的學(xué)科。53、醫(yī)學(xué)分子生物學(xué) 從分子水平上研究人體在正常和疾病狀態(tài)下的生命活動(dòng)及其規(guī)律，從分子水平開(kāi)展人

14、類(lèi)疾病的預(yù)防、診斷和治療研究的一門(mén)科學(xué)。53、抑癌基因 是指存在于正常細(xì)胞內(nèi)的一大類(lèi)可抑制細(xì)胞生長(zhǎng)并具有潛在抑癌作用的基因，當(dāng)這類(lèi)基因在發(fā)生突變、缺失或失活時(shí)可引起細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。54、基因文庫(kù)（gene library，gene bank） 利用限制性?xún)?nèi)切酶將基因組DNA切成片段，每一DNA片段都與一個(gè)載體分子拼接成重組DNA。將所有的重組DNA分子都引入到宿主細(xì)胞并進(jìn)行擴(kuò)增，得到分子克隆的混合體，這樣一個(gè)混合體稱(chēng)為基因文庫(kù)。55、cDNA文庫(kù) 將cDNA的混合體與載體進(jìn)行連接，使每一個(gè)cDNA分子都與一個(gè)載體分子拼接成重組DNA。將所有的重組DNA分子都引入宿主細(xì)胞并進(jìn)行擴(kuò)增

15、，得到分子克隆的混合體，這樣一個(gè)混合體就稱(chēng)為cDNA文庫(kù)。56、表達(dá)載體（expressing vector）是用來(lái)在受體細(xì)胞中表達(dá)（轉(zhuǎn)錄和翻譯）外源基因的載體。這類(lèi)載體除具有克隆載體所具備的性質(zhì)以外，還帶有表達(dá)構(gòu)件轉(zhuǎn)錄和翻譯所必需的DNA序列。真核細(xì)胞病毒做載體；原核細(xì)胞質(zhì)粒、噬菌體做載體57、重組DNA技術(shù) 采用載體基因與某目的基因在體外重組的方法克隆DNA的技術(shù)，稱(chēng)為重組DNA技術(shù)。過(guò)程包括：目的基因的獲取、基因載體的選擇與構(gòu)建、目的基因與載體的拼接、重組DNA分子導(dǎo)入受體細(xì)胞、篩選并無(wú)性繁殖含重組體分子的受體細(xì)胞以及陽(yáng)性克隆的表達(dá)。二、 問(wèn)答題（一）、病毒、原核、真核基因組的特點(diǎn)？答:

16、 病毒基因組的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)1、病毒基因組小，結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單2、不同病毒基因組可以是不同結(jié)構(gòu)的核酸 3、基因組相關(guān)基因常叢集排列呈現(xiàn)轉(zhuǎn)錄單元4、病毒基因組的編碼序列大于905、基因有連續(xù)的和間斷的 6、有基因重疊現(xiàn)象。原核基因組結(jié)構(gòu)與功能的特點(diǎn) 1、基因組通常由一條環(huán)狀DNA分子組成。2、基因組中只有1個(gè)復(fù)制起始點(diǎn)。 3、基因操縱子結(jié)構(gòu)。4、編碼序列一般不重疊。5、基因是連續(xù)的，無(wú)內(nèi)含子，轉(zhuǎn)錄后不需要剪接（切）。6、編碼區(qū)在基因組中所占的比例（約占50）遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于真核基因組，但小于病毒基因組。非編碼區(qū)主要是一些調(diào)控序列。7、基因組中很少有重復(fù)序列。編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因多為單拷貝，而編碼rRNA的基因往往是多

17、拷貝的。8、細(xì)菌基因組中存在有可移動(dòng)的DNA序列，包括插入序列和轉(zhuǎn)座子。9、具有編碼同工酶的基因。10、在DNA分子中具有多種功能的識(shí)別區(qū)域，如復(fù)制的起始區(qū)、復(fù)制終止區(qū)、轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)區(qū)轉(zhuǎn)錄終止區(qū)等。真核生物基因組結(jié)構(gòu)與功能的特點(diǎn)1、每一種真核生物都有一定的染色體數(shù)目。2、基因組遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于原核生物基因組，具有許多復(fù)制起始點(diǎn)。3、真核基因都由一個(gè)結(jié)構(gòu)基因與相關(guān)的調(diào)控區(qū)組成，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為單順?lè)醋印?、真核生物含有大量重復(fù)順序。5、真核生物基因組內(nèi)非編碼序列占90以上。6、真核基因是斷裂基因。7、功能相關(guān)的基因構(gòu)成各種基因家族。8、真核生物基因組中也存在有一些可移動(dòng)的遺傳因素。（二）、乳糖操縱子的作用機(jī)制？答

18、:1、乳糖操縱子的組成:大腸桿菌乳糖操縱子含Z、Y、A三個(gè)結(jié)構(gòu)基因，分別編碼半乳糖苷酶、透酶和半乳糖苷乙酰轉(zhuǎn)移酶，此外還有一個(gè)操縱序列O，一個(gè)啟動(dòng)子P和一個(gè)調(diào)節(jié)基因I。2、阻遏蛋白的負(fù)性調(diào)節(jié):沒(méi)有乳糖存在時(shí)，I基因編碼的阻遏蛋白結(jié)合于操縱序列O處，乳糖操縱子處于阻遏狀態(tài)，不能合成分解乳糖的三種酶；有乳糖存在時(shí)，乳糖作為誘導(dǎo)物誘導(dǎo)阻遏蛋白變構(gòu)，不能結(jié)合于操縱序列，乳糖操縱子被誘導(dǎo)開(kāi)放合成分解乳糖的三種酶。所以，乳糖操縱子的這種調(diào)控機(jī)制為可誘導(dǎo)的負(fù)調(diào)控。3、CAP的正性調(diào)節(jié):在啟動(dòng)子上游有CAP結(jié)合位點(diǎn)，當(dāng)大腸桿菌從以葡萄糖為碳源的環(huán)境轉(zhuǎn)變?yōu)橐匀樘菫樘荚吹沫h(huán)境時(shí)，cAMP濃度升高，與CAP結(jié)合，使

19、CAP發(fā)生變構(gòu)，CAP結(jié)合于乳糖操縱子啟動(dòng)序列附近的CAP結(jié)合位點(diǎn)，激活RNA聚合酶活性，促進(jìn)結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄，調(diào)節(jié)蛋白結(jié)合于操縱子后促進(jìn)結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄，對(duì)乳糖操縱子實(shí)行正調(diào)控，加速合成分解乳糖的三種酶。4、協(xié)調(diào)調(diào)節(jié):乳糖操縱子中的I基因編碼的阻遏蛋白的負(fù)調(diào)控與CAP的正調(diào)控兩種機(jī)制，互相協(xié)調(diào)、互相制約。（三）、分子生物學(xué)研究的主要內(nèi)容核酸和蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能、基因組的結(jié)構(gòu)與功能-基因的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、表達(dá)、調(diào)控及生物學(xué)效應(yīng)；生物大分子之間的相互作用-這些相互作用構(gòu)成的細(xì)胞間通訊和細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)；對(duì)基因的結(jié)構(gòu)、功能表達(dá)調(diào)控的分析-基因的制備、改造、調(diào)控、應(yīng)用所需的各種技術(shù)體系。核酸是以核苷酸為基本組成

20、單位的生物大分子。天然存在的核酸有：DNA與RNA。核酸的基本組成單位是核苷酸。彼此靠磷酸二酯鍵相連形成多核苷酸鏈。不同的核苷酸組成不同的核酸。（四）、真核生物轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控機(jī)制？答:（1）、5，端加帽和3，端多聚腺苷酸化的調(diào)控意義:5，端加帽和3，端多聚腺苷酸化是保持mRNA穩(wěn)定的一個(gè)重要因素，它至少保證mRNA在轉(zhuǎn)錄過(guò)程中不被降解。（2）、mRNA選擇性剪接對(duì)基因表達(dá)調(diào)控的作用（3）、mRNA運(yùn)輸?shù)目刂疲ㄎ澹⑹荏w的特點(diǎn)？答:1、高度專(zhuān)一性；2、高度親和性；3、可逆性；4、可飽和性；5、特定的作用模式（六）、中心法則的主要內(nèi)容從DNA到DNA的復(fù)制（replication），從DNA到R

21、NA的轉(zhuǎn)錄（transcription），從RNA到蛋白質(zhì)的翻譯(translation),以及某些生物體的從RNA到DNA的逆轉(zhuǎn)錄(revrese transcription)。（七）、cAMP信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑？答:1、組成:胞外信息分子（主要是胰高血糖素、腎上腺素和促腎上腺皮質(zhì)激素），受體，G蛋白，AC，cAMP , PKA。2、途徑:1）信號(hào)分子與受體結(jié)合，引起受體構(gòu)象變化2）受體活化G蛋白3）活化后的G蛋白激活腺苷酸環(huán)化酶（AC）4）AC催化ATP生成cAMP5）cAMP活化PKA，PKA使目標(biāo)蛋白磷酸化，調(diào)節(jié)代謝酶的活性或調(diào)節(jié)基因的表達(dá)（八）、IP3-Ca2+信號(hào)途徑:6）信號(hào)分子與受體

22、結(jié)合，引起受體構(gòu)象變化7）受體活化G蛋白8）活化后的G蛋白激活PLC9）PLC水解PIP2生成IP3 和DG10）IP3 使鈣通道打開(kāi)，細(xì)胞內(nèi)Ca2+升高11）Ca2+與CaM結(jié)合，激活Ca2+-CaM依賴(lài)的蛋白激酶12）Ca2+-CaM依賴(lài)的蛋白激酶使目標(biāo)蛋白磷酸化。（九）、分子克隆中常用的工具酶及良好載體的條件？答:（1）、常用的工具酶重組DNA技術(shù)中常有的工具酶工具酶 功 能限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別特異序列，切割DNADNA連接酶連接DNA片段，使切口封合DNA聚合酶合成DNA，填補(bǔ)3末端逆轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA多聚核苷酸激酶使多聚核苷酸5末端磷酸化末端轉(zhuǎn)移酶使3羥基加尾堿性磷酸酶切除末端磷酸基

23、（2）、良好載體的條件1、必須有自身的復(fù)制子；2、載體分子上必須有限制性核酸內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)，即多克隆位點(diǎn)，以供外源DNA插入；3、載體應(yīng)具有可供選擇的遺傳標(biāo)志，以區(qū)別陽(yáng)性重組子和陰性重組子；4、載體分子必須有足夠的容量；5、可通過(guò)特定的方法導(dǎo)入細(xì)胞；6、對(duì)于表達(dá)載體還應(yīng)具備與宿主細(xì)胞相適應(yīng)的啟動(dòng)子、前導(dǎo)順序、增強(qiáng)子、加尾信號(hào)等DNA調(diào)控元件。（十）、藍(lán)-白篩選的原理？答:某些質(zhì)粒帶有大腸桿菌的半乳糖苷酶基因片段，在半乳糖苷酶基因的基因區(qū)外又另外引入了一段含多種單一限制酶位點(diǎn)的DNA序列。這些位點(diǎn)上如果沒(méi)有克隆外源性DNA片段，在質(zhì)粒被導(dǎo)入lac-的大腸桿菌后，質(zhì)粒攜帶的半乳糖苷酶基因?qū)⒄１?/p>

24、達(dá)，與大腸桿菌的半乳糖苷酶基因互補(bǔ)，產(chǎn)生有活性的半乳糖苷酶，加入人工底物X-gal和誘導(dǎo)劑IPTG后，出現(xiàn)藍(lán)色的菌落。如果在多克隆位點(diǎn)上插入外源DNA片段，將使lac Z基因滅活，不能生成半乳糖苷酶，結(jié)果菌落出現(xiàn)白色。由于這種顏色標(biāo)志，重組克隆和非重組克隆的區(qū)分一目了然。（十一）SANGER雙脫氧鏈終止法的原理？答:DNA鏈中核苷酸以3,5-磷酸二酯鍵連接，合成DNA所用的底物是 2-脫氧核苷三磷酸。2,3ddNTP與普通dNTP不同，它們?cè)诿撗鹾颂堑?位置缺少一個(gè)羥基。在DNA聚合酶作用下通過(guò)三磷酸基團(tuán)摻入到延伸的DNA鏈中，但由于沒(méi)有3羥基，不能同后續(xù)的dNTP形成磷酸二酯鍵，因此，正在延

25、伸的DNA鏈不能繼續(xù)延伸。在DNA合成反應(yīng)混合物的4種普通dNTP中加入少量的一種ddNTP，鏈延伸將與偶然發(fā)生但卻十分特異的鏈終止競(jìng)爭(zhēng)，產(chǎn)物是一系列的核苷酸鏈，其長(zhǎng)度取決于引物末端到出現(xiàn)過(guò)早鏈終止位置間的距離。在4組獨(dú)立酶反應(yīng)中分別采用4種不同的ddNTP，結(jié)果將產(chǎn)生4組寡核苷酸，它們將分別終止于模板鏈的A、C、G或T位置。（十二）、核酸分子雜交的原理？答:具有互補(bǔ)序列的兩條單鏈核酸分子在一定的條件下（適宜的溫度及離子強(qiáng)度等）堿基互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合，重新形成雙鏈；在這一過(guò)程中，核酸分子經(jīng)歷了變性和復(fù)性的變化，以及在復(fù)性過(guò)程中個(gè)分子間鍵的形成和斷裂。雜交的雙方是待測(cè)核酸和已知序列。（十三）、影響雜交

26、的因素？答:1、核酸分子的濃度和長(zhǎng)度:核酸濃度越大，復(fù)性速度越快。探針長(zhǎng)度應(yīng)控制在50-300個(gè)堿基對(duì)為好。2、溫度:溫度過(guò)高不利于復(fù)性，而溫度過(guò)低，少數(shù)堿基配對(duì)形成的局部雙鏈不易解離，適宜的溫度是較TM值低25度。3、離子強(qiáng)度:在低離子強(qiáng)度下，核酸雜交非常緩慢，隨著離子強(qiáng)度的增加，雜交反應(yīng)率增加。高濃度的鹽使堿基錯(cuò)配的雜交體更穩(wěn)定，所以進(jìn)行序列不完全同源的核酸分子雜交時(shí)必須維持雜交反應(yīng)液中的鹽濃度和洗膜液中的鹽濃度。4、雜交液中的甲酰胺:甲酰胺能降低核酸雜交的TM值。它有以下優(yōu)點(diǎn):在低溫下探針更穩(wěn)定；能更好地保留非共價(jià)結(jié)合的核酸。5、核酸分子的復(fù)雜性:是指存在于反應(yīng)體系中的不同順序的總長(zhǎng)度。

27、兩個(gè)不同基因組DNA變性后的相對(duì)雜交速率取決于樣品濃度絕對(duì)一致時(shí)的相對(duì)復(fù)雜性（即DNA中的堿基數(shù)）。6、非特異性雜交反應(yīng):在雜交前應(yīng)對(duì)非特異性雜交反應(yīng)位點(diǎn)進(jìn)行封閉，以減少其對(duì)探針的非特異性吸附作用。（十四）、探針的種類(lèi)和優(yōu)缺點(diǎn)？答:1、cDNA探針:通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA后，將其克隆于適當(dāng)?shù)目寺≥d體，通過(guò)擴(kuò)增重組質(zhì)粒而使cDNA得到大量的擴(kuò)增。提取質(zhì)粒后分離純化作為探針使用。它是目前應(yīng)用最為廣泛的一種探針。2、基因組探針:從基因組文庫(kù)里篩選得到一個(gè)特定的基因或基因片段的克隆后，大量擴(kuò)增、純化，切取插入片段，分離純化為探針。3、寡核苷酸探針:根據(jù)已知的核酸順序，采用DNA合成儀合成一定長(zhǎng)度的寡核

28、苷酸片段作為探針。4、RNA探針:采用基因克隆和體外轉(zhuǎn)錄的方法可以得到RNA或反義RNA作為探針。（十五）、探針的標(biāo)記法？答:1、缺口平移法:此法是利用適當(dāng)濃度的DNase 在DNA雙鏈上隨機(jī)切割單鏈，造成單鏈切口。切口處產(chǎn)生一個(gè)5末端和3末端，3末端就可以作為引物，在大腸桿菌DNA聚合酶的催化下，以互補(bǔ)的DNA單鏈為摸板，依次將dNTP連接到切口的3末端的羥基上，合成新的DNA單鏈；同時(shí)DNA聚合酶的53的核酸外切酶活性在切口處將舊鏈從5末端逐步切除，新合成鏈不斷延伸，從而使原DNA分子上的部分核苷酸殘基被標(biāo)記的核苷酸所取代。2、隨機(jī)引物法:隨機(jī)引物是人工合成的長(zhǎng)度為6個(gè)寡核苷酸殘基的寡聚核

29、苷酸片段的混合物。對(duì)于任何一個(gè)用作探針的DNA片段，隨機(jī)引物混合物中都會(huì)有一些六核苷酸片段可以與之結(jié)合，起到DNA合成引物的作用。將這些引物與變性的DNA單鏈結(jié)合后，以4種dNTP（其中一種是標(biāo)記物標(biāo)記的dNTP）為底物，合成與探針DNA互補(bǔ)的切帶有標(biāo)記物的DNA探針。3、PCR標(biāo)記法:在PCR反應(yīng)底物中，將一種dNTP換成標(biāo)記物標(biāo)記的dNTP， 這樣標(biāo)記的dNTP就在PCR反應(yīng)的同時(shí)摻入到新合成的DNA鏈上。4、末端標(biāo)記法:只是將DNA片段的一端進(jìn)行標(biāo)記。（十六）、PCR的基本原理？答:PCR是在試管中進(jìn)行的DNA復(fù)制反應(yīng)，基本原理是依據(jù)細(xì)胞內(nèi)DNA半保留復(fù)制的機(jī)理，以及體外DNA分子于不同

30、溫度下雙鏈和單鏈可以互相轉(zhuǎn)變的性質(zhì)，人為地控制體外合成系統(tǒng)的溫度，以促使雙鏈DNA變成單鏈，單鏈DNA與人工合成的引物退火，然后耐熱DNA聚合酶以dNTP為原料使引物沿著單鏈模板延伸為雙鏈DNA。PCR全過(guò)程每一步的轉(zhuǎn)換是通過(guò)溫度的改變來(lái)控制的。需要重復(fù)進(jìn)行DNA模板解鏈、引物與模板DNA結(jié)合、DNA聚合酶催化新生DNA的合成，即高溫變性、低溫退火、中溫延伸3個(gè)步驟構(gòu)成PCR反應(yīng)的一個(gè)循環(huán)，此循環(huán)的反復(fù)進(jìn)行，就可使目的DNA得以迅速擴(kuò)增。DNA模板變性:模板雙鏈DNA®單鏈DNA，94。退火:引物單鏈DNA®雜交鏈，引物的Tm值。引物的延伸:溫度至70 左右，

31、Taq DNA聚合酶以4種dNTP為原料，以目的DNA為模板，催化以引物3末端為起點(diǎn)的53DNA鏈延伸反應(yīng)，形成新生DNA鏈。新合成的引物延伸鏈經(jīng)過(guò)變性后又可作為下一輪循環(huán)反應(yīng)的模板PCR，就是如此反復(fù)循環(huán)，使目的DNA得到高效快速擴(kuò)增。（十七）、PCR引物設(shè)計(jì)的基本要求？答:1、引物長(zhǎng)度一般為1530個(gè)核苷酸。過(guò)短影響PCR的特異性，過(guò)長(zhǎng)會(huì)提高相應(yīng)退火溫度，使延伸溫度超過(guò)TaqDNA聚合酶最適溫度74,影響產(chǎn)物的生成。2、引物的堿基盡可能隨機(jī)，避免出現(xiàn)嘌呤、嘧啶堿基堆積現(xiàn)象。3端不應(yīng)有連續(xù)3個(gè)G和C。否則會(huì)使引物和模板錯(cuò)誤配對(duì)。G+C含量一般占45 -55。3端和5端引物具有相似的Tm值,T

32、m值計(jì)算公式:Tm4(G+C)+ 2(A+T)3、引物自身不應(yīng)存在互補(bǔ)序列以避免折疊成發(fā)夾結(jié)構(gòu)。引物的連續(xù)互補(bǔ)序列，一般不超過(guò)3bp。4、兩個(gè)引物之間不應(yīng)存在互補(bǔ)序列，尤其應(yīng)避免3端的互補(bǔ)重疊。5、引物與非特異擴(kuò)增區(qū)的序列的同源性不超過(guò)70，引物3末端連續(xù)8個(gè)堿基在待擴(kuò)增區(qū)以外不能有完全互補(bǔ)序列，否則易導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增。6、引物3端堿基是引發(fā)延伸的起點(diǎn)，因此一定要與模板DNA配對(duì)。引物3端最佳堿基選擇是G和C，形成的堿基配對(duì)比較穩(wěn)定。7、引物與模板結(jié)合時(shí)，引物的5端最多可以游離十幾個(gè)堿基而不影響PCR反應(yīng)的進(jìn)行。8、引物的5端可以修飾，如附加限制酶位點(diǎn)，引入突變位點(diǎn)，用生物素、熒光物質(zhì)、地高辛

33、標(biāo)記，加入其它短序列包括起始密碼子、終止密碼子等。（十八）、PCR的反應(yīng)條件？答:1、PCR反應(yīng)的緩沖液: ? Tris-HCl緩沖液? KCl 促進(jìn)引物的退火，濃度太高時(shí)會(huì)抑制Taq DNA聚合酶活性。? 加入BSA或明膠有利于保護(hù)TaqDNA聚合酶活性。? 必要時(shí)加入適量二甲基亞砜(DMSO)或甲酰胺利于破壞模板二級(jí)結(jié)構(gòu)，提高PCR反應(yīng)特異性。2、鎂離子濃度 一般用量1.5-2.0 mmol/L，Taq DNA聚合酶活性需要Mg 2+。Mg 2+濃度過(guò)低，會(huì)顯著降低酶活性。Mg 2+濃度過(guò)高又使酶催化非特異性擴(kuò)增增強(qiáng)。Mg 2+濃度還會(huì)影響引物的退火、模板與PCR產(chǎn)物的解鏈溫度，從而影響擴(kuò)

34、增片段的產(chǎn)率。 3、底物濃度 工作濃度20-200umol/L， dNTPs濃度過(guò)高可加快反應(yīng)速度，也增加堿基的錯(cuò)配率和實(shí)驗(yàn)成本。降低濃度會(huì)導(dǎo)致反應(yīng)速度下降，可提高反應(yīng)的特異性。在PCR反應(yīng)中，4種dNTP必須以等摩爾濃度配制，以減少PCR反應(yīng)的錯(cuò)配誤差并提高使用效率。4、Taq DNA聚合酶 75-80時(shí)具有最高的聚合酶活性，150個(gè)核苷酸/秒；具有良好的熱穩(wěn)定性，95仍有活性，應(yīng)用濃度一般為1-2.5u/100ul反應(yīng)體積。5、引物 0.1-0.5umol/L。引物濃度偏高會(huì)引起錯(cuò)配或非特異性擴(kuò)增、生成引物二聚體，使目的DNA片段產(chǎn)率下降。退火溫度與引物Tm值有關(guān)，引物Tm值在55-80

35、范圍較為理想。6、反應(yīng)溫度和循環(huán)次數(shù)（十九）、影響大腸桿菌系統(tǒng)外源基因表達(dá)的因素？答:1、啟動(dòng)子的強(qiáng)弱；2、基因的劑量；3、影響RNA轉(zhuǎn)錄和翻譯效率的因素:SD序列、mRNA；4、外源基因密碼子的選擇；5、表達(dá)產(chǎn)物的大??；6、表達(dá)產(chǎn)物的穩(wěn)定性。（二十）、大腸桿菌系統(tǒng)表達(dá)外源基因必須具備的條件？答:1、要求外源基因的編碼區(qū)不能含有內(nèi)含子；2、表達(dá)的外源片段要位于大腸桿菌啟動(dòng)子的下游，并形成正確的閱讀框架；3、轉(zhuǎn)錄出的mRNA必須有與大腸桿菌16S rRNA3，末端相匹配的SD序列，才能被有效的翻譯成蛋白質(zhì)。4、蛋白產(chǎn)物必須穩(wěn)定，不易被細(xì)胞內(nèi)蛋白酶快速降解，且對(duì)宿主無(wú)害。（二十一）、真核細(xì)胞表達(dá)外源基因的條件？答:1、首先必須具備哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)的功能元件。要求哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體帶有能在真核細(xì)胞中表達(dá)外源基因的真核轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件；2、注意選擇轉(zhuǎn)染的受體細(xì)胞，不同類(lèi)型的細(xì)胞具有不同的特性；3、注意選擇適當(dāng)?shù)倪x擇標(biāo)記。（二十二）、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的概念、原理及應(yīng)用？答:1、概念:是指用人工方法將外源基因?qū)牖蛘系交蚪M內(nèi)，并能穩(wěn)定傳代的一類(lèi)動(dòng)