茜素紅染色預(yù)實(shí)驗(yàn)(共5頁)

1、精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上茜素紅染色 成骨分化是干細(xì)胞的一個(gè)重要特性。在特定的誘導(dǎo)培養(yǎng)基作用一段時(shí)間后，干細(xì)胞可分化為成骨細(xì)胞，在細(xì)胞表面沉積鈣鹽，形成鈣結(jié)節(jié)。應(yīng)用茜素紅的復(fù)合物，可用于鑒定干細(xì)胞是否已成功向成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化1 實(shí)驗(yàn)?zāi)康模和ㄟ^茜素紅染色檢測(cè)細(xì)胞成骨分化2 實(shí)驗(yàn)原理：1.成骨誘導(dǎo)的過程是使鈣離子能夠以鈣鹽的方式沉淀下來，即“鈣結(jié)節(jié)”，鑒定鈣結(jié)節(jié)的染色方法常用茜素紅染色法。2.茜素紅：茜素磺酸鈉，茜素S，茜素紅S，茜素胭脂紅，1,2-二羥基蒽醌-3-磺酸鈉，1,2-二羥基蒽醌-3-磺酸鈉鹽。橙黃色或黃棕色粉末。易溶于水，微溶于乙醇，不溶于苯和氯仿。1%水溶液pH為2.15，其水溶液呈前

2、黃褐色，加鹽酸后變?yōu)辄S色，加氫氧化鈉后則變成藍(lán)紫色。有刺激性。能與許多金屬離子生成有色化合物，能與鋯、釷、鋁、鈦及鈣發(fā)生顯色反應(yīng)。3.染色原理：茜素紅與鈣發(fā)生顯色反應(yīng)，產(chǎn)生一種深紅色的帶色化合物，這樣成骨誘導(dǎo)的細(xì)胞外面沉積的鈣結(jié)節(jié)也就被染成了深紅色。三實(shí)驗(yàn)試劑及儀器 1.試劑：PBS 10%甲醛緩沖液 0.1%茜素紅-Tris-HCL染液 蒸餾水 2.儀器：倒置顯微鏡4 實(shí)驗(yàn)步驟1.棄培養(yǎng)液，PBS沖洗2次2.10%甲醛緩沖液固定10min3. 蒸餾水沖洗3次4. 加入0.1%茜素紅-Tris-HCL染液（pH8.3）,37下染色30min5. 蒸餾水沖洗6. 在倒置顯微鏡下觀察有無茜素紅染色

3、陽性細(xì)胞5 實(shí)驗(yàn)結(jié)果及討論 RT-PCR檢測(cè)PPARmRNA表達(dá)水平實(shí)驗(yàn)?zāi)康模憾繖z測(cè)干細(xì)胞中PPARmRNA的表達(dá)水平實(shí)驗(yàn)原理：1.由一條RNA單鏈轉(zhuǎn)錄為互補(bǔ)DNA（cDNA）稱作“逆轉(zhuǎn)錄”，由依賴RNA的（逆轉(zhuǎn)錄酶）來完成。隨后，DNA的另一條鏈通過脫氧核苷酸引物和依賴DNA的DNA聚合酶完成，隨每個(gè)循環(huán)倍增，即通常的PCR。原先的RNA模板被RNA酶H降解，留下互補(bǔ)DNA。2.RT-PCR的指數(shù)擴(kuò)增是一種很靈敏的技術(shù)，可以檢測(cè)很低拷貝數(shù)的RNA。RT-PCR廣泛應(yīng)用于遺傳病的診斷，并且可以用于定量監(jiān)測(cè)某種RNA的含量。檢測(cè)基因表達(dá)的方法，參見Northern Blot法。3.RT-PCR的關(guān)鍵步驟是在RNA的反轉(zhuǎn)錄，要求RNA模版為完整的且不含DNA、蛋白質(zhì)等雜質(zhì)。藥品及耗材：凝膠電泳檢測(cè)設(shè)備 PCR儀實(shí)驗(yàn)方法：1. 采用TRIzol提取總RNA，并用凝膠電泳檢測(cè)RNA含量。2. 取1g總RNA，用隨機(jī)引物和反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。3. 94，變性40s4. 48退火30s5. 72延伸40s6. 擴(kuò)增目的基因共循環(huán)反應(yīng)35次，末次結(jié)束循環(huán)7. 72再延長(zhǎng)反應(yīng)10min8. 擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳9. 使用Gelpro凝膠成像突向