大鼠實(shí)驗(yàn)性胃潰瘍自愈期間胰島A細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能變化

1、    大鼠實(shí)驗(yàn)性胃潰瘍自愈期間胰島A細(xì)胞的 結(jié)構(gòu)和功能變化        【摘要】目的探討胰島A細(xì)胞參與潰瘍自愈調(diào)節(jié)的可能途徑。方法應(yīng)用形態(tài)計(jì)量、放射免疫測(cè)定及透射電鏡方法，研究大鼠實(shí)驗(yàn)性胃潰瘍自愈期間胰島A細(xì)胞的面數(shù)密度、超微結(jié)構(gòu)及血清胰高血糖素的變化。結(jié)果與正常組及鹽水組比較，A細(xì)胞面數(shù)密度于潰瘍后6d、10d明顯增加(P0.01)。潰瘍后14d開始呈減小趨勢(shì)，28d基本恢復(fù)正常。A細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化在潰瘍后第614d較明顯，主要表現(xiàn)為：(1)細(xì)胞核增大，異染色

2、質(zhì)減少，核周隙擴(kuò)張；(2)部分A細(xì)胞粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)增多，有的呈板層狀排列，有的擴(kuò)張成囊泡；(3)部分A細(xì)胞內(nèi)分泌顆粒增多，大小不等，密度不一。血漿胰高血糖素水平從潰瘍后14d到21d呈增高趨勢(shì)(P0.01)，28d時(shí)接近正常。結(jié)論胰島A細(xì)胞的形態(tài)和功能變化表明，它通過(guò)增加其細(xì)胞數(shù)目及增強(qiáng)其合成與分泌胰高血糖素的功能，積極參與了胃潰瘍自愈的調(diào)節(jié)過(guò)程?！娟P(guān)鍵詞】胰島A細(xì)胞形態(tài)計(jì)量學(xué)超微結(jié)構(gòu)胰高血糖素實(shí)驗(yàn)性胃潰瘍大鼠 THE CHANGES OF STRUCTURE AND FUNCTION OF ISLET A CELLS DURING THE HEALING PROCESS OF GASTRIC U

3、LCER IN RATSHuang Yan Liang Wenmei* Shi Airong*(Department of Histology and Embryology,Weifang Medical College,Weifang ;*Guiyang Medical College,Guiyang; *Beijing Medical University,Beijing 100083)【Abstract】Objective To explore the possible way by which the islet A cells take part in the regulation

4、of the healing process of gastric ulcer in rats. Methods Using morphometry,electron microscopy and radioimmunoassay to study the changes the numerical density on area(NA) and ultrastructure of islet A cells and the level of glucagon during the healing process of gastric ulcer in rats. Results As com

5、pared with normal control group(NCG) and saline control group(SCG),the NA of A cells markedly increased(P0.01) during 6-10 days in experimental gastric ulcer group(EUG),then declined on the 14th day and recovered on the 28th day;the obvious ultrastructure changes occurred in A cells during 6-14 days

6、 after inducing gastric ulcer .The changes include that the nucleus was larger and rounder with the more euchromatin and dilated perinuclear space, the rough endoplasmic reticulum increased in the number or dilated into vacuole in some A cells; the number of secrete granules increased with different

7、 size and density.The level of plasma glucagon elevated remarkedbly(P0.01)during 14-21 days,and recovered on the 28th day. Conclusion The above mentioned findings proved that the islet A cells were involved in the regulation of ulcer healing process by increasing their number and enhancing their fun

8、ctions of synthesizing and secreting glucagon.【Key words】 Islet A cell; Morphometry; Ultrastructure; Glucagon; Experimental gastric ulcer; Rat胰高血糖素能預(yù)防阿司匹林等引起的胃粘膜損傷早已有實(shí)驗(yàn)證明1。在大鼠實(shí)驗(yàn)性胃潰瘍自愈過(guò)程中，胰島A細(xì)胞多種酶活性增強(qiáng)，說(shuō)明A細(xì)胞代謝活躍，可能與潰瘍的修復(fù)愈合有關(guān)2。本實(shí)驗(yàn)在已有工作的基礎(chǔ)上，對(duì)大鼠實(shí)驗(yàn)性胃潰瘍自愈期間胰島A細(xì)胞進(jìn)行了形態(tài)計(jì)量、超微結(jié)構(gòu)觀察及胰高血糖素放射免疫測(cè)定，以期將形態(tài)與功能結(jié)合，進(jìn)一步探討胰島

9、A細(xì)胞參與潰瘍自愈調(diào)節(jié)的可能途徑。材料和方法成年雄性Wistar大鼠120只，體重180210g，隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)性胃潰瘍組(潰瘍組，60只)、鹽水對(duì)照組(鹽水組，48只)和正常對(duì)照組(正常組，12只)。大鼠實(shí)驗(yàn)性胃潰瘍模型按本室已建立的方法3制作。鹽水組為模擬手術(shù)，注射等量生理鹽水代替冰醋酸。正常組不作任何處理。分別進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)：1. 胰島A細(xì)胞的形態(tài)計(jì)量免疫組織化學(xué)PAP法：分別于胃潰瘍模型術(shù)后第6、10、14、21和28d取大鼠胰尾，Bouin液固定，常規(guī)石蠟包埋，制成6m厚的連續(xù)切片，將同一時(shí)間點(diǎn)潰瘍組、鹽水組及正常組各6只大鼠胰尾相同序號(hào)的切片裱于同一張載片上。從潰瘍組及鹽水組各時(shí)間點(diǎn)和

10、正常組胰腺切片中每例取片，隔20片取1片，按Sternberger PAP法進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。主要步驟為：切片常規(guī)脫蠟到水，甲醇-H2O2封閉，依次滴加兔抗胰高血糖素抗血清(12000 Watpa公司，新西蘭)，羊抗兔IgG(150)及PAP(1100)，DAB-H2O2液顯色，Mayer蘇木精復(fù)染。PBS代替胰高血糖素抗血清作為方法對(duì)照。細(xì)胞計(jì)數(shù)方法：按體視學(xué)要求取樣，從每個(gè)動(dòng)物的胰腺切片中選直徑100m以上的胰島9個(gè)，每張切片取3個(gè)在×400的放大倍數(shù)下用點(diǎn)測(cè)量法計(jì)數(shù)目鏡測(cè)試方格內(nèi)胰島落點(diǎn)數(shù)(PI)及所測(cè)胰島內(nèi)胰高血糖素免疫染色細(xì)胞(A細(xì)胞)數(shù)(NX)。用下列公式計(jì)算A細(xì)胞面

11、數(shù)密度(NA)，所得數(shù)據(jù)經(jīng)t檢驗(yàn)處理。    a，為一個(gè)測(cè)試點(diǎn)所代表的測(cè)試格面積。2. A細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)觀察從潰瘍組和鹽水組術(shù)后第6、10、14、21和28d各時(shí)間點(diǎn)和正常組分別取3個(gè)大鼠的胰腺，按常規(guī)制備電鏡標(biāo)本和觀察。3. 胰高血糖素放射免疫測(cè)定潰瘍組和鹽水組術(shù)后第4、6、10、14、21和28d大鼠(潰瘍組10只/時(shí)間點(diǎn)，鹽水組8只/時(shí)間點(diǎn))和正常組大鼠(12只)禁食24h后，用3%戊巴比妥鈉經(jīng)腹腔注射麻醉并經(jīng)心臟取血。用北京海科銳生物技術(shù)中心研制的胰高血糖素放射免疫測(cè)定盒并按其說(shuō)明書對(duì)血漿胰高血糖素進(jìn)行放射免疫測(cè)定。取血2ml，加入盛有100l抑肽

12、酶1 000kIU和的試管內(nèi)，輕輕搖勻，離心分離血漿。然后依次向放射免疫測(cè)定管中加入血漿100l，抑肽酶50l，胰高血糖素抗血清100l,125I-胰高血糖素100l，震蕩混勻，4保溫24h。之后加入免疫沉淀劑500l，震蕩混勻靜置15min，2 000g離心15min，棄上清，用1470WIZARDTM自動(dòng)計(jì)數(shù)儀得出樣品的胰高血糖素濃度ng/L，所得數(shù)據(jù)用t檢驗(yàn)處理。結(jié)果1. A細(xì)胞的形態(tài)及形態(tài)計(jì)量A細(xì)胞位于胰島周邊，胞質(zhì)呈棕黃色，形狀不規(guī)則，呈三角形、多邊形及梭形并常有突起(1)。外分泌部亦有分布于腺泡上皮和導(dǎo)管上皮細(xì)胞之間的免疫染色細(xì)胞，但數(shù)目較少。在潰瘍自愈期間，胰島A細(xì)胞自潰瘍后6d

13、始明顯增加，持續(xù)至潰瘍后21d(2，3)。潰瘍后10d及14d，外分泌部可見散在于腺泡之間及導(dǎo)管周圍的胰高血糖素免疫染色細(xì)胞團(tuán)，尤以潰瘍后14d最明顯(4)。其他時(shí)間點(diǎn)及正常組則未發(fā)現(xiàn)。方法對(duì)照片均為陰性反應(yīng)。在潰瘍自愈過(guò)程中，A細(xì)胞NA變化見5。潰瘍后6d和10d A細(xì)胞NA明顯增高，與正常組及鹽水組比較有顯著性差異(P0.01)，潰瘍后14d呈減小趨勢(shì)，28d時(shí)基本恢復(fù)正常。    5A細(xì)胞面數(shù)密度的變化與正常組比較，?P，?P0.01Fig.5 The Changes of numerical density on area of islet A

14、cells. *P0.05, *P0.01,as compared with NCG     2. A細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)變化潰瘍組在潰瘍第6d，部分A細(xì)胞胞核增大，異染色質(zhì)減少，核仁明顯、邊集，核周隙擴(kuò)張。胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)較多的圓形及不規(guī)則形囊泡，囊泡有明顯的膜，膜的表面有核糖體附著，囊泡內(nèi)可見致密物。分泌顆粒較少，線粒體輕微腫脹，高爾基復(fù)合體未見明顯變化(6、7)。部分A細(xì)胞上述變化程度較輕，但核周隙擴(kuò)張較明顯，細(xì)胞基質(zhì)密度較高(8)，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體增多并呈區(qū)域性分布，高爾基復(fù)合體較發(fā)達(dá)，分泌顆粒較多，部分分泌顆粒的致密芯電子密度較低。潰湯第10d，A細(xì)胞的

15、超微結(jié)構(gòu)變化與第6d相似，但未見明顯的核周隙擴(kuò)張及囊泡(6)。潰瘍第14d，A細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)變化多樣，有的A細(xì)胞分泌顆粒明顯增多，細(xì)胞器未見明顯變化；有的A細(xì)胞高爾基復(fù)合體發(fā)達(dá)，由多層扁平囊及大小泡組成，豐富的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)在胞核的一側(cè)呈板層狀排列，分泌顆粒大小不等(9)；還有的A細(xì)胞核質(zhì)比增大，染色質(zhì)呈細(xì)粒狀散在于胞核內(nèi)，分泌顆粒較少，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)較豐富(9)。潰瘍第28d，A細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)基本恢復(fù)正常。3. 胰高血糖素放射免疫測(cè)定如10所示，潰瘍組胰高血糖素水平從潰瘍后6d到21d呈增高趨勢(shì)，各時(shí)間點(diǎn)與正常組及鹽水組比較均有極顯著性差異(P0.01)，28d時(shí)接近正常。   

16、   10血漿胰高血糖素濃度的變化*與正常組比較，P0.01Fig.10 The Changes of concentration of plasma glucagon.*P，as compared with NCG討論在實(shí)驗(yàn)性胃潰瘍自愈期間胰島A細(xì)胞多種酶活性增強(qiáng)2，提示A細(xì)胞參與了潰瘍自愈調(diào)節(jié)。本實(shí)驗(yàn)用免疫組織化學(xué)、形態(tài)計(jì)量及胰高血糖素放射免疫測(cè)定方法可更直接地反映A細(xì)胞在潰瘍自愈過(guò)程中的動(dòng)態(tài)變化，從而深入探討A細(xì)胞參與潰瘍自愈調(diào)節(jié)的途徑。形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，在潰瘍自愈期間最明顯的改變是胰島A細(xì)胞增加，潰瘍后14d，外分泌部出現(xiàn)散在的胰高血糖素免疫染色細(xì)胞團(tuán)。形態(tài)計(jì)量結(jié)果表

17、明，A細(xì)胞面數(shù)密度高峰是在潰瘍后10d，之后趨于降低，放射免疫測(cè)定結(jié)果表明，潰瘍組血漿胰高血糖素高峰出現(xiàn)在潰瘍后21d。綜合上述結(jié)果分析，在潰瘍愈合初期(610d)，胰島A細(xì)胞面數(shù)密度及血漿胰高血糖素濃度的增高可能主要是部分處于功能靜止?fàn)顟B(tài)的A細(xì)胞轉(zhuǎn)入功能活躍狀態(tài)，合成分泌胰高血糖素增多的結(jié)果。本研究電鏡下所觀察到的潰瘍后6d A細(xì)胞粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)增多，高爾基復(fù)合體較發(fā)達(dá)，分泌顆粒增多及核周隙明顯擴(kuò)張為上述結(jié)論提供了證據(jù)，光鏡下未發(fā)現(xiàn)胰島內(nèi)有分裂相的事實(shí)也為此提供了旁證。潰瘍愈合中期(潰瘍后1421d)，胰島A細(xì)胞面數(shù)密度逐漸減小，而外分泌部出現(xiàn)散在的胰高血糖素免疫染色細(xì)胞團(tuán)，從而使血漿胰高血糖素

18、直至潰瘍后21d始終維持在較高水平。因?yàn)檫@些散在的胰高血糖素免疫染色細(xì)胞團(tuán)多位于小導(dǎo)管附近，故推測(cè)潰瘍病灶可能通過(guò)腸胰島軸影響到導(dǎo)管上皮細(xì)胞向胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞的分化、增生，其機(jī)制尚待探討。根據(jù)正常A細(xì)胞細(xì)胞器及分泌顆粒的形態(tài)和數(shù)量推測(cè)，正常A細(xì)胞可以處于靜止和活動(dòng)兩種不同的功能狀態(tài)。潰瘍自愈過(guò)程中，尤其是潰瘍第614d，A細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)發(fā)生了較明顯的變化。主要有以下幾個(gè)方面：細(xì)胞核的變化：潰瘍第614d，有的A細(xì)胞胞核大而圓，異染色質(zhì)很少；潰瘍第6d時(shí)，部分A細(xì)胞還出現(xiàn)明顯的核仁邊集及核周隙擴(kuò)張。細(xì)胞核的形態(tài)反映了細(xì)胞的功能狀態(tài)，核內(nèi)常染色質(zhì)增多，說(shuō)明細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄功能相對(duì)活躍。核仁邊集、核周隙擴(kuò)張

19、都是蛋白質(zhì)合成功能旺盛的表現(xiàn)4，這可能有利于轉(zhuǎn)錄的RNA自胞核快速輸送至胞質(zhì)。粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的變化：潰瘍自愈過(guò)程中，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的變化最顯著，正常大鼠胰島A細(xì)胞內(nèi)粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或散在分布，或沿核膜及細(xì)胞質(zhì)膜平行排列。潰瘍第6d，部分A細(xì)胞粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)增多；第14d，A細(xì)胞內(nèi)粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)增多更明顯，并平行排列于細(xì)胞核的一側(cè)。同時(shí)，其附近有發(fā)達(dá)的高爾基復(fù)合體和較多的線粒體。已有研究證明，胰高血糖素在A細(xì)胞內(nèi)的合成途徑與胰島素在B細(xì)胞內(nèi)的合成途徑相似5。首先，前胰高血糖素原在核糖體上合成，進(jìn)入粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，然后經(jīng)過(guò)高爾基復(fù)合體加工，最終以具有生物活性的胰高血糖素出現(xiàn)于分泌顆粒內(nèi)6。上述超微結(jié)構(gòu)變化反映了A細(xì)胞在潰瘍

20、自愈過(guò)程中合成胰高血糖素的功能活躍。分泌顆粒的變化：潰瘍第614d，部分A細(xì)胞內(nèi)分泌顆粒增多，大小不等，密度不一。上述變化以第14d更為明顯。Orci等7對(duì)胰島素在B細(xì)胞內(nèi)合成過(guò)程的示蹤研究發(fā)現(xiàn)，分泌顆粒大小和密度與分泌顆粒的成熟程度有關(guān)。由此推測(cè)，上述變化可能是由于A細(xì)胞合成功能活躍，成熟程度不同的分泌顆粒均增多的結(jié)果。細(xì)胞內(nèi)空泡的形成：潰瘍第6d，一些A細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)許多圓形或不規(guī)則形空泡，這些細(xì)胞與其周圍不含空泡的細(xì)胞相鄰，說(shuō)明空泡的形成并非人工假象。在潰瘍自愈的同一時(shí)間點(diǎn)，蘇宇華等8于垂體的ACTH細(xì)胞、苑普慶等9于睪丸間質(zhì)細(xì)胞觀察到相同的變化，提示這是許多內(nèi)分泌細(xì)胞對(duì)潰瘍的一種反應(yīng)。

21、在空泡的表面有核糖體附著，說(shuō)明這些空泡是擴(kuò)張的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張反映細(xì)胞合成功能活躍。但我們?cè)谟^察中不但未發(fā)現(xiàn)此種細(xì)胞內(nèi)與分泌顆粒合成有關(guān)的其他細(xì)胞器增多，反而分泌顆粒較少。根據(jù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)快速增多時(shí)，所需的結(jié)構(gòu)蛋白是原位來(lái)自內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)4，在潰瘍第6d出現(xiàn)粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張的同時(shí)，伴有細(xì)胞核增大，核仁明顯、邊集等功能活躍的形態(tài)學(xué)特征，故推測(cè)這是結(jié)構(gòu)蛋白合成活躍的表現(xiàn)，可能與潰瘍第14d多數(shù)A細(xì)胞內(nèi)粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的明顯增多有關(guān)。胰高血糖素是血糖的重要調(diào)節(jié)者之一，它通過(guò)分解糖原和糖異生作用使血糖升高。已有研究表明，胰高血糖素還能擴(kuò)張腸系膜血管，增加粘膜及粘膜下層血流1，抑制胃酸分泌10，使胃未分化細(xì)胞和

22、粘液細(xì)胞內(nèi)葡萄糖-6-磷酸酶活性增強(qiáng)，表面上皮細(xì)胞粘液分泌增多11，對(duì)阿斯匹林引起的胃粘膜損傷具有保護(hù)作用1。Chiba等12已報(bào)道胰高血糖素促進(jìn)胃粘膜分泌生長(zhǎng)抑素，而且發(fā)現(xiàn)胃內(nèi)含有生長(zhǎng)抑素的細(xì)胞與壁細(xì)胞密切接觸13。結(jié)合前人及本研究工作可以推測(cè)，胰島A細(xì)胞在潰瘍自愈期間通過(guò)分泌高水平的胰高血糖素作用于胃粘膜，使局部血流增加，胃粘液分泌增加，同時(shí)通過(guò)促進(jìn)胃粘膜內(nèi)D細(xì)胞分泌生長(zhǎng)抑素抑制胃酸分泌，從而改善胃內(nèi)微環(huán)境，利于潰瘍愈合。還有研究表明，胰高血糖素使禁食大鼠血糖水平升高能避免阿斯匹林引起的胃粘膜損傷1。上述研究均支持胰島A細(xì)胞參與胃潰瘍自愈調(diào)節(jié)的觀點(diǎn)。綜上所述，在潰瘍自愈期間，胰島A細(xì)胞通過(guò)

23、增加其數(shù)目，增強(qiáng)其合成與釋放胰高血糖素功能積極參與了潰瘍自愈的調(diào)節(jié)過(guò)程。    版說(shuō)明14免疫組織化學(xué)PAP法，Ehrlich蘇木精復(fù)染1正常大鼠胰島A細(xì)胞×40023潰瘍后10d、14d大鼠胰島，A細(xì)胞明顯增多×4004潰瘍后14d大鼠胰腺小葉間、小導(dǎo)管周圍散在的胰高血糖素免疫反應(yīng)性細(xì)胞及小胰島×2006潰瘍后6d大鼠胰島A細(xì)胞，核大而圓，核仁邊集，胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)大量空泡×72007潰瘍后6d大鼠胰島A細(xì)胞，空泡表面有核糖體附著×140008潰瘍后6d大鼠胰島A細(xì)胞，核周隙擴(kuò)張，細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)少量空泡×

24、;290009潰瘍后14d大鼠胰島A細(xì)胞，示豐富的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和發(fā)達(dá)的高爾基復(fù)合體×7200Explanation of figuresFig.1-4 Immunohistochemiscal PAP method,Ehrlich hematoxylin countertainFig.1 The rat islet A cells in NCG. ×400Fig.2-3 The number of A cells increased remarkedbly on 10 and 14 days in EUG. ×400Fig.4 The sparse Glu-IR c

25、ells and small islets among pancreatic lobules and around small ductus on the 14th day in EUG. ×200Fig.6 The islet A cell on the 6th day in EUG,showing the larger and rounder nucleus with the obvious nucleolus and many vacuoles in the cytoplasm. ×7200Fig.7 The islet A cell on the 6th day i

26、n EUG,showing ribosome attached to vacuoles. ×14000Fig.8 The islet A cell on the 6th day in EUG,showing the dilated perinuclear gaps. ×29000Fig.9 The islet A cell on the 14th day in EUG,showing the rich rER and the developed Golgi complex. ×7200 Department of Histology and Embryology,

27、Weifang Medical College,Weifang Shandong 261041,China作者單位：黃巖（濰坊醫(yī)學(xué)院組織學(xué)胚胎學(xué)教研室濰坊261041）梁文妹（貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)組織學(xué)胚胎學(xué)教研室貴陽(yáng)550004）石愛榮（北京醫(yī)科大學(xué)組織學(xué)胚胎學(xué)系北京100083）參考文獻(xiàn)1，1978,74(2 Pt 1):2402陳玲，石愛榮.大鼠實(shí)驗(yàn)性胃潰瘍期間A，B細(xì)胞酶組織化學(xué)研究.解剖學(xué)報(bào)，1987，18(2)：2083張叔行，陳玲，陳東明，等.大鼠胃潰瘍模型的制作方法.解剖學(xué)雜志，1987，10(2)：1584成令忠主編.組織學(xué).第2版，北京：人民衛(wèi)生出版社，1993：511625Lefebvre PJ.Biosynthesis,Secretion and action of glucagon.In:Alberti KGMM,DeFronxo RA,Keen ,et al.(eds):International Textbook of Diabetes Mellitus.John Wiley and Sons Ltd;19