返魂草中硒多糖及硒元素含量的測定

1、返魂草中硒多糖及硒元素含量的測定    【摘要】   目的測定返魂草中硒多糖含量。方法采用回流提取法和微波超聲波協(xié)同提取法提取樣品中的硒多糖，利用正交實(shí)驗(yàn)確定微波超聲波協(xié)同提取法的最佳提取條件；用硫酸-蒽酮法測定返魂草中硒多糖含量；用石墨爐原子吸收法測定硒多糖中微量元素硒。結(jié)果回流提取法提取得粗硒多糖含量為5.100%，回收率97.83%，精密度0.95%；微波超聲波協(xié)同提取法提取得粗硒多糖含量為5.395%，回收率97.93%，精密度1.170%；石墨爐原子吸收法測得粗硒多糖中硒含量為24.4g/g，回收率97.64%,精密度1.901%。結(jié)

2、論微波超聲波協(xié)同提取法提取的返魂草中硒多糖含量高于回流提取法提取的返魂草中硒多糖含量，因此，微波超聲波協(xié)同提取法是一種快速、靈敏的提取方法。 【關(guān)鍵詞】   返魂草； 硒多糖； 石墨爐原子吸收法； 硒麻葉千里光Senecio cannabifolius Lessl.又名寬葉返魂草, 為菊科千里光屬多年生草本植物,主要分布于我國東北、河北等地及朝鮮、日本、前蘇聯(lián)遠(yuǎn)東地區(qū), 生長于山溝林緣及濕草甸上, 該植物具有散瘀、止血、止痛的功效1, 在民間被廣泛用于感冒、炎癥的 治療 。千里光屬植物含有吡咯里西啶類生物堿, 該類生物堿的體內(nèi)代謝物具有肝、腎損害等毒性作用, 已被英國、澳大利亞等國以

3、安全性問題為由禁止使用, 使該屬藥材及其制劑的生產(chǎn)、銷售和使用面臨非常不利的局面。因此, 對千里光屬藥材進(jìn)行系統(tǒng)的化學(xué)成分、藥效和安全性評價(jià)十分必要2。    近年來,由于多糖大量的生物活性功能以及在功能食品和臨床上的廣泛使用,使多糖生物資源的開發(fā)和利用研究日益活躍,成為天然藥物、生物化學(xué)、生命 科學(xué) 領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。到目前為止,已有三百多種多糖類化合物從天然產(chǎn)物中被分離出,其中從植物,尤其是從中藥中提取的水溶性多糖最為重要,研究也十分活躍。    由于硒多糖在生物體內(nèi)的含量甚少,因此國內(nèi)外對硒多糖的存在形態(tài)及硒多糖中痕量硒的分析報(bào)道

4、非常有限。生物體中微量的硒多糖以及硒多糖中超微量的硒限制了人們對硒多糖的深入研究,只有超高靈敏度的檢測技術(shù)才有可能滿足分析硒多糖中痕量硒的要求。本文采用蒽酮-硫酸法測定返魂草中硒多糖的含量，用石墨爐原子吸收法測定硒多糖中的硒含量。 1  儀器與試劑 1.1  材料與試劑返魂草產(chǎn)自延邊地區(qū)。乙醇、丙酮、乙醚、硫酸、蒽酮均為分析純。硒標(biāo)準(zhǔn)儲備液均為國家標(biāo)準(zhǔn)溶液（NCS），實(shí)驗(yàn)用水均為二次蒸餾水及娃哈哈純凈水。1.2  儀器及工作條件FZ102型微型植物粉碎機(jī)(天津市泰斯特儀器有限公司)；數(shù)顯式電熱恒溫水浴鍋(鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司) ；FA2104N 電子 天平(

5、上海精密科學(xué)儀器公司)；CW-2000型微波超聲波協(xié)同萃取儀（上海新拓微波溶樣測試技術(shù)有限公司）；TAS-990型原子吸收分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）。石墨爐原子吸收儀器的工作條件見表12。    實(shí)驗(yàn)所用玻璃儀器均經(jīng)稀硝酸浸泡12 h以上，然后經(jīng)自來水、蒸餾水、去離子水依次洗凈烘干備用。 2  方法與結(jié)果 2.1  樣品處理用蒸餾水反復(fù)沖洗返魂草，于60 恒溫箱中干燥，然后用微型植物粉碎機(jī)粉碎裝瓶備用。2.2  返魂草中硒多糖的提取2.2.1  回流提取法稱取返魂草全草用30100目粉碎機(jī)粉碎，稱取10.0

6、g置圓底燒瓶中，加入乙醚200 ml，回流提取70 min，然后抽濾，棄去濾液，將濾渣小心轉(zhuǎn)移至燒瓶內(nèi)，用乙醚沖凈濾紙上的濾渣一起轉(zhuǎn)移至圓底燒瓶內(nèi)，再加入乙醚200 ml，回流提取60 min，同樣方法進(jìn)行抽濾轉(zhuǎn)移，再用150 ml乙醚回流提取60 min，使濾液基本無色。將濾渣風(fēng)干除去其中乙醚，轉(zhuǎn)移至干凈的圓底燒瓶中，用200 ml去離子水沸水回流3次，30 min/次，趁熱過濾，合并濾液，將濾液至電爐上濃縮至50 ml，加入無水乙醇200 ml，使醇含量為80%。靜置過夜，濾過。沉淀再加水溶解，加乙醇至醇含量為80%靜置過夜，取沉淀分別用無水乙醇、丙酮依次洗滌3次，20 ml/次，置45

7、烘干后可得棕色粗多糖0.51 g。表1  TAS-990型石墨爐原子吸收分光光度計(jì)工作條件（略）表2  TAS-990石墨爐的硒元素測定加溫程序（略）2.2.2  微波超聲波協(xié)同提取法精確稱量返魂草樣品6份各10.00 g，根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)得出的最佳條件，在最佳優(yōu)化方案下即料液比為135，提取功率為250 W,提取時(shí)間為180 s條件下提取，按照“2.2.1”項(xiàng)方法進(jìn)行平行測定6次，得到10.00 g返魂草中粗多糖提取率分別為5.41%，5.56%，5.33%，5.28%，5.34%，5.45%，粗多糖平均提取率5.395%。2.3  返魂草中粗

8、硒多糖純度測定2.3.1  葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制將一定量葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品粉末于107 烘干至恒重，精確稱取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品粉末0.020 g于100 ml容量瓶中，定容、搖勻。精確量取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液0，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 ml,分別置10 ml量瓶中,純化水定容,搖勻,再分別精密量取2.0 ml,置干燥具塞試管中,加入蒽酮-硫酸試劑4.0 ml,立刻搖勻,冷卻至室溫置于暗處。同時(shí)以2.0 ml去離子水,加蒽酮-硫酸試劑4.0 ml作空白。在620 nm波長處測定吸收度。以葡萄糖含量（g/ml）為橫坐標(biāo),吸光度(A)為縱坐標(biāo)進(jìn)行回歸,得回歸方程為：Y = 0.007 2X

9、+ 0.008 7,R2=0.998 5。2.3.2  粗硒多糖溶液的制備及純度測定精確量取粗硒多糖0.030 g，加入去離子水溶解，轉(zhuǎn)移至100 ml容量瓶中。精密量取配好溶液1.0，2.0，3.0 ml各3份,置干燥具塞試管中,各加蒽酮-硫酸試劑4.0 ml,立即搖勻,冷卻至室溫,按“2.3.1”項(xiàng)下操作。    粗硒多糖純度按下式 計(jì)算 ： 粗硒多糖純度（%）=(A-0.0087)×100/0.0072×VW×106    (A:吸光度；W:量取粗硒多糖質(zhì)量；V:取液量) 

10、60;  根據(jù)三組數(shù)據(jù)0.351,0.698,1.040計(jì)算得粗硒多糖平均純度為15.9%，由返魂草中粗硒多糖平均提取率為5.395%(“2.2.2”所得),所以返魂草中硒多糖含量為5.395%×15.9%=0.86%。2.4  加樣回收率實(shí)驗(yàn)精密量取粗硒多糖溶液1.0,2.0,3.0 ml,分別加入葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液1.0,2.0,3.0 ml置10 ml量瓶中,再分別量取4.0 ml蒽酮-硫酸試劑置干燥具塞試管中在620 nm 波長處測定吸收度。結(jié)果見表3。表3  回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果（略）2.5  精密度實(shí)驗(yàn)分別精密取同一供試液5 份,每份2.0

11、 ml,置干燥具塞試管中,各加蒽酮-硫酸試劑4.0 ml,立即搖勻,冷卻至室溫, 按“2.3.1”項(xiàng)下操作,計(jì)算精密度。結(jié)果RSD為0.95%和1.17%。表4  精密度實(shí)驗(yàn)（略）從表4中可以看出，本實(shí)驗(yàn)的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在5%以內(nèi)，說明本實(shí)驗(yàn)的重現(xiàn)性好，測定結(jié)果可信。 2.6  返魂草粗硒多糖中硒元素的測定2.6.1  硒標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制精確量取硒標(biāo)準(zhǔn)溶液1 ml,用純水定容到1 000 ml,得到濃度為1g/ml的母液，取母液0 , 0.4 , 0.8 , 1.2 ,1.6 , 2.0 ml定容到10 ml , 得Se濃度分別為0，0.04，0.08，0.12，0.

12、16，0.20 g/ml，用石墨爐原子吸收分光光度計(jì)在上述工作條件下測定其吸光度值。根據(jù)測定的吸光度值 計(jì)算 出回歸方程和相關(guān)系數(shù)：回歸方程Y=1.233 6X+0.002 1，（其中X為Se標(biāo)準(zhǔn)液濃度，Y為吸光度）；相關(guān)系數(shù)為0.999 8。2.6.2  粗硒多糖溶液的配制精確稱取返魂草粗硒多糖0.365 g，加純凈水定容于100 ml容量瓶中。然后分別取0.0，2.0，4.0，6.0，8.0 ml于10 ml容量瓶中，用純凈水定容至刻度。2.6.3  硒元素的檢測結(jié)果粗硒多糖中Se的含量計(jì)算公式為：    mSe=(A-0.0021) &#

13、215;10×1001.2332×V×W    mSe粗硒多糖中Se的含量；A測定吸光度；V取液量；W稱取粗多糖質(zhì)量    測定結(jié)果見表5。表5  多糖中硒元素含量的測定（略）由以上4組數(shù)據(jù)得粗多糖平均含硒量為：mSe=24.33 +24.38+24.77+24.41）/4×0.365 = 24.47（g / g）2.7  精密度實(shí)驗(yàn)對粗糖樣品液中Se元素進(jìn)行吸光度值測定，結(jié)果見表6。表6  Se元素的變異系數(shù)（略）從表6中可以看出，本實(shí)驗(yàn)的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD在5%

14、以內(nèi)，說明本實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性好，測定結(jié)果可信。2.8  準(zhǔn)確度實(shí)驗(yàn)吸取一定量的樣液進(jìn)行返魂草粗多糖中Se的回收率實(shí)驗(yàn)。測定結(jié)果見表7。表7  返魂草中Se的回收率（略）由表7可見，測量的回收率在一定范圍之內(nèi)，說明測量的準(zhǔn)確度高。2.9  檢出限Se的檢出限為：0.5 ng/ml，可能是由于：乙炔氣體不純，造成原子化溫度的穩(wěn)定性不好；注射器內(nèi)有小氣泡；空白溶液的值偏高。 3  討論 3.1  兩種提取方法的比較回流提取法得粗硒多糖含量為5.100%，回收率97.83%，精密度0.95%；微波超聲波協(xié)同提取法得粗硒多糖含量為5.395%，回收率97.9

15、3%，精密度1.170%。由結(jié)果看出微波超聲波協(xié)同提取法比回流提取法提取率稍高些。    回流提取法提取時(shí)間長，步驟較復(fù)雜，在料液轉(zhuǎn)移過程中容易出現(xiàn)誤差；微波超聲波協(xié)同提取法直接將振動(dòng)與開放式微波兩種作用方式相結(jié)合，充分利用了超聲波振動(dòng)的空化作用（同時(shí)具有萃取和機(jī)械攪拌作用）以及微波的高能作用。進(jìn)而使樣品得到充分的作用，從而最大限度地將樣品中的有效成分提取出來，既省時(shí)，又可節(jié)約原材料。3.2  硒多糖及硒的功效硒和多糖同樣對許多疾病具有防治作用,近年來對多糖和硒活性的研究已經(jīng)較為深入,但將多糖與硒有機(jī)結(jié)合成為硒多糖,國內(nèi)外的研究尚處于起步階段。硒與多糖的

16、有機(jī)結(jié)合形成硒多糖將會(huì)使硒和多糖的生理和藥理功能得到優(yōu)化。然而對硒多糖的全部功能和生化特性尚未完全清楚,尤其是從分子生物學(xué)的角度對硒多糖的構(gòu)效關(guān)系,以及作用機(jī)制等方面研究的直接證據(jù)和實(shí)驗(yàn)更顯不足,因此采用 現(xiàn)代 分離分析技術(shù)對硒多糖進(jìn)行深入研究是非常必要的。    多糖具有抗腫瘤和免疫促進(jìn)、抗炎、抗病毒、抗凝血、降血糖等廣泛的生物學(xué)活性。硒與多糖的有機(jī)結(jié)合形成硒多糖將會(huì)使硒和多糖的生理和藥理功能得到優(yōu)化。    硒是谷胱甘肽過氧化物酶的活性中心元素，在清除自由基、分解過多的過氧化氫、減少過氧化物、保護(hù)細(xì)胞膜、保護(hù)細(xì)胞敏感分子DNA, RNA中占有重要地位。硒在機(jī)體中多以蛋白形式存在。其主要生理功能有參與酶的催化反應(yīng);調(diào)節(jié)維生素A, C, E, K的吸收與消耗;在機(jī)體代謝和 電子 傳遞中起作用;增強(qiáng)機(jī)體免疫能力;增強(qiáng)人的生育能力及生殖能力。硒缺乏可能會(huì)導(dǎo)致克山病、大骨節(jié)病、惡性營養(yǎng)不良、甲狀腺激素代謝疾病、免疫力低下等，一些動(dòng)物實(shí)驗(yàn)提出低硒可能對心血管疾病發(fā)生起作用。硒還具有抗腫瘤、抗癌作用。    目前還無研究返魂草中硒多糖的報(bào)道，本文采用蒽酮-硫酸法測定了返魂草中硒多糖的含量，用石墨爐原子吸收法測定硒多糖中的硒含量，返魂草中硒多糖及微量元素硒不僅與該植物具有散瘀、止血、止痛的功效有密切的關(guān)