甘草酸二銨注射液對大鼠腎缺血再灌注損傷的保護作用

1、甘草酸二銨注射液對大鼠腎缺血/再灌注損傷的保護作用    【摘要】  目的探討甘草酸二銨（DG）對大鼠腎缺血/再灌注（ischemia/reperfusion, I/R）的保護作用。方法采用切除右腎，夾閉左腎動脈60 min后恢復灌注的方法復制在體大鼠腎I/R損傷的模型，夾閉動脈前30 min靜脈注射DG 15 mg/kg或DG 30 mg/kg。檢測再灌注1 h和再灌注24 h后血清尿素氮（BUN），血肌酐（Scr）以及腫瘤壞死因子-（TNF-）和白介素-1（IL-1）的水平以及再灌注24 h后腎組織丙二醛（MDA）和超氧化物歧化酶（SOD）

2、的含量。結果DG能顯著降低I/R導致的血清BUN和Scr的升高，減少TNF-和IL-1的產生，提高腎組織SOD活性，減少MDA的生成。結論DG對腎I/R有明顯的保護作用，其機制與DG減少脂質過氧化反應，減少細胞因子TNF-和IL-1水平有關。 【關鍵詞】  甘草酸二銨 腎缺血 再灌注損傷 細胞因子Abstract:ObjectiveTo study the protective effect of diammonium glycyrrhizinate injection（DG）on renal ischemia/reperfusion (I/R) in rats.MethodsA m

3、odel of renal I/R was made by clamping double renal pedical for 60 min and reperfusion for 24 h. The injection of DG (15mg/kg or 30mg/kg) was pretreated before renal ischemia. The leveles of serum urea nitrogen (BUN), serum creatinine (Scr), tumor necrosis factor- (TNF-), interleukin-1 (IL-1) in ser

4、um were detected after reperfusion for 1 h and 24 h respectively, and the content of MDA and SOD in renal tissuses were measured after reperfusion for 24 h.ResultsDG significantly decreased the level of BUN and Scr, decreased the concentration of TNF- and IL-1 in serum. Pretreatment with DG also enh

5、anced the activity of SOD, reduced the concentration of MDA in renal after I/R.ConclusionDG has significant protective effect on renal I/R and markedly improve the renal function. The mechanisms are associated with decrease the lipid peroxidation reaction and reduce the level of TNF- and IL-1.Key wo

6、rds:Diammonium glycyrrhizinate;  Renal ischemia;  Reperfusion injury;  Cell factor    急性腎功能衰竭（acute renal failure, ARF）占臨床住院病人總數的2%5%，死亡率高達30%60%，而腎缺血/再灌注（ischemia/reperfusion/, I/R）損傷是導致ARF的重要因素，而且隨著腎移植的廣泛開展，腎I/R損傷也是影響腎移植手術成功的重要因素和移植腎功能恢復的主要原因1。因此，如何有效防治腎I/R損傷，也是臨床研究的熱

7、點之一。甘草酸二銨（Dammonii Glycyrrhizinatis，DG）為18 -甘草酸的銨鹽制劑，具有很強的抗炎、抗過敏、保護膜結構和免疫調節(jié)作用。臨床上用于病毒性肝炎和肝纖維化的治療并取得了顯著的療效。近來研究發(fā)現(xiàn)，DG對心肌和腦I/R損傷有較好的保護作用2。但其是否有保護腎I/R的作用，目前尚未見報道。本實驗采用大鼠在體腎I/R模型探討DG對腎的保護作用。1  材料和方法1.1  藥品、試劑及儀器甘草酸二銨注射液為連云港正大天晴制藥有限公司產品，5 mg/ml，批號200512151；尿素氮（BUN）、血肌酐（Scr）、丙二醛（MDA）和超氧化物歧化酶（SOD）

8、檢測試劑盒為南京建成生物工程研究所產品；腫瘤壞死因子-（TNF-）和白介素-1（IL-1）酶聯(lián)免疫吸附試劑盒購自華美生物技術公司。其余藥品和試劑均為市售分析純。1.2  實驗動物分組及模型制備健康雄性Wistar大鼠32只，由湖北省醫(yī)學科學院實驗動物中心提供，體重（230±15）g，隨機分為4組，每組8只。假手術組：大鼠禁食12 h后，以20%烏拉坦1 g/kg腹腔注射麻醉，仰臥位固定。腹正中切口，分離雙側腎臟但不夾閉，80 min后關閉腹腔；I/R組：大鼠麻醉分離雙側腎臟后，切除右側腎，用無腎損傷動脈夾夾閉左腎動脈，60 min后恢復灌注，然后關閉腹腔，縫合切口，再灌注2

9、4 h后結束實驗3；DG1組：腎動脈夾閉前30 min靜脈注射DG 3 ml/kg，其余步驟同I/R組；DG2組：腎動脈夾閉前30 min靜脈注射DG 6 ml/kg，其余步驟同I/R組。1.3  實驗方法1.3.1  血清BUN，Scr和TNF-及IL-1的測定大鼠再灌注1 h和再灌注結束后分別取靜脈血制備血清，BUN，Scr按試劑盒說明采用全自動生化分析儀檢測，TNF-和IL-1采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）進行測定。1.3.2  腎組織MDA和SOD的測定再灌注結束后取腎組織提取勻漿，按試劑盒操作說明測定。1.4  統(tǒng)計學分析實驗數據±

10、s表示，以SPSS 11.0 for windows軟件包作統(tǒng)計學分析并制作圖表，組間、組內差異比較采用方差分析，P<0.05為顯著性標準。 2  結果2.1  DG對大鼠腎I/R后血清BUN，Scr的影響再灌注1 h和再灌注24 h后I/R組血清BUN和Scr較假手術組明顯增加（P均<0.01），再灌注后1 h靜脈注射DG的治療組血清BUN和Scr均顯著低于I/R組（BUN：P<0.05或P <0.01，Scr：P<0.01），再灌注24 h后靜脈注射DG的兩組BUN和Scr含量也明顯低于I/R組（P<0.01）。結果見表1。表1

11、60; DG對大鼠腎I/R后1 h及24 h    血清BUN和Scr的影響（略）與Sham組比較，P<0.01；與I/R組比較，P<0.05,P<0.01；n=82.2   DG對大鼠腎I/R后血清TNF-及IL-1的影響再灌注1 h后I/R組血清TNF-和IL-1較假手術組明顯增加（P均<0.01），靜脈注射DG的治療組血清TNF-和IL-1較I/R組顯著降低（TNF-：P<0.05或P<0.01，IL-1：P<0.05或P<0.05），再灌注24 h后I/R組TNF-和IL-1的含量較再灌注

12、1 h明顯下降，但仍明顯高于假手術組（P<0.01），DG治療組TNF-水平較I/R組顯著下降（P<0.05），但DG 3 ml/kg治療組IL-1含量較I/R組沒有區(qū)別，而DG 6 ml/kg治療組和假手術組一樣沒有檢測出IL-1。結果見表2。2.3  DG對大鼠腎I/R后組織MDA和SOD的影響再灌注24 h I/R組腎組織中MDA含量較假手術組明顯增多而SOD活性顯著下降（P<0.01）；給予DG的2個實驗組較I/R組能明顯提高SOD的活性（P<0.05或P<0.01），而且DG 6 ml/kg組較I/R組還能明顯減少組織MDA含量（P<0.

13、05），見表3。表2  DG對大鼠腎I/R后1 h及24 h血清TNF-和IL-1的影響（略）與Sham組比較，P<0.01；與I/R組比較，P<0.05,P<0.01；n=8表3  DG對大鼠腎I/R后24 h腎組織MDA和SOD的影響（略）與Sham組比較，P<0.01；與I/R組比較，P<0.05,P<0.01；n=83  討論    離體和在體實驗均已證實氧自由基（oxygen free radical, OFR）大量產生及清除障礙是導致再灌注腎臟損傷的重要機制之一4。在實驗中觀察到，腎再灌

14、注期SOD活性明顯下降，提示內源性OFR的清除體系受到損害；組織MDA的含量大量增加。腎I/R后還導致腎功能的顯著下降，血清BUN和Scr明顯升高，表明再灌注時OFR清除障礙已造成膜脂質過氧化，損害了腎臟的結構和功能，而預先給予DG能顯著提高SOD活性，減少MDA的生成量；減輕再灌注損傷導致的腎功能下降。由此認為DG能減輕I/R腎功能損害，對腎臟I/R有明顯的保護作用，其機制之一可能與其提高抗氧化酶活性、減少脂質過氧化反應及保護細胞的結構完整性有關。    TNF-和IL-1是調節(jié)炎癥的主要細胞因子，研究認為它們在腎I/R的發(fā)生和發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。IL-1可

15、導致中性粒細胞向腎組織浸潤，加劇腎組織損傷。而TNF-有直接的細胞毒作用，而且能促進IL-1等細胞因子的產生，誘導炎性細胞浸潤和聚集，TNF-還能上調血管粘附分子-1的表達，促進氧自由基生成，上述因素均加重腎組織的炎癥反應，加劇組織損傷5。實驗表明DG能顯著減少腎I/R后TNF-和IL-1，由此提示DG能減少I/R導致的炎性細胞浸潤和聚集，減少腎組織的炎癥反應，這與DG抗病毒性肝炎作用機理一致。    王會玲等6報道DG對馬兜鈴酸（aristolochic acid, AA）致培養(yǎng)腎小管上皮細胞有明顯的保護作用，可改善AA對上皮細胞增殖的抑制作用，減輕AA對細胞的

16、毒性作用。由于近來研究還表明DG對心腦缺血性疾病有明顯的保護作用，因此將DG應用于腎I/R損傷的防治，為開發(fā)DG新的臨床適應癥提供了理論依據?！緟⒖嘉墨I】  1 Jo SK, Sung SA, Cho WY, et al. Macrophages contribute to the initiation of ischaemic acute renal failure in ratsJ.Nephrol Dial Transplant. 2006,21(5): 1231.2 蔣建剛，吳基良，陳金和.甘草酸二銨對大鼠心肌缺血再灌注損傷在心室功能的影響J.醫(yī)藥導報， 2001，20(5): 282.3 Matsuyama M, Hayama T, Funao K, et al. Treatment with edaravone improves the survival rate in renal warm ischemia-reperfusion injury using rat modelJ.Transplant Proc,2006，38(7): 2199.4 Sener G, Sehirli O, Velioglu-Ogunc A, Cetinel S, et