甘草酸二銨注射液對(duì)大鼠腎缺血再灌注損傷的保護(hù)作用

1、甘草酸二銨注射液對(duì)大鼠腎缺血/再灌注損傷的保護(hù)作用    【摘要】  目的探討甘草酸二銨（DG）對(duì)大鼠腎缺血/再灌注（ischemia/reperfusion, I/R）的保護(hù)作用。方法采用切除右腎，夾閉左腎動(dòng)脈60 min后恢復(fù)灌注的方法復(fù)制在體大鼠腎I/R損傷的模型，夾閉動(dòng)脈前30 min靜脈注射DG 15 mg/kg或DG 30 mg/kg。檢測(cè)再灌注1 h和再灌注24 h后血清尿素氮（BUN），血肌酐（Scr）以及腫瘤壞死因子-（TNF-）和白介素-1（IL-1）的水平以及再灌注24 h后腎組織丙二醛（MDA）和超氧化物歧化酶（SOD）

2、的含量。結(jié)果DG能顯著降低I/R導(dǎo)致的血清BUN和Scr的升高，減少TNF-和IL-1的產(chǎn)生，提高腎組織SOD活性，減少M(fèi)DA的生成。結(jié)論DG對(duì)腎I/R有明顯的保護(hù)作用，其機(jī)制與DG減少脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，減少細(xì)胞因子TNF-和IL-1水平有關(guān)。 【關(guān)鍵詞】  甘草酸二銨 腎缺血 再灌注損傷 細(xì)胞因子Abstract:ObjectiveTo study the protective effect of diammonium glycyrrhizinate injection（DG）on renal ischemia/reperfusion (I/R) in rats.MethodsA m

3、odel of renal I/R was made by clamping double renal pedical for 60 min and reperfusion for 24 h. The injection of DG (15mg/kg or 30mg/kg) was pretreated before renal ischemia. The leveles of serum urea nitrogen (BUN), serum creatinine (Scr), tumor necrosis factor- (TNF-), interleukin-1 (IL-1) in ser

4、um were detected after reperfusion for 1 h and 24 h respectively, and the content of MDA and SOD in renal tissuses were measured after reperfusion for 24 h.ResultsDG significantly decreased the level of BUN and Scr, decreased the concentration of TNF- and IL-1 in serum. Pretreatment with DG also enh

5、anced the activity of SOD, reduced the concentration of MDA in renal after I/R.ConclusionDG has significant protective effect on renal I/R and markedly improve the renal function. The mechanisms are associated with decrease the lipid peroxidation reaction and reduce the level of TNF- and IL-1.Key wo

6、rds:Diammonium glycyrrhizinate;  Renal ischemia;  Reperfusion injury;  Cell factor    急性腎功能衰竭（acute renal failure, ARF）占臨床住院病人總數(shù)的2%5%，死亡率高達(dá)30%60%，而腎缺血/再灌注（ischemia/reperfusion/, I/R）損傷是導(dǎo)致ARF的重要因素，而且隨著腎移植的廣泛開(kāi)展，腎I/R損傷也是影響腎移植手術(shù)成功的重要因素和移植腎功能恢復(fù)的主要原因1。因此，如何有效防治腎I/R損傷，也是臨床研究的熱

7、點(diǎn)之一。甘草酸二銨（Dammonii Glycyrrhizinatis，DG）為18 -甘草酸的銨鹽制劑，具有很強(qiáng)的抗炎、抗過(guò)敏、保護(hù)膜結(jié)構(gòu)和免疫調(diào)節(jié)作用。臨床上用于病毒性肝炎和肝纖維化的治療并取得了顯著的療效。近來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，DG對(duì)心肌和腦I/R損傷有較好的保護(hù)作用2。但其是否有保護(hù)腎I/R的作用，目前尚未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)采用大鼠在體腎I/R模型探討DG對(duì)腎的保護(hù)作用。1  材料和方法1.1  藥品、試劑及儀器甘草酸二銨注射液為連云港正大天晴制藥有限公司產(chǎn)品，5 mg/ml，批號(hào)200512151；尿素氮（BUN）、血肌酐（Scr）、丙二醛（MDA）和超氧化物歧化酶（SOD）

8、檢測(cè)試劑盒為南京建成生物工程研究所產(chǎn)品；腫瘤壞死因子-（TNF-）和白介素-1（IL-1）酶聯(lián)免疫吸附試劑盒購(gòu)自華美生物技術(shù)公司。其余藥品和試劑均為市售分析純。1.2  實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及模型制備健康雄性Wistar大鼠32只，由湖北省醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，體重（230±15）g，隨機(jī)分為4組，每組8只。假手術(shù)組：大鼠禁食12 h后，以20%烏拉坦1 g/kg腹腔注射麻醉，仰臥位固定。腹正中切口，分離雙側(cè)腎臟但不夾閉，80 min后關(guān)閉腹腔；I/R組：大鼠麻醉分離雙側(cè)腎臟后，切除右側(cè)腎，用無(wú)腎損傷動(dòng)脈夾夾閉左腎動(dòng)脈，60 min后恢復(fù)灌注，然后關(guān)閉腹腔，縫合切口，再灌注2

9、4 h后結(jié)束實(shí)驗(yàn)3；DG1組：腎動(dòng)脈夾閉前30 min靜脈注射DG 3 ml/kg，其余步驟同I/R組；DG2組：腎動(dòng)脈夾閉前30 min靜脈注射DG 6 ml/kg，其余步驟同I/R組。1.3  實(shí)驗(yàn)方法1.3.1  血清BUN，Scr和TNF-及IL-1的測(cè)定大鼠再灌注1 h和再灌注結(jié)束后分別取靜脈血制備血清，BUN，Scr按試劑盒說(shuō)明采用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)，TNF-和IL-1采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）進(jìn)行測(cè)定。1.3.2  腎組織MDA和SOD的測(cè)定再灌注結(jié)束后取腎組織提取勻漿，按試劑盒操作說(shuō)明測(cè)定。1.4  統(tǒng)計(jì)學(xué)分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)±

10、s表示，以SPSS 11.0 for windows軟件包作統(tǒng)計(jì)學(xué)分析并制作圖表，組間、組內(nèi)差異比較采用方差分析，P<0.05為顯著性標(biāo)準(zhǔn)。 2  結(jié)果2.1  DG對(duì)大鼠腎I/R后血清BUN，Scr的影響再灌注1 h和再灌注24 h后I/R組血清BUN和Scr較假手術(shù)組明顯增加（P均<0.01），再灌注后1 h靜脈注射DG的治療組血清BUN和Scr均顯著低于I/R組（BUN：P<0.05或P <0.01，Scr：P<0.01），再灌注24 h后靜脈注射DG的兩組BUN和Scr含量也明顯低于I/R組（P<0.01）。結(jié)果見(jiàn)表1。表1

11、60; DG對(duì)大鼠腎I/R后1 h及24 h    血清BUN和Scr的影響（略）與Sham組比較，P<0.01；與I/R組比較，P<0.05,P<0.01；n=82.2   DG對(duì)大鼠腎I/R后血清TNF-及IL-1的影響再灌注1 h后I/R組血清TNF-和IL-1較假手術(shù)組明顯增加（P均<0.01），靜脈注射DG的治療組血清TNF-和IL-1較I/R組顯著降低（TNF-：P<0.05或P<0.01，IL-1：P<0.05或P<0.05），再灌注24 h后I/R組TNF-和IL-1的含量較再灌注

12、1 h明顯下降，但仍明顯高于假手術(shù)組（P<0.01），DG治療組TNF-水平較I/R組顯著下降（P<0.05），但DG 3 ml/kg治療組IL-1含量較I/R組沒(méi)有區(qū)別，而DG 6 ml/kg治療組和假手術(shù)組一樣沒(méi)有檢測(cè)出IL-1。結(jié)果見(jiàn)表2。2.3  DG對(duì)大鼠腎I/R后組織MDA和SOD的影響再灌注24 h I/R組腎組織中MDA含量較假手術(shù)組明顯增多而SOD活性顯著下降（P<0.01）；給予DG的2個(gè)實(shí)驗(yàn)組較I/R組能明顯提高SOD的活性（P<0.05或P<0.01），而且DG 6 ml/kg組較I/R組還能明顯減少組織MDA含量（P<0.

13、05），見(jiàn)表3。表2  DG對(duì)大鼠腎I/R后1 h及24 h血清TNF-和IL-1的影響（略）與Sham組比較，P<0.01；與I/R組比較，P<0.05,P<0.01；n=8表3  DG對(duì)大鼠腎I/R后24 h腎組織MDA和SOD的影響（略）與Sham組比較，P<0.01；與I/R組比較，P<0.05,P<0.01；n=83  討論    離體和在體實(shí)驗(yàn)均已證實(shí)氧自由基（oxygen free radical, OFR）大量產(chǎn)生及清除障礙是導(dǎo)致再灌注腎臟損傷的重要機(jī)制之一4。在實(shí)驗(yàn)中觀察到，腎再灌

14、注期SOD活性明顯下降，提示內(nèi)源性O(shè)FR的清除體系受到損害；組織MDA的含量大量增加。腎I/R后還導(dǎo)致腎功能的顯著下降，血清BUN和Scr明顯升高，表明再灌注時(shí)OFR清除障礙已造成膜脂質(zhì)過(guò)氧化，損害了腎臟的結(jié)構(gòu)和功能，而預(yù)先給予DG能顯著提高SOD活性，減少M(fèi)DA的生成量；減輕再灌注損傷導(dǎo)致的腎功能下降。由此認(rèn)為DG能減輕I/R腎功能損害，對(duì)腎臟I/R有明顯的保護(hù)作用，其機(jī)制之一可能與其提高抗氧化酶活性、減少脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)及保護(hù)細(xì)胞的結(jié)構(gòu)完整性有關(guān)。    TNF-和IL-1是調(diào)節(jié)炎癥的主要細(xì)胞因子，研究認(rèn)為它們?cè)谀II/R的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用。IL-1可

15、導(dǎo)致中性粒細(xì)胞向腎組織浸潤(rùn)，加劇腎組織損傷。而TNF-有直接的細(xì)胞毒作用，而且能促進(jìn)IL-1等細(xì)胞因子的產(chǎn)生，誘導(dǎo)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和聚集，TNF-還能上調(diào)血管粘附分子-1的表達(dá)，促進(jìn)氧自由基生成，上述因素均加重腎組織的炎癥反應(yīng)，加劇組織損傷5。實(shí)驗(yàn)表明DG能顯著減少腎I/R后TNF-和IL-1，由此提示DG能減少I/R導(dǎo)致的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和聚集，減少腎組織的炎癥反應(yīng)，這與DG抗病毒性肝炎作用機(jī)理一致。    王會(huì)玲等6報(bào)道DG對(duì)馬兜鈴酸（aristolochic acid, AA）致培養(yǎng)腎小管上皮細(xì)胞有明顯的保護(hù)作用，可改善AA對(duì)上皮細(xì)胞增殖的抑制作用，減輕AA對(duì)細(xì)胞的

16、毒性作用。由于近來(lái)研究還表明DG對(duì)心腦缺血性疾病有明顯的保護(hù)作用，因此將DG應(yīng)用于腎I/R損傷的防治，為開(kāi)發(fā)DG新的臨床適應(yīng)癥提供了理論依據(jù)?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】  1 Jo SK, Sung SA, Cho WY, et al. Macrophages contribute to the initiation of ischaemic acute renal failure in ratsJ.Nephrol Dial Transplant. 2006,21(5): 1231.2 蔣建剛，吳基良，陳金和.甘草酸二銨對(duì)大鼠心肌缺血再灌注損傷在心室功能的影響J.醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)， 2001，20(5): 282.3 Matsuyama M, Hayama T, Funao K, et al. Treatment with edaravone improves the survival rate in renal warm ischemia-reperfusion injury using rat modelJ.Transplant Proc,2006，38(7): 2199.4 Sener G, Sehirli O, Velioglu-Ogunc A, Cetinel S, et