蛋白質(zhì)的測定

1、蛋白質(zhì)的測定 食品中的蛋白質(zhì)含量 在各種不同的食品中蛋白質(zhì)的含量各不相同，一般說來動物性食品的蛋白質(zhì)高于植物性食品，例如牛肉中蛋白質(zhì)含量為20.0%左右，豬肉中為9.5%，兔肉為21%，雞肉為20%，牛乳為3.5%黃魚為17.0%，帶魚為18.0%，大豆為40%，稻米 8.5%，面粉為9.9%，菠菜為2.4%，黃瓜為1.0%，桃為0.8%，柑橘為0.9%，蘋果為0.4%和油菜為1.5%左右。 測定食品中蛋白質(zhì)的含量，對于評價食品的營養(yǎng)價值、合理開發(fā)利用食品資源、提高產(chǎn)品質(zhì)量、優(yōu)化食品配方、指導(dǎo)經(jīng)濟(jì)核算及生產(chǎn)過程控制均具有極重要的意義。 蛋白質(zhì)測定方法 測定蛋白質(zhì)的方法可分為兩大類： 一類是利用

2、蛋白質(zhì)的共性，即含氮量 、肽鍵和折射率測定蛋白質(zhì)含量 ； 另一類是利用蛋白質(zhì)中特定氨基酸殘基、酸性和堿性基團(tuán)以及芳香基團(tuán)等測定蛋白質(zhì)含量。 蛋白質(zhì)的測定，目前多采用將蛋白質(zhì)消化，測定其含氮量，再換算為蛋白質(zhì)含量的凱氏定氮法。不同食品的蛋白質(zhì)系數(shù)有所不同。 凱氏定氮法是測定總有機(jī)氮量較為準(zhǔn)確、操作較為簡單的方法之一，可用于所有動、植物食品的分析及各種加工食品的分析，可同時測定多個樣品，故國內(nèi)外應(yīng)用較為普遍，是個經(jīng)典分析方法，至今仍 被作為標(biāo)準(zhǔn)檢驗方法。 凱氏定氮法：常量法、微量法及經(jīng)改進(jìn)后的改良凱氏定氮法。 微量凱氏定氮法樣品質(zhì)量及試劑用量較少，且有一套微量凱氏定氮器。 目前通用以硫酸銅作催化劑

3、的常量、半微量、微量凱氏定氮法。 在凱氏法改良中主要的問題是，氮化合物中氮的完全氨化問題及縮短時間、簡化操作的問題，即分解試樣所用的催化劑。常量改良凱氏定氮法在催化劑中增加了二氧化鈦。常量凱氏定氮法 (1) 原理 樣品與濃硫酸和催化劑一同加熱消化，使蛋白質(zhì)分解，其中碳和氫被氧化為二氧化碳和水逸出，而樣品中的有機(jī)氮轉(zhuǎn)化為氨與硫酸結(jié)合成硫酸銨。然后加堿蒸餾，使氨蒸出，用硼酸吸收后再以標(biāo)準(zhǔn)鹽酸或硫酸溶液滴定。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)酸消耗量可計算出蛋白質(zhì)的含量。 (2) 適用范圍 此法可應(yīng)用于各類食品中蛋白質(zhì)含量測定（3)儀器 500ml凱氏燒瓶；定氮蒸餾裝置 (4)試劑 硫酸銅； 硫酸鉀；硫酸； 40gL硼酸溶液

4、； 混合指示劑； 400gL氫氧化鈉；L鹽酸 標(biāo)準(zhǔn)溶液(5) 操作步驟樣品消化：準(zhǔn)確稱取均勻的固體樣品0.53g,或半固體樣品25g,或吸取溶液樣品1525ml。小心移入干燥的凱氏燒瓶中(勿粘附在瓶壁上)。加入0.51g硫酸銅、10g硫酸鉀及25ml濃硫酸，小心搖勻后，于瓶口置一小漏斗，瓶頸45h，冷卻至室溫。 蒸餾、吸收 按圖裝好蒸餾裝置，冷凝管下端浸入接受瓶液面之下（瓶內(nèi)預(yù)先裝有50ml 40gL硼酸溶液及混合指示劑56滴）。凱氏燒瓶內(nèi)，加入100ml蒸餾水、玻璃珠數(shù)粒，從安全漏斗中慢慢加入70ml 400g/L氫氧化鈉，溶液應(yīng)呈藍(lán)褐色。不要搖動，將定氮球連接好。用直火加熱蒸餾30min，

5、將蒸餾裝置出口離開液面繼續(xù)蒸餾1min，用蒸餾水淋洗尖端后停止蒸餾。 mol/L鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至終點。同時做一試劑空白（除不加樣品，從消化開始操作完全相同）。 式中W蛋白質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，%； c鹽酸標(biāo)準(zhǔn)液的濃度，mol/L； V1空白滴定消耗標(biāo)準(zhǔn)液量，mL； V2試劑滴定消耗標(biāo)準(zhǔn)液量，mL； m樣品質(zhì)量，g； 0.014氮的毫摩爾質(zhì)量，g/mmol； F蛋白質(zhì)系數(shù)。不同的蛋白質(zhì)其氨基酸構(gòu)成比例及方式不同，故各種不同的蛋白質(zhì)其含氮量也不同，一般蛋白質(zhì)含氮量為16%，即一 份氮素相當(dāng)于6.25份蛋白質(zhì)，此數(shù)值（6.25）稱為蛋白質(zhì)系數(shù)。微量凱氏定氮法 (1) 原理 微量凱氏定氮法的原理與操作方法，

6、與常量法基本相同，所不同的是樣品質(zhì)量及試劑用量較少，且有一套適于微量測定的定型儀器微量凱氏定氮器。1.100ml凱氏燒瓶。 2.微量凱氏定氮器。 (3) 試劑 20g/L硼酸溶液。400g/L氫氧化鈉。 1g/L甲基紅乙醇溶液與1g/L溴甲酚綠乙醇溶液，臨用時按1：5混合。 mol/L鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液 其他試劑同常量法。 樣品消化：樣品消化步驟同常量法。將消化完全的消化液冷卻后，完全轉(zhuǎn)入100容量瓶中，加蒸餾水至刻度，搖勻。 蒸餾 按圖安裝好微量定氮蒸餾裝置。于水蒸氣發(fā)生瓶內(nèi)裝水至2/3容積處，加甲基橙指示劑數(shù)滴及硫酸數(shù)毫升，以保持水呈酸性，加入數(shù)粒玻璃珠，加熱煮沸水蒸氣發(fā)生瓶內(nèi)的水。在接受瓶內(nèi)加

7、入10ml 40g/L硼酸及2滴混合指示劑，將冷凝管下端插入液面以下。樣品消化稀釋液，由進(jìn)樣漏斗進(jìn)入反應(yīng)室，以少量水沖洗進(jìn)樣漏斗，并流入反應(yīng)室。再從進(jìn)樣口加入400g/L氫氧化鈉10ml使溶液呈強(qiáng)堿性，用少量蒸餾 水洗漏斗數(shù)次，蓋塞 ，進(jìn)行水蒸氣 蒸餾。冷凝管下端 預(yù)先插入盛有10mL4%（或2%）硼酸吸收液,蒸餾至吸收液中所加的混合指示劑變?yōu)榫G色開始記時，繼續(xù)蒸餾10min后，將冷凝管尖端提離液面再蒸餾1min，用蒸餾水沖洗冷凝管尖端后停止蒸餾。 滴定 取下接受瓶，以鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至微紅色為終點。(5) 結(jié)果計算式中W蛋白質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，%； V0滴定空白蒸餾液消耗鹽酸標(biāo)準(zhǔn)液體積，mL； V

8、1滴定樣品蒸餾液消耗鹽酸標(biāo)準(zhǔn)液體積，mL； V2蒸餾時吸取樣品稀釋液體積，mL； C鹽酸標(biāo)準(zhǔn)液的濃度，mol/L； 0.014氮的毫摩爾質(zhì)量，g/mmol； F蛋白質(zhì)系數(shù)； m樣品質(zhì)量，g。注意事項（1）所用試劑應(yīng)用無氨蒸餾水配制。（2）消化過程應(yīng)注意轉(zhuǎn)動凱氏燒瓶，利用冷凝酸液將附在瓶壁上的炭粒沖下，以促進(jìn)消化完全。（3）若樣品含脂肪或糖較多時，應(yīng)注意發(fā)生的大量泡沫少量辛醇或液體石蠟，或硅消泡劑，防止其溢出瓶外，并注意適當(dāng)控制熱源強(qiáng)度。（4）若樣品消化液不易澄清透明，可將凱氏燒瓶冷卻，加入300g/L23ml過氧化氫后再加熱。（5）若取樣量較大，如干試樣超過5g，可按每克試樣5ml的比例增加硫

9、酸用量。（6）消化時間一般約4小時左右即可，消化時間過長會引起氨的損失。一般消化至透明后，繼續(xù)消化30min即可，但當(dāng)含有特別難以氨化的氮化合物的樣品，如含賴氨酸或組氨酸時，消化時間需適當(dāng)延長，因為這兩種氨基酸中的氮在短時間內(nèi)不易消化完全，往往導(dǎo)致總氮量偏低。有機(jī)物如分解完全，分解液呈藍(lán)色或淺綠色。但含鐵量多時，呈較深綠色。 （7）蒸餾過程應(yīng)注意接頭處無松漏現(xiàn)象，蒸餾完畢，先將蒸餾出口離開液面，繼續(xù)蒸餾1min，將附著在尖端的吸收液完全洗入吸收瓶內(nèi)，再將吸收瓶移開，最后關(guān)閉電源，絕不能先關(guān)閉電源，否則吸收液將發(fā)生倒吸。（8）硼酸吸收液的溫度不應(yīng)超過40C，否則氨吸收減弱，造成損失，可置于冷水浴

10、中。（9）混合指示劑在堿性溶液中呈綠色，在中性溶液中呈灰色，在酸性溶液中呈紅色。雙縮脲法（Biuret法）測蛋白質(zhì)含量試劑與器材1. 試劑：（1）標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液：用標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)晶牛血清清蛋白（BSA）或標(biāo)準(zhǔn)酪蛋白，配制成10mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液，可用BSA濃度1mg/ml的A280為 0.66來校正其純度。如有需要，標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)還可預(yù)先用微量凱氏定氮法測定蛋白氮含量，計算出其純度，再根據(jù)其純度，稱量配制成標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液。牛血清清蛋白用H2O 或0.9%NaCl配制，酪蛋白用005N NaOH配制。（2）雙縮脲試劑：稱以克硫酸銅（CuSO45H2O）和克酒石酸鉀鈉（KNaC4H4O64H2O），用500毫升水溶解，在攪拌下加入300毫升10% NaOH溶液，用水稀釋到1升，貯存于塑料瓶中（或內(nèi)壁涂以石蠟的瓶中）。此試劑可長期保存。若貯存瓶中有黑色沉淀出現(xiàn)，則需要重新配制。2. 器材：可見光分光光度計、大試管15支、旋渦混合器等。操作方法1. 標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定：取12支試管分兩組，分別加入0，毫升的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液，用水補(bǔ)足到1毫