細(xì)胞劃痕試驗

1、直尺20微升槍頭（滅菌）無血清培養(yǎng)基PBS準(zhǔn)備：所有能滅菌的器械都要滅菌，直尺和marker筆在操作前紫外照射 30min （超凈臺內(nèi)）流程：1。 先用marker筆在6孔板背后，用直尺比著，均勻得劃橫線，大約每隔0.51cm 道， 橫穿過孔。每孔至少穿過 5條線。2。在空中加入約5X105個細(xì)胞，具體數(shù)量因細(xì)胞不同而不同，掌握為過夜能鋪滿。3。第二天用槍頭比著直尺，盡量垂至于背后的橫線劃痕，槍頭要垂直，不能傾斜。4。用PBS洗細(xì)胞3次，去處劃下的細(xì)胞，加入無血清培養(yǎng)基。5。放入37度5%co2培養(yǎng)箱，培養(yǎng)。按 0, 6，12，24小時取樣，拍照。NOTE6空板可以保證有相當(dāng)距離的平直劃痕，我

2、覺得挺不錯的。而且因為有5條定位線，與劃痕相交，這樣就有10個可固定監(jiān)測點，不作重復(fù)，誤差也很小。如果你連續(xù)監(jiān)測24小時，你需要考慮到劃痕縮小是細(xì)胞遷移和細(xì)胞繁殖共同作用的結(jié)果，而不是單純的細(xì)胞遷移。如果你要單純的考慮細(xì)胞遷移，你可以先用絲裂霉素（1ug/ml）處理一小時，抑制細(xì)胞的分裂，這樣你的結(jié)果就是細(xì)胞遷移的作用了。照片拍完之后，可以用image J來測量劃痕區(qū)域的像素定量比較細(xì)胞遷移的速度。無血清的話，應(yīng)該一個細(xì)胞周期內(nèi)，增殖可以忽略吧。而且我定點監(jiān)測的話，差不多可以對應(yīng)到每個細(xì)胞。好像沒有看見很明顯的增殖現(xiàn)象。絲裂霉素貌似很貴的說。如果用這個還不如直接用transwell呢。另，im

3、age J哪里有下載么？謝謝。ImageJ 下載網(wǎng)址：無血清培養(yǎng)，確實細(xì)胞增殖可以忽略了，不過由于細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)系統(tǒng)整體性的下調(diào)節(jié)，細(xì)胞遷移的速度也會慢很多。不知道是不是大多數(shù)文獻(xiàn)都用無血清培養(yǎng)狀態(tài)下作劃痕實驗?zāi)兀?目前最好的方法還是 tran swell 法一般做劃痕實驗，都是無血清或者低血清 2%）否則細(xì)胞增殖就不能忽略。一般認(rèn)為細(xì)胞 周期是24小時，但對于一些特殊的細(xì)胞系來說，生長可能會快一點。因此好像還沒看見用 帶血清培養(yǎng)，短時間檢測的。不過我會去試試看?？赡苁莻€好方法。劃痕法的意義在于，價格低廉，操作簡單。還有很重要的一點在于細(xì)胞外圍環(huán)境簡單單純，容易控制。（比如做加藥的，可能會和血

4、清的組分有反映，而且受血清批次的影響，造成誤差。如果是鋪了 ECM物質(zhì)的，組分就更復(fù)雜了。）劃痕法的不足也很明顯，適用的細(xì)胞系很窄，一般只能用于上皮，纖維樣細(xì)胞系。因為1。這些細(xì)胞本身有遷移能力，且較強。2。細(xì)胞有極性，方便測量，觀察。3。 細(xì)胞對無血清有較強的忍受力（至少24小時），因此很多腫瘤細(xì)胞系是不適合做劃痕的，很多腫瘤細(xì)胞系在無血清培養(yǎng)下，12小時細(xì)胞凋亡就超過 50%。這也就是transwell發(fā)展的最大要求。而一些上皮樣細(xì)胞系甚至可以忍受高達(dá)72小時的無血清實驗。足以彌合劃痕。wuushark wrote:現(xiàn)在好多SCI雜志都不認(rèn)這個實驗了，要求做 transwell 了。這個方

5、法無法進(jìn)行精確定量，前期做起來容易，后期數(shù)據(jù)處理比較麻煩，還得附圖，SCI雜志照片之昂貴，遠(yuǎn)超過了transwell的價格。Photoshop 6.0以前的版本有個直方圖的功能可以直接反映選擇區(qū)域的象素多少，用來做面 積分析應(yīng)當(dāng)很好用，用于做劃痕修復(fù)的實驗應(yīng)當(dāng)也很好用，當(dāng)然，有更專業(yè)的Image Pro Plus的話PS就沒必要了。tacthgin wrote:本人正打算投稿呢，其中就包括劃痕實驗，能否請wuushark指點一下哪些SCI雜志不認(rèn)這 個實驗?zāi)兀课覀€人認(rèn)為 選擇scratch assay 或者是transwell assay是根據(jù)所研究的細(xì)胞系的特點 來決定的。上皮細(xì)胞，癌細(xì)胞，

6、角質(zhì)細(xì)胞，在生理狀態(tài)下，形成單層或者復(fù)層上皮，當(dāng)病理狀態(tài)下，比如創(chuàng)傷愈合，細(xì)胞遷移的時候，以側(cè)向運動為主，scratch assay很好的模擬了這種運動形式，是很好的模型。n eutrophil, mono cyte/macrophage, mese nchymal stem cell,這類纟田胞在生理狀態(tài)下并不形成mo no layer,病理狀態(tài)下的細(xì)胞遷移是在細(xì)胞因子或趨化因子的影響下在基質(zhì)中縱向運動，transwell assay 模擬了這種運動形式，是適合的模型。非常同意，tacthgin戰(zhàn)友的思想。其實在傷口彌合中，fibroblast的向創(chuàng)口處遷移就是典型的側(cè)向爬行。但是其實癌細(xì)胞

7、的遷移倒不是側(cè)向爬行那么簡單，我覺得應(yīng)該是綜合效應(yīng)，而且要看是什么類型的腫瘤。因為對于遠(yuǎn)端病灶的轉(zhuǎn)移，顯然是通過血液運輸?shù)摹＿@是一個細(xì)胞去黏附和再黏附的過程。其實tran swell也不能很好的模仿這個過程。只是tran swellmatrigel可以模仿腫瘤細(xì)胞融解基質(zhì)，侵入到正常組織的這個過程。也就是侵襲。所以對于做cancer的來說，可能transwell會更好些。但我覺得并不能就簡單否定scar assay。細(xì)胞的遷移作為細(xì)胞的一個正常生理活動，是表征細(xì)胞生理變化的一個重要指標(biāo)。這點是很主要的意義。(3) .腫瘤細(xì)胞遷移實驗常用8.0、12.0 5膜，上室種腫瘤細(xì)胞，下室加入FBS或某

8、些特定的趨化因子，腫瘤細(xì)胞會向營養(yǎng)成分高的下室跑，計數(shù)進(jìn)入下室的細(xì)胞量可反映腫瘤細(xì)胞的遷移能力。(4) .腫瘤細(xì)胞侵襲實驗常用8.0、12.0卩m膜，原理與腫瘤細(xì)胞遷移實驗類似。上室種腫瘤細(xì)胞， 下室加入FBS或某些特定的趨化因子，腫瘤細(xì)胞會向營養(yǎng)成分高的下室跑，但與腫瘤細(xì)胞遷移實驗不同的是，聚碳酸酯膜上室側(cè)鋪上一層基質(zhì)膠，用以模仿體內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)，細(xì)胞欲進(jìn)入下室，先要分泌基質(zhì)金屬蛋白酶(mmps將基質(zhì)膠降解，方可通過聚碳酸酯膜。計數(shù)進(jìn)入下室的細(xì)胞量可反映腫瘤細(xì)胞的侵襲能力。.步驟2 . 1 Transwell 小室制備2. 1. 1無基質(zhì)膠 Transwell 小室制備 包被基底膜：用50mg

9、/LMatrigel 1:8 稀釋液包被Tran swell小室底部膜的上室面，4 C風(fēng)干。如果需要 在下室面鋪FN的話，可將200ul槍頭的尖端剪掉，吸取FN均勻涂抹在小室的下面。用膠原(collagen )的話，一般配成 0.5mg/ml，直接用槍吸了涂在膜上。 水化基底膜：吸岀培養(yǎng)板中殘余液體，每孔加入50ul含10g/LBSA的無血清培養(yǎng)液，37C, 30min。另有tianjin_glioma戰(zhàn)友提供的方法：在上室的聚碳酸酯膜上加入稀釋后的Matrigel (3.9ug/ul) 60-80卩l(xiāng) (注意體積不可太大，以剛把聚碳酸酯膜浸濕為最好)，置37C 30min使Matrigel聚

10、合成凝膠。2 . 1. 2有基質(zhì)膠的Transwell小室制備Chemicon公司的ECM550系列說明書要求，將小室放入培養(yǎng)板中，在上室加入300 1預(yù)溫的無血清培養(yǎng)基，室溫下靜置15-30min，使基質(zhì)膠再水化。再吸去剩余培養(yǎng)液。2 . 2制備細(xì)胞懸液 制備細(xì)胞懸液前可先讓細(xì)胞撤血清饑餓12 - 24h，進(jìn)一步去除血清的影響。但這一步并不是必須的。 消化細(xì)胞，終止消化后離心棄去培養(yǎng)液，用PBS洗1-2遍，用含BSA的無血清培養(yǎng)基重懸。調(diào)整細(xì)胞密度至1- 10X 105,個人認(rèn)為不要超過5X 105。具體實驗時采用密度要自己摸索，因為不同細(xì)胞，其侵襲能力是不同的。個人經(jīng)驗，細(xì)胞 量過多，穿過

11、膜的細(xì)胞會過多過快，如果最后用計數(shù)法統(tǒng)計結(jié)果的話將難以計數(shù)；而過少 的話，可能還沒到檢測的時間點，所有的細(xì)胞都已穿過，因此最少也要保證在收樣的時候， 上室內(nèi)還要有一定量的細(xì)胞存在。個人認(rèn)為，對照組和處理盡量不要分開計數(shù)，因為細(xì)胞數(shù)目的差異會嚴(yán)重影響實驗結(jié)果。 如果需要對細(xì)胞預(yù)處理而不得不分開計數(shù)，那么計數(shù)一定要多重復(fù)幾次，力求準(zhǔn)確，盡量 保證對照組和處理組細(xì)胞密度一致。2 . 3接種細(xì)胞 取細(xì)胞懸液 100 200卩1加入Tran swell小室，不同公司的、不同大小的Tran swell小室對細(xì)胞懸液量有不同要求，請參考說明書。24孔板小室一般200卩l(xiāng)。 24孔板下室一般加入 5001含F(xiàn)

12、BS或趨化因子的培養(yǎng)基，不同的培養(yǎng)板加的量有不同要求，具體請參考說明書。這里要特別注意的是，下層培養(yǎng)液和小室間常會有氣泡產(chǎn)生，一 旦產(chǎn)生氣泡，下層培養(yǎng)液的趨化作用就減弱甚至消失了，在種板的時候要特別留心，一旦 出現(xiàn)氣泡，要將小室提起，去除氣泡，再將小室放進(jìn)培養(yǎng)板。 培養(yǎng)細(xì)胞：常規(guī)培養(yǎng)12-48h (主要依癌細(xì)胞侵襲能力而定)。時間點的選擇除了要考慮到細(xì)胞細(xì)胞侵襲力外，處理因素對細(xì)胞數(shù)目的影響也不可忽視。以我的課題為例，我使用的藥物不僅會抑制腫瘤細(xì)胞侵襲力，還對細(xì)胞增殖有明顯抑制。我選擇的藥物濃度是用MTT篩選岀的72h的IC50。用這個濃度處理細(xì)胞，24h內(nèi)對細(xì)胞增殖并無明顯抑制，但24h后，

13、抑制作用就開始岀現(xiàn)了。所以，用這個濃度來做Transwell ，處理時間也必須限定在24h內(nèi)，否則一旦藥物抑制了細(xì)胞增殖或者誘導(dǎo)岀凋亡，使處理組細(xì)胞數(shù)目少于對照組，那么就難以肯定穿過膜的細(xì)胞比對照組少，究竟是由于侵襲被抑制引起，還是處理后細(xì)胞數(shù)目本身就比對照組少而引起的了。時間過長不可以，同樣，過短也不行，因為細(xì)胞內(nèi)會有一定量的MMPs儲存，短時間內(nèi)可能侵襲能力不會有太大改變。同時從藥物被吸收進(jìn)去，進(jìn)而發(fā)揮作用，影響MMPs表達(dá)，到最后釋放到培養(yǎng)基中，還需要一個過程。時間點的選擇可盡量長點，也可選擇多個時間點研究時間依賴效應(yīng)，但前提是這個時間范圍內(nèi)細(xì)胞數(shù)目不能有明顯變化。另外，我看到細(xì)胞在小室

14、內(nèi)的形態(tài)不是正常培養(yǎng)貼壁的形態(tài)，而是圓形的，仍是懸浮時的形態(tài)，不過會聚集成團(tuán)，所以看到細(xì)胞不正常貼壁也不要緊張，是正?，F(xiàn)象在培養(yǎng)過程中，膜下會逐漸有少量小氣泡產(chǎn)生，這是正?，F(xiàn)象，可不予處理，但我遇到過培養(yǎng)一段時間后，膜下岀現(xiàn)了大氣泡，幸虧及時發(fā)現(xiàn)，否則后果將非常嚴(yán)重。因此，個人建議，最好接種細(xì)胞后 1- 2h把培養(yǎng)板從培養(yǎng)箱里拿岀來看看，確信沒有大氣泡產(chǎn)生。2 . 4結(jié)果統(tǒng)計檢測穿過的細(xì)胞數(shù)有兩種方法：2. 4. 1直接計數(shù)法2 . 4. 1.1 "貼壁”細(xì)胞計數(shù)這里所謂的“貼壁”是指細(xì)胞穿過膜后，可以附著在膜的下室側(cè)而不會掉到下室里面去。通過給細(xì)胞染色，可在鏡下計數(shù)細(xì)胞 用棉簽擦去

15、基質(zhì)膠和上室內(nèi)的細(xì)胞 染色：常用的染色方法有結(jié)晶紫染色、臺肦藍(lán)染色、Giemsa染色、蘇木精染色、伊紅染色等。個人推薦采用0.1%結(jié)晶紫染色，這種方法有如下優(yōu)勢：(1).不需要固定細(xì)胞，直接染色即可。(2).配制簡單方便。(3).染色后可以用33%醋酸脫色，將結(jié)晶紫完全洗脫下來，洗脫液可在酶 標(biāo)儀上570nm測其OD值，間接反映細(xì)胞數(shù)。個人認(rèn)為這是結(jié)晶紫染色最大的優(yōu)勢所在。因為， 雖然經(jīng)過準(zhǔn)確的細(xì)胞計數(shù)，往往穿過膜的細(xì)胞數(shù)仍難以準(zhǔn)確控制，可能某一批實驗穿過的細(xì)胞會特別多，以致細(xì)胞成堆， 這種情況下就難以計數(shù)了，這種情況下就可以用醋酸脫色后用酶標(biāo)儀檢測。使用結(jié)晶紫染色要注意，染色前要將膜風(fēng)干，否則可能會染不上。 細(xì)胞計數(shù)：我們使用的是Leica DC 300F正置顯微鏡進(jìn)行觀察和拍照，把Tra nswell小室反過來底朝上就可清楚看到小室底膜上下室側(cè)附著的細(xì)胞。也有不少人用手術(shù)刀將膜切下后染色，再貼在玻片上，滴二甲苯，再蓋上蓋玻片，就可以長期保存，但