重組人甲狀旁腺激素肽（1-34）在大腸桿菌中的高效融合表達及純化

1、重組人甲狀旁腺激素肽（1-34）在大腸桿菌中的高效融合表達及純化中國生物工程雜志ChinaBiotechnology,2006,26(3):2630重組人甲狀旁腺激素肽(134)在大腸桿菌中的高效融合表達及純化木李健峰肖紅劍姬秋彥李智華龍海亭閻玲梅羅娜徐維明(中國醫(yī)學科學院中國協(xié)和醫(yī)科大學醫(yī)學生物學研究所昆明650118)摘要人工合成人甲狀旁腺激素134肽段(PTH1-34)的cDNA序列,克隆到大腸桿菌蛋白表達載體pThioHis中,獲得了高表達菌株.經(jīng)發(fā)酵,破茵,金屬螯合層析,反相層析和凝膠層析后獲得了純度大于95%的hPTH1-34,hPTH1.34肽N端測序和質(zhì)譜分子量測定結(jié)果與天然P

2、TH1.34一致.生物學活性研究表明,hPTH1-34在體外具有刺激腺苷酸環(huán)化酶的作用.關鍵詞人甲狀旁腺激素大腸桿菌融合表達人甲狀旁腺激素(parathyroidhormone,PI1H)是生物體內(nèi)由甲狀旁腺主細胞分泌的一種多肽激素,在調(diào)節(jié)體液鈣磷濃度維持相對穩(wěn)定的過程中發(fā)揮著重要作用.PI1H分子是由84個氨基酸組成的一條直肽鏈,研究發(fā)現(xiàn),完整的多肽對其生物學活性是非必須的,發(fā)揮鈣磷調(diào)節(jié)作用僅需N端134氨基酸殘基組成的肽段【2l.PI1H1-34通過與受體結(jié)合后激活腺苷酸環(huán)化酶系統(tǒng)和蛋白激酶c的活性,改變骨吸收和骨合成的速率,影響骨代謝llJ.目前臨床研究顯示,PTH104在低濃度的間歇注

3、射可以促進骨合成速率,提高骨質(zhì)密度和骨質(zhì)量,有效治療低血鈣導致的骨質(zhì)疏松癥-3J.傳統(tǒng)的由動物組織中提取PTH的方法,效率和產(chǎn)量極低,限制了PTH的研究和應用,因此,利用基因工程技術高效地生產(chǎn)具有生物學活性的重組PTH134具有實際應用價值.利用基因工程技術,在大腸桿菌中高效融合表達了hPTH1-34,并對hPTH134發(fā)酵工藝和純化工藝進行了研究.l材料與方法1.1材料pThioHisA質(zhì)粒,E.coliDH5ct,E.coliBL21為本研究室保存;大鼠骨肉瘤細胞株ROS17/2.8來源于中收稿日期:2005-06-29修回日期:20051031云南省自然科學基金資助項目(2005C006

4、2M)通訊作者,電子信箱:xuwmyn國農(nóng)業(yè)大學生物學院;羊抗人PI1H1.34抗體購自SantaCruz公司;cAMP放射免疫分析試劑盒購自中國原子能科學研究院;各種工具酶購自TaKaRa公司及華美生物工程公司;牛腸激酶為本實驗室酵母表達生產(chǎn)所得.1.2人PTH1-34DNA片段的合成,克隆及融合表達載體的構建在不改變氨基酸序列的前提下,選擇來自WWW.kazusa.or.jp/code網(wǎng)站的大腸桿菌偏愛密碼子,并考慮二級結(jié)構因素,設計了編碼人PTH1-34的DNA序列.并在上游酶切位點BamHI和PTH1.34基因起始密碼子之間引入編碼腸激酶切割識別位點AspAspAspAspLys的堿基

5、序列GACGACGACGACAAG.設計后的基因由TaKaRa公司合成后,與BamHI和EcoRI雙酶切的載體pUC18連接.轉(zhuǎn)化EcoliDI-15a,篩選重組子和測序后,獲得了一個序列完全正確的質(zhì)粒,命名為pUC18.PTH(134).質(zhì)粒pUC18一erH(134)用BamHI和EcoRI雙酶切切下1bp小片段,與用BamIII和EcoRI雙酶切的pThioHis.A載體連接,獲得了表達硫氧還蛋白(Thioredoxin)和PTH134融合蛋白的質(zhì)粒pThioHis,PTH1-34.1.3工程菌的構建及融合蛋白的表達將表達質(zhì)粒pThioHisPTH1_34轉(zhuǎn)化到E.coliBL21中構建

6、了工程菌E.coliBL21一PTH1.34.該工程菌接入含有50g/ml氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中.37,180r/m,培養(yǎng)至OD6oo達O.40.6h,以終濃度為0.4mmol/L的IPTG誘導表達4h.取培養(yǎng)物1mI,離2006,26(3)李健峰等:重組人甲狀旁腺激素肽(134)在大腸桿菌中的高效融合表達及純化27心后采用SDSPAGE鑒定表達量.Westernblot鑒定所表達的融合蛋白,抗為羊抗人PTH134,二抗為堿性磷酸酶標記的馬抗羊IgG.1.4發(fā)酵培養(yǎng)1.4.1培養(yǎng)基組成LB種子培養(yǎng)基:每L含蛋白胨10g,酵母粉5g,NaC15g,pH7.0;高壓滅菌,使用時加入氨芐青霉素

7、至100p.g,/ml.發(fā)酵培養(yǎng)基:每L含蛋白胨6.67g,酵母粉3.33g,葡萄糖1.67g,KH2PO4?3H2O3.33g,NaC13.33g,MgSO4?7H201.67g,檸檬酸三鈉1.33g;高壓滅菌后使用.補料培養(yǎng)基:每L含蛋白胨20g,酵母粉10g,微量元素15ml,IPTG0.33g,維生素B10.033g,MgSO47.3g,檸檬酸3g,甘油100ml,甲硫氨酸0.33g,分別高壓和過濾后,混合備用.1.4.2發(fā)酵過程控制生長培養(yǎng):將保存的菌種劃平皿,挑取單個菌落,接種于LB種子培養(yǎng)基中,培養(yǎng)1416h后,再以1:30的比例擴大培養(yǎng)12h.然后接種于德國BraunC20發(fā)酵

8、罐中培養(yǎng),培養(yǎng)溫度30C,pH控制在6.87.2,罐壓為常壓,通過控制通氣量和純氧量使溶氧在30%以上.誘導培養(yǎng):待OD6oo達到5.0時,加IFq'G至終濃度為0.4mmol/L.升溫到36,誘導6h.誘導過程中根據(jù)養(yǎng)分消耗情況進行補料,約每間隔1h補料1次,并根據(jù)菌體生長情況調(diào)整pH和氧溶解度.1.5蛋白純化1.5.1融合蛋白的提取收集發(fā)酵菌體后,按6ml/g菌體(v/w)將菌體溶于A液(20mmol/LPB,0.2moLNaCI,pH8.0)中,冰浴超聲破菌;功率150W,時間30min;超聲液4,10000r/min離心30min.收集上清液.1.5.2融合蛋白的純化所有純化均

9、在AKTAexplorer純化儀上進行.ChelatingFF層析介質(zhì)預處理后裝柱,分別用50mmol/LEDTA,0.2mol/LNaOH,超純水洗柱,然后用5倍體積50mmol/L的NiSO4緩慢過柱;用5倍以上柱體積(CV)的A液平衡后,將含融合蛋白的上清液上柱;先用A液平衡后,用B液(20mmol/LPB,0.2mol/LNaCI,50mmol/L咪唑,pH8.0)梯度洗脫,梯度為A.100%B,洗脫10個柱體積;收集蛋白峰,SDS-PAGE鑒定.1.5.3hPTH(134)的純化取親和層析后的純化產(chǎn)物,按融合蛋白;腸激酶體積比1000:1加入腸激酶(EKase),4C酶切12h;用高

10、壓玻璃柱裝Sourse15RPC100ml(Pharmacia公司)制備反相層析柱,按凝膠說明書處理后.取酶切后的蛋白溶液上柱,用A液(0.3%三氟乙酸,)沖洗后,用B液(70%乙晴+0.3%三氟乙酸)梯度洗脫,梯度為A一100%B,洗脫體積為5個柱體積;檢測波長為215nm,收集蛋白峰,電泳鑒定hFq'H純度.凝膠過濾玻璃柱采用7.5cm×140em裝6000mlSuperdex一30(Pharmacia公司),取反相柱純化的樣品峰組分進一步過濾純化,洗脫液為20mmol/L磷酸緩沖液(PBpH7.5);檢測波長為215nm,收集蛋白峰,電泳鑒定hFq'H純度.1.

11、6理化和生物學活性測定用C18柱(Waters公司)的HPLC進行純度檢測.流動相為A:5%乙腈+0.1%三氟乙酸;B:95%乙腈+0.1%三氟乙酸.上樣量不低于20p.g,于215nm處檢測,按面積均一化計算峰面積.N末端15個氨基酸的測序由中國科學院昆明動物所完成,分子量由上?；瞪锛夹g有限公司用飛行時間質(zhì)譜(MALDITOFMS)測定.ROS17/2.8細胞在含10%小牛血清的F12培養(yǎng)基中培養(yǎng);細胞生長至對數(shù)生長期時,胰酶消化細胞,稀釋到1×10./ml,加2501xl稀釋的細胞到小管中;將待測樣品用含0.2mmol/LIBMX的培養(yǎng)液10倍系列稀釋.力日2501稀釋樣品到

12、細胞管中,37作用10min;離心收集細胞后,TE洗滌細胞;正丁醇抽提細胞內(nèi)cAMP,氮氣回流干燥;用放免試劑盒測定cAMP濃度,結(jié)果表示為pmo1.P.g蛋白;每個樣品稀釋度平行做3次,同時以Sigma公司hPTH134為陽性對照.2結(jié)果2.1融合表達載體的構建為了實現(xiàn)hF'TH1-34在大腸桿菌中的高效表達,采用大腸桿菌偏愛密碼子并調(diào)整了基因的二級結(jié)構,設計了如圖1所示的基因序列為了使純化的融合蛋白經(jīng)切割后能產(chǎn)生與天然Fq'H相同的N端,在該序列的5端引入了腸激酶切割識別位點的核甘酸序列.構建后的表達質(zhì)粒pThioHisPTH1-34,經(jīng)BamHI和EcoRI雙酶切后,得到

13、與預期相符的120bp片斷(圖2a).2.2融臺蛋白的表達,鑒定及工程菌的發(fā)酵培養(yǎng)經(jīng)SDSPAGE鑒定,硫氧還蛋白和PTH134融合的蛋白(ThioredoxinPTH134)在大腸桿菌中得到了表達,見圖2b.經(jīng)掃描確認表達量為27%.使用羊抗人28中國生物工程雜志ChinaBiotechnologyVo1.26No,32006EKase協(xié)割位瓤EKns識刪位點JrBamHlAspAst)Aspasp1.ys.%rValSertGGATCC(;ATGAC(,ATGACAA(A(:(TI'CTCCTAGGCTACTCeTACTCTT(:TIGCACAGAGlulleGlnLuMetHis

14、AsnLeu(;lyLys3IGAAA1'r(:A(F(;ATGCATAAT(:H(;GTAAACTIIAM;TC(AcrAC(;TATrAGAC(:CAnTHisIuAHrrMCh王AVnH:ItLT【】6ICAT(TGAAC:TAlrI(;AACGTGTI;(認AT(;GGTAI;ACTI'CA(認TAC("兀CA(:AC(:TFA(:(:LeuArgLysLys1.euGlnAspValHisAsn9l1Tr;CGTAAAAAACT(AGGAT(71,GCATAA_rAA(;(:ATIIrrrIA(:GT(TACA(:GTAITAP如?I)【2I11TTAGGA

15、AT/AAAATC(:1TFAA(:圖1優(yōu)化設計的hPTH1-34序列Fig.1ThesyntheticsequenceofhPTH1-34eDNAFrill一34抗體進行Westernblot鑒定,表明表達獲得了hPTH融合蛋白(圖2c).p2000100075050025000圖2rhPTH1-34融合蛋白的表達(a)重組表達載體限制性內(nèi)切酶分析;1:Dl2000Marker2:pThioHis-PTH1-34質(zhì)粒BamHI和EcoRl雙酶切;(b)融合蛋白在大腸桿菌中的表達;1:Marker;2:pThioHis質(zhì)粒,未誘導;3:pThioHis質(zhì)粒,誘導;4:pThioHis-PTH1

16、-34質(zhì)粒,未誘導;5:pThioHis-PTH134質(zhì)粒,誘導;(c)表達的融合蛋白Westernblot結(jié)果;1:表達的Thioredoxin-PTH1-34融合蛋白;2:表達的硫氧還蛋白Fig.2rhPTHlexpressionoffusionprotein(a)RestrictionanalysisofrecombinantexpressionvectorpThioHisPTH1-34;(b)SDSPAGEanalysisofrhPTHI-34fusionexpressioninEcoli;(c)Westernblotresultoffusionproteinbyexpression采

17、用優(yōu)化的條件發(fā)酵后,經(jīng)SDSPAGE鑒定,在誘導5h和6h時,融合蛋白在大腸桿菌中表達量達到了38%(圖3).2.3蛋白純化菌體超聲破菌后,融合蛋白主要在上清液中.將97.466.045.03l(J2I.54.5圖3不同誘導時間融合蛋白的發(fā)酵結(jié)果1:誘導lh;2:誘導2h;3:誘導3h;4:誘導4h;5:誘導5h;6:誘導6h;Fig.3FermentationofrecombinantE.coilexpressingThioredoxin-PTH1-34fusionprotein上清液經(jīng)Ni金屬親合層析純化后,融合蛋白的純度達到了85%以上(圖4a).純化的融合蛋白經(jīng)酶切后,經(jīng)反相柱層析(圖

18、4b)和凝膠層析(圖4c)分別純化后,經(jīng)小肽電泳鑒定,得到了單一的蛋白條帶.kMI2kMI2k97.466.O45.03I.021.5I4.5(b)26.617.014.26.503.()圖4rhffrH1-34融合蛋白的純化(a)Ni"金屬親合層析純化后融合蛋白的SDS-PAGE1:菌體裂解液上清;2:Ni金屬親合層析純化的融合蛋白;(b)反相層析純化hPTttl-34后的小肽電泳圖;M:Marker;1:EKase酶切后融合蛋白;2:反相柱純化的hPTHI-34;(c)凝膠過濾純化hPTHI一34后的小肽電泳圖;1:小肽分子量標準;2:凝膠過濾純化的PTH134Fig.4Puri

19、factionofrlll阿HI(a)SDS-PAGEanalysisoffusionproteinpurifiedbyNi"Chelatingchromatography;(b)PeptideelectmphoresisanalysisofhPTH1-34purifiedbyreverseehmmatographY;(e)PeptideelectrophoresisanalysisofhPTH1-34purifiedbygelfilterchromatography2.4hPTH1-34理化性質(zhì)鑒定純化后的hVrH1-34用HPLC進行純度檢定,結(jié)果顯示純度達到97.8%(圖5).

20、hFrH1-34氨基酸序列測一I2006,26(3)李健峰等:重組人甲狀旁腺激素肽(134)在大腸桿菌中的高效融合表達及純化29定結(jié)果表明,重組多肽N端15個氨基酸殘基為:S-L-S-E-IQLMHNLGKHL,與預期結(jié)果一致,說明腸激酶在切割位點進行了精確切割.質(zhì)譜測定結(jié)果顯示,hPTH1,34的分子量為4131,與預期一致.圖5hlrFH1-34HPLC純度檢測結(jié)果Fig.5HPLCpurifyassayresultofhPTHI-342.5hPTH1-34生物學活性測定根據(jù)PTH與骨肉瘤細胞上的受體結(jié)合后,能激活胞內(nèi)腺苷酸環(huán)化酶,導致cAMP濃度升高的特性,進行hPTH1.34的活性測定

21、.測定結(jié)果顯示hPTH1-34能刺激胞內(nèi)cAMP的增加,活性與陽性對照相當(表1).表1hPTH1-34刺激腺苷酸環(huán)化酶實驗TablelAdenylatecyclase8SSayofhPTH1-34實驗組cAMP含量(pmol/1.trg蛋白)空白對照組陽性對照lO組樣品1O組樣品lO組樣品lO組1.2l±O.12lO.33±0.44"19.46±0.62a)l0.67±0.276.02±0.31"Ja)P<0.05(相對于對照組),樣品1O劑量組與陽性對照lO組問無統(tǒng)計學顯著差異3討論自從PTH1.34被發(fā)現(xiàn)

22、作為一種較強的骨形成刺激劑以來,國內(nèi)外對其有效表達展開了廣泛的研究.在全長PTH的表達研究中發(fā)現(xiàn),由于PTH結(jié)構松散,易降解等原因,表達所得到的產(chǎn)物量極低且均一性差.目前已知,有多種因素影響外源基因在大腸桿菌中的表達,基因水平上有密碼子的偏愛性,基因的二級結(jié)構,啟動子的效率,啟動子和ATG之間的距離等,其中,密碼子的偏愛性和基因的二級結(jié)構等因素在實現(xiàn)外源基因高效表達的過程中尤為重要-6J.此外,PTH1-34的結(jié)構和功能的關系研究發(fā)現(xiàn),在PTH的氨基端引入額外的氨基酸,會使其生物學活性顯著降低【.而在大腸桿菌中表達外源基因時,在表達的產(chǎn)物N端經(jīng)常形成甲硫氨酸或甲基甲硫氨酸,因此,在大腸桿菌中的

23、常規(guī)表達將影響PTH1-34的活性.綜合PTH1-34分子量小,不易純化等問題,將PTH1_34與其他大分子蛋白的融合表達將是解決這類問題的有效方法.從采用大腸桿菌偏好的密碼子和二級結(jié)構優(yōu)化角度設計了PTH104基因序列,將PTH1-34蛋白分子與具有親和純化特性的硫氧還蛋白進行融合表達,結(jié)果使ThioredoxinPTH1-34融合蛋白在E.coli中高效和呈可溶性表達.因此,融合蛋白表達技術能有效避免目的產(chǎn)物包涵體的形成,省略了包涵體提取和復性的復雜過程,對下游純化步驟的簡化提供了很好的基礎.在基因工程產(chǎn)品的開發(fā)中,建立一個能獲得高純度,高活性和易規(guī)?；募兓に噷Ξa(chǎn)品的最終質(zhì)量控制尤為重

24、要.在以往的小分子多肽的純化方法中,往往采用高壓液相色譜柱進行純化,用這種方法純化的多肽純度高,但不利于規(guī)?；a(chǎn).我們采用了易于規(guī)模化放大的反相柱純化得到了較高純度的hPTH134.此外,在最后純化階段使用的Superdex.30凝膠層析不僅可進一步對hPTHI-34進行純化,而且能有效的實現(xiàn)熱源控制.通過這些純化步驟得到重組hPTHI-34純度在95%以上,并且體外腺苷酸環(huán)化酶刺激結(jié)果表明獲得的高純度重組產(chǎn)物具有較好的活性,此純化工藝的建立為大規(guī)模制備hPTH1-34打下了良好的基礎.參考文獻1HendyGN,KronenbergHM,PottsJT,ata1.Nucleotidesequ

25、enceofclonedcDNAsencodinghumanpreproparathyroidhormoneProcNatlAcadSciUSA,1981,78(12):73653842TregearGW,VanRietschotenJ,GreeneE,ata1.Bovinparathyroidhormone:minimumchainlengthofsyntheticpeptiderequireforbiologicalactivity.Endocrinology,1973,93:134913533WhitfieldJF,MorleyP.Smallbonebuildingfragmentsof

26、f,rH:newtherapeuticagentforosteoporosis.TrendsPharmacolSci,1995,16(1):3823864SchggerH,VonJagowG.Tricine-sodiumdodecylsulfatepolyacrylamidegelelectrophoresisfortheseparationofproteinsintherangefrom1to100kDa.AnalBiochem,1987,166(2):36837930中國生物工程雜志ChinaBiotechnologyVo1.26No.320065SuzukiY,YabutaM.Ohsuy

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