外源NO供體硝普鈉(SNP)對鹽脅迫下水稻幼苗中葉綠素和游離

1、作物學(xué)報 ACTA AGRONOMICA SINICA 2008, 34(10: 18491853ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9/zwxb/E-mail: xbzwDOI: 10.3724/SP.J.1006.2008.01849外源NO 供體硝普鈉(SNP對鹽脅迫下水稻幼苗中葉綠素和游離脯氨酸含量以及抗氧化酶的影響肖 強1,2 陳 娟2 吳飛華2 鄭海雷2,*(1 湖北民族學(xué)院 / 湖北省生物資源保護與利用重點實驗室, 湖北恩施445000; 2 廈門大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 福建廈門361005摘 要: 在100 mmol

2、 L1 NaCl脅迫下, 研究了不同濃度一氧化氮供體硝普鈉(sodium nitroprusside, SNP處理對水稻葉片葉綠素、游離脯氨酸含量, 葉片及幼根中愈創(chuàng)木酚過氧化酶(guaiacol peroxidase, GPX、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD、過氧化氫酶(catalase, CAT活性以及超氧陰離子產(chǎn)生速率等生理指標的影響。結(jié)果表明, 適當(dāng)?shù)蜐舛萐NP 處理可以顯著提高鹽脅迫下水稻葉片中葉綠素和脯氨酸含量, 并明顯緩解鹽脅迫下葉片和幼根受到的氧化性損傷; 但在水稻幼苗不同器官, SNP調(diào)節(jié)的主要靶酶有所不同, 在葉片中促進SOD 和CAT

3、活性, 而在幼根中除SOD 和CAT 活性外, 還提高GPX 活性。 關(guān)鍵詞: 水稻; 鹽脅迫; 一氧化氮Effects of Exogenous Nitric Oxide Donor SNP on Contents of Chlorophyll and Free Proline, Activity of Antioxidative Enzyme in Rice Seedlings under NaCl StressXIAO Qiang1,2, CHEN Juan2, WU Fei-Hua2, and ZHENG Hai-Lei2,*(1 Key Laboratory of Biologica

4、l Resources Protection and Utilization of Hubei Province, Hubei Institutes for Nationalities, Enshi 445000, Hubei;2School of Life Sciences, Xiamen University, Xiamen 361005, Fujian, ChinaAbstract : In this study, the contents of chlorophyll, free proline and the activities of GPX, SOD, CAT, and the

5、producing rate ofsuperoxide radicals in rice seedlings treated with a varying concentration of SNP under 100 mmol L1 NaCl stress were investi-gated. The results showed that the contents of chlorophyll and free proline increased by treatment with low SNP concentration under salt stress. SNP alleviate

6、d significantly the oxidative damage caused by salt stress in leaf and root of rice seedlings. Differ-ent enzyme activities were regulated by SNP between leaf and root in rice seedlings under salt stress, SNP alleviated significantly the oxidative damage via promoting SOD and CAT activities in rice

7、leaf, whereas, via regulating GPX activity mainly besides promoting SOD and CAT activities in root.Keywords: Oryza sativa; Salt stress; Nitric oxide一氧化氮(nitric oxide, NO是植物中一種重要的信號分子。它在植物生長、發(fā)育、衰老、細胞程序性死亡、乙烯釋放、抗病和對環(huán)境脅迫等各種不同形式的響應(yīng)中發(fā)揮重要功能1-2。例如, NO誘導(dǎo)種子萌發(fā)和去黃化; 抑制胚軸延長3。低濃度NO 可以誘導(dǎo)葉片和根伸長; 高濃度下則是抑制作用4。進一步研究表

8、明NO 在植物中的某些功能與它對活性氧(reactive oxygen species, ROS代謝水平的調(diào)節(jié)密切相關(guān), 其主要調(diào)節(jié)方式是作用于ROS 代謝酶,基金項目: 國家自然科學(xué)基金項目(30770192, 30670317, 30271065; 廈門大學(xué)“新世紀優(yōu)秀人才支持計劃”項目(X07115; 湖北民族學(xué)院博士啟動基金項目作者簡介: 肖強(1970, 男, 湖北恩施人, 博士, 研究方向為植物生理生化。Tel: E-mail: xiaoqiang761*通訊作者(Corresponding author: 鄭海雷。E-mail: zhenghl如NO 可

9、作用于煙草中含血紅素鐵和非血紅素鐵的過氧化氫酶(catalase, CAT和抗壞血酸過氧化物酶(ascorbate peroxidase, APX, 從而可能參與對活性氧的調(diào)節(jié)5。Cheng 等6研究發(fā)現(xiàn)NO 很可能通過提高超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD的活性和降低膜脂過氧化作用來減緩缺水造成的離體水稻葉片的衰老。雖然也有NO 對鹽脅迫下水稻幼苗氧化與抗氧化系統(tǒng)生理變化調(diào)控機制的研究7-8。但是缺乏NO 對水稻不同器官生理指標調(diào)Received(收稿日期: 2007-11-01; Accepted(接受日期: 2008-05-18. 1850作 物 學(xué) 報

10、第34卷控機制差異的報道。水稻是對鹽害較為敏感的重要作物, 灌溉土壤中鹽積累是限制水稻產(chǎn)量的主要因子。研究鹽脅迫下水稻生理變化及其機制對于稻種篩選, 提高水稻適應(yīng)性和產(chǎn)量、品質(zhì)具有重要意義。本文報道外源NO 供體硝普鈉(SNP對NaCl 脅迫下水稻幼苗生理的影響, 并初步探討了相關(guān)機制。1.2.6 SOD活性的測定 參照Beauchamp 和Fridovich 13建立的方法, SOD活性分析前過Sephadex G-25柱以避免SNP 對活性測定的干擾, 以抑制氮藍四唑(NBT在光照下被還原50%的酶量為一個酶活性單位(U。1.2.7 GPX活性的測定 參照Ruan 等14的方法, 以460

11、 nm吸光值每分鐘上升0.01為一個酶活性單位(U。 1.2.8 CAT活性的測定 參照Chance 和Maehly 15的方法, 以240 nm吸光值每分鐘減小0.01為一個酶活性單位(U。1.3 數(shù)據(jù)分析用SPSS 軟件進行方差分析, 以O(shè)rigin 軟件繪制圖表。1 材料與方法1.1 材料培養(yǎng)與處理水稻品種為佳輻占(Oryza sativa cv. “Jiafuzhan”, 種1周后用木子經(jīng)0.1% HgCl2消毒, 水洗, 25浸種, 催芽。村B 溶液8水培, 溫度26, 光照400 mol m2 s 1, 光/暗時間為12 h/12 h, 至兩葉一心期在培養(yǎng)液中加入NaCl 和SNP

12、 同時進行處理。設(shè)兩種鹽處理, 分別為0 mmol L1和100 mmol L NaCl, 文中以salt0和salt100表示; 每種鹽處理再設(shè)4種SNP 濃度, 分別為0、0.01、0.1和1.0 mmol L 1, 在文中分別以SNP0、SNP0.01、SNP0.1、SNP1表示, 共8種處理。每個處理設(shè)3個重復(fù), 每天更換處理液1次, 在處理3 d后經(jīng)測定各處理組間葉綠素含量表現(xiàn)出顯著差異, 由此取相應(yīng)時相葉片和幼根進行相關(guān)生理指標測定。 1.2 測定方法1.2.1 葉綠素含量的測定 采用80丙酮提取, Arnon法9。1.2.2 脯氨酸含量的測定 采用3磺基水楊酸提取, 酸性茚三酮比

13、色法10。 1.2.3 氧自由基華11的方法。1.2.4 酶液的制備 取0.4 g左右新鮮水稻葉片或幼根于冰浴研缽中, 加少許石英砂和10 mL預(yù)冷的酶提取液(用50 mmol L1、pH 7.8的磷酸緩沖液配制, 內(nèi)含1%的PVP, 5 mmol L1的EDTA, 迅速勻漿, 4, 20 000×g 離心20 min, 取上清液備用。1.2.5 蛋白質(zhì)含量的測定 采用Bradford 法12, BSA作為蛋白質(zhì)標準。12 結(jié)果與分析2.1 SNP 對水稻幼苗葉片葉綠素含量和脯氨酸含量的影響葉綠素含量下降是植物遭受鹽脅迫的重要特征之 一16。本研究也顯示了同樣特征(圖1-A, 在無鹽

14、情況下, 較低濃度SNP (0.01 mmol L1和0.1 mmol L1 可以顯著增加水稻葉片中葉綠素含量(P <0.05。而1 mmol L1 SNP處理則顯著減少了葉片中葉綠素含量。鹽脅迫下, 0.1 mmol L1 SNP 處理可以顯著提高葉片中葉綠素含量 (P <0.05, 高濃度SNP(1.0 mmol L1 則進一步加劇了葉片中葉綠素的喪失。在鹽脅迫下植物積累脯氨酸具有一定普遍性17。由圖1-B 可看出, 在鹽脅迫下, 脯氨酸含量顯著升高(P <0.01。在無鹽情況下, 不同SNP 處理之間脯氨酸含量無差異(P >0.05, 但均較對照組(SNP0降低(

15、P <0.05。在鹽脅迫下, 情況則不同, 0.1 mmol L1 SNP處理明顯促進脯氨酸含量的增加, 而0.01 mmol L1和1 mmol L1 SNP處理則顯著降低鹽脅迫下脯氨酸含量(P <0.01。 2.2 SNP 對水稻幼苗葉片及幼根產(chǎn)生速率的影響從圖2可見, 在無鹽和有鹽脅迫下, 0.01 mmol L1&SNP 處理都可以顯著降低葉片中O 2產(chǎn)生速率(P <0.05, &1.0 mmol L1 SNP處理則顯著增高了葉片中O 2產(chǎn)生速率 含量的測定 參照王愛國和羅廣圖1 SNP 對鹽脅迫下水稻幼苗葉片總?cè)~綠素(A和游離脯氨酸含量(B的影響Fi

16、g. 1 Effect of SNP on the contents of total chlorophyll (A and free praline (B in rice seedling leaf under salt stress第10期肖 強等: 外源NO 供體硝普鈉對鹽脅迫下水稻幼苗中葉綠素和游離脯氨酸含量以及抗氧化酶的影響 1851(P <0.05, 在無鹽情況下, 0.1 mmol L1 SNP清除自由基效果更明顯, 而鹽脅迫下, 0.01 mmol L1 SNP可以顯著降低1&葉片中O 2產(chǎn)生速率。在幼根中, 0.1 mmol L SNP處理顯著降低鹽脅迫下自由基

17、產(chǎn)生速率(P <0.05, 而1.0 mmol L 1 SNP處理則增加鹽脅迫下自由基產(chǎn)生速率(P <0.05。表明SNP 清除自由基存在明顯劑量效應(yīng), 即在鹽害下適當(dāng)?shù)蜐舛萐NP (0.1 mmol L1 發(fā)揮清除自由基功效, 高濃度SNP 釋放的NO 本身對植物產(chǎn)生自由基樣傷害效應(yīng)。 2.3 SNP 對水稻幼苗活性氧代謝相關(guān)酶活性的影響表1顯示, 在無鹽處理水稻葉片中, SNP對SOD 活性表現(xiàn)為抑制效應(yīng), 各SNP 濃度處理組SOD 活性均顯著低于 表1 SNP 對鹽脅迫下水稻幼苗葉片中SOD(A、GPX(B和CAT(C活性的影響Table 1 Effects of SNP

18、on the activities of SOD(A, GPX(B, and CAT(C in leaf of rice seedlings under salt stress鹽濃度Salt concentration (mmol L1圖2 SNP 對鹽脅迫下水稻幼苗葉片及幼根產(chǎn)生速率的影響Fig. 2 Effect of SNP on producing rate of superoxide radicals inleaf and root tissues of rice seedling under salt stressSNP 濃度 SNP concentration(mmol L10

19、0.01 0.1 1.0SOD 活性 SOD activity (U mg1 Pro 7.78±0.10 a 6.34±0.04 c 6.61±0.15 c 7.41±0.13 bGPX 活性 GPX activity (U mg1 Pro 48.52±3.73 c 49.33±3.53 c 67.26±4.79 b 83.01±2.90 aCAT 活性 CAT activity (U mg1 Pro 86.32±3.82 b 83.58±0.32 b 87.15±2.65 b 93.

20、40±3.02 a1000 0.01 0.1 1.08.49±0.08 c 7.02±0.10 d 9.03±0.05 b 10.35±0.04 a71.56±2.87 a 72.66±3.65 a 49.14±2.81 b 70.07±2.10 a82.53±3.87 c 80.28±0.86 c 91.87±1.93 b 105.13±0.38 a同一欄內(nèi)數(shù)據(jù)后不同字母者在同一鹽度內(nèi)0.05水平上差異顯著。Values within a column follo

21、wed by a different letter are significantly different at the 0.05 probability level for same salinity.對照(P <0.05; 在鹽脅迫下, 0.1 mmol L1和1.0 mmol L1 SNP 處理可以顯著提高SOD 活性, 增強葉片清除自由基的能力。但對于水稻幼根, 情況則有所不同, 如表2所示, 在鹽脅迫下, 0.01 mmol L1和0.1 mmol L1 SNP處理顯著提高幼根SOD 活性(P <0.05, 而1.0 mmol L1 SNP處理則顯著抑制SOD 活性(P

22、<0.05; GPX活性則與SOD 不同, 水稻幼根中GPX 活性超過葉片中10倍以上。在幼根中鹽脅迫導(dǎo)致GPX 活性上升, 而SNP 處理進一步促進這種上升。各濃度SNP 處理均顯著提高GPX 活性(P <0.01 (表2 。增強幼根自由基清除能力, 保護水稻根部抵御鹽脅迫引起的氧化性損傷。CAT 活性變化比較復(fù)雜, 表1顯示, 在水稻葉片中, 無鹽處理下, SNP處理對CAT 活性無明顯影響, 僅1.0 mmol L1 SNP處理顯著提高CAT 活性(P <0.05; 但在鹽表2 SNP 對鹽脅迫下水稻幼苗根中SOD(A、GPX(B和CAT(C活性的影響Table 2 E

23、ffects of SNP on the activities of SOD(A, GPX(B, and CAT(C in root of rice seedlings under salt stress鹽濃度Salt concentration (mmol L1SNP 濃度 SNP concentration(mmol L10 0.01 0.1 1.0SOD 活性 SOD activity (U mg1 Pro 15.38±0.27 b 16.23±0.32 b 9.80±0.50 c 17.39±0.30 aGPX 活性 GPX activity (

24、U mg1 Pro 482.79±11.30 d 686.89±16.78 c 974.88±10.46 b 1604.38±52.25 aCAT 活性 CAT activity (U mg1 Pro 40.52±2.35 c 47.85±1.05 b 66.72±4.43 a 28.64±3.21 d1000 0.01 0.1 1.014.72±0.59 b 17.49±0.62 a 17.21±0.60 a 13.90±0.48 b818.17±21.91 c

25、874.47±23.76 c 1144.69±15.19 b 1555.90±55.26 a50.91±4.50 b 55.00±6.38 b 88.34±2.33 a 87.17±3.47 a同一欄內(nèi)數(shù)據(jù)后不同字母者在同一鹽度內(nèi)0.05水平上差異顯著。Values within a column followed by a different letter are significantly different at the 0.05 probability level for same salinity.1852作 物

26、學(xué) 報 第34卷脅迫下, 0.1 mmol L1和1.0 mmol L1 SNP處理均顯著提高CAT 活性(P <0.05, 表明SNP 促進的CAT 活性升高增強了葉片對鹽脅迫引起的活性氧清除能力。對于無鹽處理的水稻幼根, 如表2所示, 0.1 mmol L1 SNP處理顯著提高CAT 活性(P <0.05, 而1.0 mmol L1 SNP處理則顯著抑制CAT 活性(P <0.01; 另一方面, 鹽脅迫顯著提高幼根CAT 活性(P <0.01, 與此同時, 各濃度SNP 處理均顯著提高CAT 活力(P <0.05, 從而增強了水稻幼根對抗鹽脅迫所致氧化性損傷的

27、能力。3 討論SNP 普遍作為NO 的外源供體, Delledonne等1發(fā)現(xiàn)0.5 mmol L1SNP大約釋放2.0 mol L1NO。Beligni 和Lamattina 18研究表明低濃度的NO (0.11.0 mol L1 可以減輕由除草劑導(dǎo)致的葉綠素喪失的程度。本研究進一步證實NO 能明顯緩解鹽脅迫下水稻幼苗葉綠素的降解, 對葉綠素具有保護效應(yīng), 同時證明這種保護效應(yīng)存在劑量關(guān)系, 即低濃度保護, 高濃度抑制。Laxalt 等19認為NO 介導(dǎo)的葉綠素保護來源于對抗ROS 毒性, 保護膜的完整性。本研究表明0.1 mmol L1SNP處理下, 葉片CAT 和SOD 活性升高, 與此

28、同時, 葉綠素含量也是升高的; 進一步證實NO 能通過提高葉片中抗氧化酶活性明顯緩解鹽脅迫下葉綠素的降解。植物在逆境下積累脯氨酸具有一定普遍性, 脯氨酸可作為滲透調(diào)節(jié)物、膜和酶的保護物質(zhì)及自由基清除劑等而對植物起保護作用17。關(guān)于脯氨酸在植物逆境應(yīng)答中作為一個傷害標志或者是作為對抗逆境的抗性指標, 一直存在爭論。本研究表明在SNP 處理下, 無鹽處理的水稻幼苗葉片中脯氨酸含量基本不受外源NO 影響, 在鹽脅迫下, 0.1 mmol L1 SNP處理明顯促進了脯氨酸含量的增加, 可以緩解鹽脅迫引起的滲透脅迫, 而1.0 mmol L1 SNP處理則顯著降低了鹽脅迫下脯氨酸含量(P <0.0

29、1, 與此同時水稻葉片自由基釋放速率等氧化性損傷指標也是上升的, 我們認為脯氨酸可以作為一個抗性指標, 反應(yīng)水稻在NaCl 脅迫下適應(yīng)能力。本研究結(jié)果與Ruan 等14的試驗結(jié)果不同, 他們在研究NO 對鹽脅迫下小麥葉片氧化損傷的保護效應(yīng)時, 發(fā)現(xiàn)在鹽脅迫下, 1.0 mmol L1 SNP處理顯著增加了葉片脯氨酸含量。我們推測這種區(qū)別可能是由于NO 對中度耐鹽的小麥和對鹽較為敏感的水稻具有不同的脯氨酸代謝調(diào)節(jié)機制。很多環(huán)境脅迫可引起植物ROS 的過量產(chǎn)生, 鹽脅迫下, 植物葉片內(nèi)的H 2O 2含量和O &202產(chǎn)生速率升高。SOD 、GPX 和CAT 組成植物清除活性氧自由基的保護酶

30、系統(tǒng)。其中, SOD可將O &2歧化為H 2O 2, 而GPX 和CAT則能清除H 2O 2。Beligni 和Lamattina 18認為, 作為一種抗氧化劑, NO可以抵消許多由ROS 介導(dǎo)的細胞毒害作用。正常生理情況下, 細胞質(zhì)、線粒體和細胞外SOD 的催化活性可以將O &2快速歧化為H 2O 2和分子氧, 高濃度的NO可以和這種歧化反應(yīng)競爭, 導(dǎo)致ONOO 的形成, 從而損傷蛋白質(zhì)、脂、RNA 和DNA 21。在本研究中, 總體來看, 對于水稻幼苗葉片和幼根, 0.1 mmol L1 SNP處理具有明顯保護效應(yīng), 而1.0 mmol L1SNP 處理則表現(xiàn)為傷害效應(yīng),

31、如導(dǎo)致鹽脅迫下水稻葉片中葉綠素和脯氨酸含量下降, 自由基釋放速率增加等。進一步證實了高濃度NO 對植物的傷害效應(yīng)。已有研究表明, 鹽脅迫可降低水稻幼苗中保護酶如SOD 、GPX 和CAT 活性22。本研究情況與此不同, 在水稻葉片中, 鹽脅迫提高了SOD 和CAT 活性, 降低了GPX 活性。0.1 mmol L1 SNP處理進一步促進了SOD 和CAT 活性上升, 這與Uchida 等7研究結(jié)果相似。同時, 本研究進一步證實鹽脅迫下不同濃度SNP 處理的水稻葉片中自由基產(chǎn)生速率和SOD 活性變化之間也具有顯著正相關(guān)(R 20.986, P <0.05, 表明在鹽脅迫下葉片中SOD 活性

32、受到外源NO 的調(diào)控, 從而影響葉片自由基清除能力。這與Cheng 等6對離體水稻葉片研究得到的結(jié)論具有相似性。此外, 研究還顯示不同濃度SNP 處理下葉片中CAT 活性與自由基產(chǎn)生速率間也存在顯著正相關(guān)(R 2=0.964, P <0.05, 提示CAT 也參與了鹽脅迫下自由基清除, 這和Murgia 等23研究認為在擬南芥中SNP 抑制CAT 活性是不同的。另一方面, 在幼根中情況則有所不同, 鹽脅迫提高了SOD 、GPX 和CAT 三種保護酶的活性, 且GPX 活性超過葉片10倍以上, 表明在幼根中, GPX可能是更為重要的抗氧化酶。0.1 mmol L1 SNP處理全面促進了SO

33、D 、GPX 和CAT 三種保護酶活性的進一步上升, 增強了幼根的抗氧化能力。植物中NO 的產(chǎn)生主要有4種途徑, 即類似動物NOS 蛋白、NR 催化、其他酶促反應(yīng)如亞硝酸鹽NO 還原酶(Ni-NOR和黃嘌呤氧化酶(XO催化以及非酶促反應(yīng)24; 此外在植物中其他酶促反應(yīng)催化NO 產(chǎn)生也得到證實, 如質(zhì)膜結(jié)合酶、細胞色素P450、亞鐵血紅素蛋白、辣根過氧化物酶均可催化相應(yīng)底物生成NO, 植物中NO 來源的多樣性與產(chǎn)生途徑的多樣性似乎存在相似之處4。在本研究中, 適當(dāng)濃度SNP 處理提高了鹽脅迫下水稻葉片中SOD 和CAT 活性, 減輕了氧化性損傷。而幼根中, 適當(dāng)濃度SNP 處理在提高鹽脅迫下SO

34、D 和CAT 活性的同時, 更顯著提高了GPX 活性, 從而顯著減輕幼根受到的氧化性損傷。表明外源NO 對水稻抗氧化系統(tǒng)的調(diào)節(jié)存在明顯的器官異質(zhì)性。考慮到水稻基因組測序工作已經(jīng)完成, 進一步鑒定水稻不同部位NO 合成的主導(dǎo)途徑, 從調(diào)節(jié)水稻內(nèi)源NO 合成途徑關(guān)鍵酶活性著手, 通過生物工程技術(shù)調(diào)控這些酶活性水平進而調(diào)控內(nèi)源NO 水平, 對于有效提高水稻耐鹽水平具有重要實踐意義。References1 Delledonne M, Xia Y J, Dixon R A, Lamb C. Nitric oxide functions asa signal in plant disease resist

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