鑭對月季鎘脅迫緩解效應的超弱發(fā)光研究

1、鑭對月季鎘脅迫緩解效應的超弱發(fā)光研究周文智（德州學院生物系，山東德州 253023）摘要： 鎘(Cd)是生物毒性最強的重金屬之一，土壤中過量的Cd易被植物吸收和積累，影響植物的生長、細胞分裂及代謝活動，造成農(nóng)作物產(chǎn)量和品質(zhì)下降。一定劑量的鑭可以緩解鎘對植物的毒害作用，使物的各項生理指標趨向于正常。本實驗用鎘和鑭同時處理月季葉片，然后測定葉片的自發(fā)光和延遲發(fā)光的強度及SOD活性和MDA含量，初步研究了鑭對月季鎘脅迫的緩解作用的生理機制。關鍵詞：超弱發(fā)光； 鑭； 鎘； 月季1 引言 鎘對植物的脅迫作用鎘(Cd)是生物毒性最強的重金屬之一。近年來，由于工業(yè)“三廢”的排放，以及不合理的農(nóng)業(yè)管理措施，導

2、致土壤Cd污染日益嚴重。土壤中過量的Cd易被植物吸收和積累，影響植物的生長、細胞分裂及代謝活動，造成農(nóng)作物產(chǎn)量和品質(zhì)下降1。Cd對植物有較強的毒性。Cd在植物組織中含量達到1 mg/kg時，就對某些植物產(chǎn)生毒害，使植物表現(xiàn)出葉色減褪、植物矮化、物候期延遲的癥狀，導致植物生物產(chǎn)量下降，甚至死亡10。例如，Cd脅迫下小麥種子萌發(fā)、芽和根的伸長都受到抑制，生物量顯著降低，株高分蘗減少，幼苗生長受到影響5。大麥受Cd污染后，種子萌發(fā)率和根生長速率下降，其毒害效應隨處理濃度增大和時間延長而加劇。Cd影響植物的生長可能是由于Cd抑制細胞的分裂。Cd能導致植物細胞分裂出現(xiàn)障礙或不正常分裂，使細胞分裂周期延長

3、，染色體斷裂、畸變、粘連和液化6,7。用1.0mg.L-1 Cd處理蠶豆 能產(chǎn)生顯著的染色體畸變效應3 。此外,Cd能抑制DNA和RNA合成酶的活性4。Cd還影響植物體基因組模板的穩(wěn)定性而使DNA合成受阻6。而低濃度的Cd可能會促進細胞分裂，刺激RNA和蛋白質(zhì)合成酶的活性進而促進植物生長3。1.1.1 Cd還對植物細胞器有整體性的毒害作用王逸群等13以不同濃度的Cd 處理水稻，對其葉肉細胞進行透射電子顯微鏡觀察，發(fā)現(xiàn)隨著Cd 濃度的提高，葉肉細胞中細胞核、葉綠體、線粒體受毒害逐漸加重，表現(xiàn)為葉綠體被膜受損，類囊體遭到破壞，細胞核核膜破裂，核仁消失，線粒體被膜結(jié)構受損，內(nèi)嵴逐漸解體。Cd對葉綠體

4、的破壞可能是由于Cd沉積在類囊體上，并與膜上蛋白體結(jié)合進而破壞葉綠體酶系統(tǒng)和阻礙葉綠體合成；對線粒體的破壞是由于Cd改變了線粒體膜的離子平衡，使鉀離子從內(nèi)腔滲透到外腔，并抑制線粒體膜上ATP酶的活性所致8引。Cd還影響細胞核膜結(jié)構的穩(wěn)定性，高濃度的Cd使核內(nèi)腔擴大、核膜皺折凹陷、核出現(xiàn)空泡和多個小核仁8。Cd對細胞器的影響主要是毒害細胞的膜系統(tǒng)，使其透性增加11。研究表明，植物細胞膜透性與Cd濃度呈顯著正相關，即Cd濃度越大，對細胞膜的傷害越大11。其機理可能是Cd直接與膜蛋白的sH結(jié)合或與磷酸乙醇胺單分子層上的磷脂酰絲氨酸反應25。1.1.2 鎘影響植物的光合作用Cd對葉綠素的合成和光合作用

5、均有抑制作用，隨著cd濃度增大，青菜和番茄葉綠素含量均減少，其中青菜葉綠素ab值降低11，而番茄的ab值增大21。Van Assehe等24認為，導致葉綠素含量下降的原因是由于cd抑制原葉綠素酸酯還原酶活性，影響了氨基-酮戊二酸的合成。而Stobart等22認為，葉綠素含量降低與合成葉綠素所需的酶受重金屬破壞有關。此外，Cd還破壞植物的光合系統(tǒng)。慈敦偉等2研究發(fā)現(xiàn)，在Cd毒害下小麥葉片光系統(tǒng)I明顯受損，氣體交換參數(shù)和葉綠素熒光參數(shù)隨著Cd濃度的升高而顯著下降。楊丹慧等16的研究結(jié)果表明，Cd對光系統(tǒng)I和光系統(tǒng)均有影響，但對后者的影響更加顯著。其機理是Cd使葉綠體類囊體膜中光系統(tǒng)捕光葉綠素蛋白質(zhì)

6、復合物LHCH的部分寡聚體解聚成單體，且總量減少20。但也有報道14指出，Cd對光系統(tǒng)的電子傳遞有抑制作用，而對光系統(tǒng)I并無影響。 鎘影響植物的酶活性Cd影響超氧化物歧化酶(S0D)、過氧化物酶(POD)和過氧化氫酶(CAT)的活性。這3種酶都是植物清除體內(nèi)過量的自由基，適應逆境脅迫的重要酶類，被統(tǒng)稱為植物保護酶系統(tǒng)17。此外，Cd還抑制固氮酶、根系脫氫酶、淀粉酶、脫氧核酸酶、核糖核酸酶、硝酸還原酶、蛋白酶、多酚氧化酶、抗壞血酸過氧化酶、乳酸脫氫酶等多種酶的活性17。Cd可能是直接取代這些酶活性中心的金屬元素Ca、Fe、zn或與酶的半胱氨酸殘基結(jié)合，從而抑制這些酶的活性。Cd通過影響這些酶的活

7、性，進而影響植物的氮代謝、呼吸作用、碳水化合物代謝和核酸代謝等多種代謝活動。1.2 鑭對鎘脅迫的緩解作用實驗證據(jù)表明一定劑量(10 mg/ kg)La2+處理植物可以緩解鎘的脅迫效應，使各指標均不同程度趨向正常15。鄭海雷、周青等18,19研究表明,一定劑量的La 能促進根系生長發(fā)育,優(yōu)化苗期素質(zhì),誘導小麥的抗逆性,繼而緩解Cd 污染對株高、主根長、葉綠素含量、脫氫酶活性、MDA 含量、POD、SOD 活性與Cd 含量的影響。La 有助于根系生長的原因是促進IAA、GA 向生長旺盛的部位運輸,刺激根細胞增殖,在提高光合作用同時,加速光合產(chǎn)物向地下器官運輸,為根系生長提供物質(zhì)保障。La 減緩葉綠

8、素降解的機理可能是La 阻滯Cd 進入植物體內(nèi),從而減少葉綠體表面Cd 的富集量及由此引發(fā)的傷害,代替Mg 形成La卟啉雙層夾心結(jié)構18 ,在提高光合效率的同時,增強葉綠素結(jié)構的穩(wěn)定性,補償Ca 離子的流失對葉綠素合成的抑制作用,從而減緩了葉綠素的降解。SOD、POD 是生物體內(nèi)酶促防御系統(tǒng)中非常重要的保護酶,在這個系統(tǒng)中,SOD 處于第一道防線,它能夠催化新陳代謝中產(chǎn)生的超氧自由基(O2-) 歧化為O2 和H2O ,從而防止(O2-) 在體內(nèi)的積累和阻礙。在Cd 脅迫下自由基的增多使SOD、POD 活性增強,對生物膜起到保護作用。在添加La 的處理組中,La 的防護效應使得自由基減少,因而對

9、POD、SOD活性需求相對減少。有文獻表明鎘脅會導致細胞迫葉亞新等研究表明15表明,加La 可降低Cd 污染下導致的小麥體內(nèi)脯氨酸含量的積累,充分體現(xiàn)了La 對重金屬污染下小麥的防護效應。加La 還可以降低Cd污染時小麥體內(nèi)丙二醛含量的積累。1.3 植物的超弱發(fā)光(UWL)隨著光子探測技術的發(fā)展,研究人員發(fā)現(xiàn)從細菌到人都有一種極微弱的光輻射,稱之為生物的超弱發(fā)光(UWL)。這種發(fā)光光譜的波長范圍為180nm800nm ,光強非常弱,在10104 Photons/( s ·cm3 ) ,量子效率為10-1410-9 。有機體內(nèi)的這種普遍發(fā)光現(xiàn)象與機體的氧化代謝、脫氧化作用、光合作用、細

10、胞的分裂和死亡以及生長調(diào)節(jié)作用都有關系。早在1923 年,前蘇聯(lián)科學家G.Gur-witsh 在有名的“洋蔥實驗”中就已發(fā)現(xiàn)了超弱發(fā)光(UWL)現(xiàn)象23 。生物體在進行生理生化反應的過程中,處于基態(tài)的原子或原子團獲得能量,其電子從基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài),處于激發(fā)態(tài)的原子或原子團不穩(wěn)定,將釋放多余的能量回到基態(tài),能量的釋放伴隨有熱、電子和光子的發(fā)射等,其中能量以光子形式釋放的過程稱為生物的超弱發(fā)光(UWL),實質(zhì)上是一種化學發(fā)光。關于生物超弱發(fā)光(UWL)機制的理論研究很多,可初步分為物理和化學兩大類?；瘜W方面主要有“代謝發(fā)光”機制,而物理方面則以“相干輻射”機制12為主?！按x發(fā)光”機制以光生物化學

11、為基礎,把生物超弱發(fā)光(UWL)與有機體內(nèi)的代謝過程聯(lián)系起來,認為這種發(fā)光主要來源于機體內(nèi)的氧化還原代謝反應。有機體內(nèi)幾種主要物質(zhì)如蛋白質(zhì)、核酸、糖和脂類等,它們的化學發(fā)光能力是不同的。蛋白質(zhì)、氨基酸、核苷酸及它們的水溶液在生理溫度內(nèi)(055) 及中性pH下,自身氧化進行的非常慢,沒有化學發(fā)光。類脂物質(zhì)(包括脂肪、脂肪酸等) 的自氧化反應在有氧存在時從-5 起就能自動進行,并伴隨著化學發(fā)光現(xiàn)象。溫度每提高10 ,發(fā)光強度就增加2倍。細胞組織提取液的超弱發(fā)光(UWL)主要是由類脂決定的。類脂的生物化學發(fā)光是自由基氧化的結(jié)果。類脂的化學發(fā)光與碳氫化合物的發(fā)光機理類似。其過程為,經(jīng)引導自由基引發(fā)產(chǎn)生

12、脂自由基,然后脂自由基反應發(fā)展并進行擴大,產(chǎn)生更多的脂自由基,當兩個脂自由基復合時能產(chǎn)生激發(fā)態(tài)產(chǎn)物。添加各種活化劑可以提高化學反應時的發(fā)光強度,同樣,阻氧化劑可以截獲原子團并轉(zhuǎn)化為低活性基團,中止鏈式氧化反應。生物體內(nèi)天然阻氧化劑和氧化脂類數(shù)量之間應保持平衡,這種平衡的破壞會引起細胞功能的破壞。體內(nèi)阻氧化劑不能及時補充,氧化即進入不穩(wěn)定狀態(tài)并開始自由加速,出現(xiàn)生物超弱發(fā)光(UWL)的“閃光現(xiàn)象” 9。但是,這兩種機制也只能解釋部分超弱發(fā)光(UWL)現(xiàn)象,生物超弱發(fā)光(UWL)產(chǎn)生機制非常復雜,目前人們對它的認識還具有一定的局限性,仍需要在理論和實驗方面進行深入研究。 超弱發(fā)光(UWL)的應用超

13、弱發(fā)光(UWL)有著廣泛而明確的應用前景。超弱發(fā)光(UWL)作為生物體的一種固有的功能,必然與各種生命過程相聯(lián)系,通過對超弱發(fā)光(UWL)的測量和分析就可以深入細致地了解這些生命過程。在此基礎上還可以利用各種手段(物理的、化學的、醫(yī)學的等) 人為地調(diào)節(jié)超弱發(fā)光(UWL) ,以控制生命過程。超弱發(fā)光 作為一種極其靈敏的指示器,已開始用于醫(yī)學、藥理學、農(nóng)業(yè)、環(huán)境科學及食品學等。例如,已有研究表明,腫瘤患者與健康人相比,其血液以及許多器官與組織的超弱發(fā)光(UWL)強度升高。另外,研究還發(fā)現(xiàn),種子與幼苗的超弱發(fā)光(UWL)在一定程度上反映了作物的抗寒、抗旱與抗鹽堿的能力,顯示了生物超弱發(fā)光(UWL)在

14、農(nóng)業(yè)上的選種育種等方面的重要應用。通過檢測生物超弱發(fā)光(UWL)特性可直接獲得環(huán)境污染狀況的信息,此技術的最大特點是可以反映污染對生理代謝的影響程度,實時監(jiān)測環(huán)境污染對人類、動物、農(nóng)作物的影響,從而為環(huán)境監(jiān)測提供一種方便、簡潔的手段。1.5 本實驗的目的和意義月季作為一種觀賞植物在許多地區(qū)廣泛種植，但鎘對月季的脅迫機制及規(guī)律的報道尚不多見，鑭對月季鎘脅迫緩解效應的超弱發(fā)光研究還未見報道。本實驗研究鎘脅迫對月季生理的影響規(guī)律并探討超弱發(fā)光的機理，對于更深刻的認識鎘脅迫的機制和鑭對鎘脅迫緩解效應的生理機制具有一定的參考價值。 2 材料與方法2.1 材料及試劑 月季（Rosa chinensis ）

15、采自德州學院校園，取發(fā)育良好、生長一致的葉片作為實驗材料。Hoagland液體培養(yǎng)基：成分為硝酸鈣-1， 硝酸鉀-1，磷酸二氫鉀-1 ，硫酸鎂-1，酒石酸鐵-1；CdCl2溶液：-1；LaCl3溶液:分別配制40-1，60-1，80-1的LaCl3溶液。實驗儀器MT-3091型熒光燈；生物超微弱發(fā)光測量儀：采用由中國科學院生物物理所研制生物超微弱發(fā)光測量儀（BPCL4）進行測量。2.3 方法 處理方法把月季離體葉片先用蒸餾水沖洗干凈，吸干，立即放入含有1/10×Hoagland液體培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，上表皮朝上懸浮培養(yǎng)，葉片盡量懸于液體表面，分別在培養(yǎng)24小時后測其自發(fā)光和延遲發(fā)光的強

16、度以及其他生理指標。將采集的樣品分為4組：1組：空白對照，只加入1/10×Hoagland液體培養(yǎng)基；2組：CdCl2對照，將CdCl2溶液加入到1/10×Hoagland液體培養(yǎng)基中，使CdCl2溶液的終濃度為50-1；3組：LaCl3緩解CdCl2脅迫效應，在第二組的基礎上分別加入不同濃度的LaCl3溶液，20-1，40-1，60-1，80-1；2.3.2 超弱發(fā)光(UWL)的測定 超弱發(fā)光(UWL)的測定在溫度維持在18的暗室中進行，儀器采用中國科學院生物物理所生產(chǎn)的BPCL超弱發(fā)光(UWL)分析儀。實驗前將空調(diào)開1小時保證室溫維持在18，儀器預熱1小時，使本底穩(wěn)定。

17、儀器高壓設為-1000V，光子記數(shù)時間間隔設為1.00s。.1 自發(fā)光的測定選取培養(yǎng)的月季葉片，先用去離子水擦洗干凈，再用濾紙吸干葉片表面的水分，然后置于樣品室中暗適應200s，最后開始測量其自身發(fā)光強度。每次測量100s，紀錄下光子總數(shù)，連續(xù)測量3次。每次測量前先測一次本底，用樣品測量的平均值減本底的平均值作為自身發(fā)光強度的測量值。.2 延遲發(fā)光的測定把上述葉片放在日光燈下，葉片距離日光燈25cm，照5分鐘后，迅速放入樣品室，立刻開始測定葉片的發(fā)光強度隨時間的衰減，測量時間200s，記錄下延遲發(fā)光曲線。連續(xù)測量3次。每次測量前先測一次本底，用樣品測量的平均值減本底的平均值作為延遲發(fā)光強度的測

18、量值。2.3.3 酶活力的測定粗酶液的制備：稱鮮葉3克，加入約15mL酶提取液 以50mmol.L-1.L-1 EDTA、質(zhì)量濃度為0.3% Triton X-100和質(zhì)量濃度為4%聚乙烯聚吡咯烷酮(PVPP)，冰浴充分研磨，冷凍離心(14000r.min-1,20min )，取上清液冷藏備用。2.3.3.1 超氧化物歧化酶(SOD)活性測定.L-1 L-甲硫氨酸54mL中分別加入3mol.L-1.L-1NBT、50umol.L-1核黃素溶液各2ml)和粗酶提取液0.05mL，混合后放在透明試管架上，在光照培養(yǎng)箱內(nèi)照光(8000Lx)，照光l0min后立即避光，迅速測定A560值，以不加酶液的

19、照光管為對照，計算反應被抑制的百分比，以能抑制NBT光化學反應的50%為一個酶單位。SOD總活性=（Ack-AE）V/Ack××W×VtAck：對照管吸光度 AE：測定管吸光度V：提取液總體積Vt：測定時體積2.3.3.2 丙二醛含量的測定提取方法與粗酶液提取方法相同。取3mL粗酶液和3mL0.6%硫代巴比妥酸（先用NaOH溶解），混勻后于沸水浴上反應15min，迅速冷卻后再離心10min（4000r.min-1），取上清液測定A532, A600,A450，計算公式:MDA (umol.L-1) =532-4503 結(jié)果與分析3.1 自發(fā)光的測量結(jié)果由于整個自發(fā)

20、光的測定是在避光的情況下測定，因此光合作用對植物自發(fā)光的影響可以忽略不計，發(fā)光強度主要是體現(xiàn)細胞自身的生長狀態(tài)，測量結(jié)果如下：圖1 葉片自發(fā)光的漲落曲線C1為空白對照，C2為CdCl2對照，L1為用40-1的LaCl3緩解CdCl2脅迫效應圖2 L2為用60-1的LaCl3緩解CdCl2脅迫效應圖3 L3為用80mg.L-1的LaCl3緩解CdCl2脅迫效應圖4 葉片自發(fā)光的漲落曲線由上述四圖可以看出葉片的自身發(fā)光曲線存在明顯的漲落現(xiàn)象，可能是因為葉片內(nèi)部的代謝反應存在漲落或者是代謝的各部分之間的相互作用不同從而產(chǎn)生不同的光子信號，用來調(diào)節(jié)葉片整體的代謝活動。通過比較各曲線的峰值可以看出用鎘處

21、理后自發(fā)光的強度要微高于空白對照，而加入鑭后自發(fā)光的強度與單獨用鎘處理的自發(fā)光的強度相差不大。說明自發(fā)光漲落曲線對于檢測鎘脅迫以及鑭緩解鎘脅迫的效果并不理想。3.2 延遲發(fā)光的測量結(jié)果葉片延遲發(fā)光的衰減曲線：圖 5-a 圖 5-b圖 5-c圖 5-d圖 5-e延遲發(fā)光大都持續(xù) 50 秒左右，在 20s 左右出現(xiàn)折變衰減變慢，50s后的發(fā)光強度逐漸趨向于自發(fā)光，因此我們只取前100s的數(shù)據(jù)。以上五圖顯示不同條件處理的月季葉片無論是延遲發(fā)光衰減速度還是延遲發(fā)光強度都有差別，由圖5-a可知C2延遲發(fā)光強度在前25s內(nèi)要明顯高于C1，而衰減速度要小于C1，表明鎘對月季葉片產(chǎn)生了脅迫。綜合圖5-b5-d

22、可知延遲發(fā)光的強度大小為：C2>L3>L1> L2>C1;表明一定濃度的鑭對鎘脅迫有緩解作用，并且不同的鑭濃度下對鎘脅迫的緩解程度不同。由圖5-b可知表明60mg.L-1的LaCl3緩解CdCl2脅迫效應最為顯著，L2對鎘脅迫的緩解作用要高于L1，而L1的延遲發(fā)光強度接近于C2，說明隨著鑭濃度的升高，鑭對鎘的脅迫緩解程度也逐漸增大，但最大濃度L3對鎘脅迫的緩解作用卻高于L2，可能由于培養(yǎng)液中過高的鑭離子濃度對月季葉片產(chǎn)生了鹽脅迫造成的。3.3 酶活性測定結(jié)果3 SOD的活力圖6 葉片SOD酶活性柱狀圖圖6表明：鎘脅迫使植物體的SOD酶活性明顯降低，用鑭緩解鎘脅迫的處理中

23、并沒有發(fā)現(xiàn)SOD的酶活力明顯升高，并且用不同濃度的鑭緩解，SOD酶活力也沒有顯著差異。說明短期內(nèi)鑭對SOD酶活力影響并不顯著，這一點不同于葉亞新15的研究。3 MDA的含量圖7 葉片MDA含量柱狀圖MDA是植物器官在逆境條件下或衰老時，脂膜發(fā)生過氧化作用，MDA是其產(chǎn)物之一，通常將其作為脂質(zhì)過氧化指標用于表示細胞膜的過氧化程度和植物對逆境條件反映的強弱。如圖7所示：鎘可以使細胞的MDA含量顯著上升，而鑭可以降低葉片MDA的含量并使之趨向于正常水平，說明鎘可以促進膜脂的過氧化，鑭可以緩解鎘脅迫防止脂膜的過氧化。4 結(jié)論通過對照組與實驗組延遲發(fā)光衰減曲線比較，表明濃度為60mg.L-1 的LaCl

24、3對緩解重金屬鎘對月季的脅迫具明顯效果，當LaCl3濃度為40mg.L-1或80mg.L-1時，LaCl3的緩解效果明顯降低。通過測定月季葉片的SOD活力與MDA含量，表明當在樣品中加入鎘后，SOD酶活力明顯降低，月季葉片細胞組織MDA含量的明顯上升，在加鑭的實驗組中，SOD變化不明顯，而MDA含量下降；本實驗表明， LaCl3對于提高SOD酶活力沒有明顯的效果，但可以防止膜的過氧化緩解鎘脅迫。60mg.L-1的LaCl3可以明顯緩解鎘元素對月季的脅迫作用，降低脂膜的氧化程度，這與月季葉片的超弱發(fā)光結(jié)果相一致。這表明延遲發(fā)光強度可以被用來進行植物抗逆及抗衰老方面的研究，而自發(fā)光效果沒有延遲發(fā)光

25、顯著。5 討論本實驗通過超弱發(fā)光(UWL)研究了鎘脅迫作用下月季的自發(fā)光強度、延遲發(fā)光(UWL)強度、SOD活力、MDA含量的變化，并通過這些生理指標的變化探索鑭對鎘脅迫的緩解規(guī)律。雖然通過各種生理指標的測定可以清楚的了解到植物代謝變化，但由于實驗過程繁瑣，而且受環(huán)境干擾因素影響，因此同樣的實驗得到的結(jié)果存在較大誤差；對于植物超弱發(fā)光現(xiàn)象的檢測，所受到的環(huán)境干擾因素相對較小，而且實驗過程簡單，實驗數(shù)據(jù)相對可靠。所以，通過對植物超弱發(fā)光現(xiàn)象的檢測，可以更便捷的研究環(huán)境對植物體內(nèi)各種生理活動的影響。本實驗顯示，在鎘的脅迫下，月季葉片的延遲發(fā)光強度增加，SOD活力降低，MDA含量上升，但自發(fā)光強度變

26、化不顯著；用不同濃度的鑭緩解后延遲發(fā)光強度明顯降低、MDA含量下降并趨于正常水平，但自發(fā)光強度變化仍不明顯，同時SOD活力變化也不明顯。該結(jié)果表明鎘促進了脂膜的過氧化，同時又對細胞內(nèi)的SOD活性起到一定的抑制作用，而鑭對脂膜具有保護作用，可以防止脂膜發(fā)生過氧化反應。本實驗沒有發(fā)現(xiàn)鑭對細胞內(nèi)SOD活性的提高有明顯的作用，因此，可能鑭主要作用于細胞膜結(jié)構，維持膜結(jié)構以及膜機構上功能復合體的完整性，從而緩解鎘脅迫，這與慈敦偉2，楊居榮14，Baszynski T20的報道是一致的。但在L3濃度下膜的氧化損傷最小，而葉片延遲發(fā)光強度反而上升，因此對于鑭的作用機理以及生物超弱發(fā)光(UWL)產(chǎn)生機制仍需要

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29、脅迫對青菜葉片幾種生理生化指標的影J，應用與環(huán)境生物學報，2O00，6(2)：11211612 沈恂.13 王逸群，鄭金貴，陳文列，等Hg2+、Cd2+ 污染對水稻葉肉細胞傷害的超微觀察J福建農(nóng)林大學學報：自然科學版，2004，33(4)：40941314 楊居榮，賀建群，蔣婉茹Cd污染對植物生理生化的影響J農(nóng)業(yè)環(huán)境保護，1995，14(5)：19319715 葉亞新, 金進, 王金虎. 稀土鑭對鎘脅迫小麥的防護效應J. 安徽農(nóng)業(yè)科學, 2005，33(5) :761 763.16 楊丹慧，許春輝，王可玢，等鎘離子對菠菜葉綠體色素蛋白質(zhì)復合物及激發(fā)能分配的影響J植物學報，1990，32(3)：

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33、mical effects 0f mercury，Cadmium and leadJAnnu Rev Biochem，1972，41：9198Alleviation Effects of Lanthanum on Ultraweak Luminescence in leaves of Rosa chinensis Treated by Cadmium Zhou Wenzhi(Department of Biology, Dezhou University, Dezhou Shangdong, 253023)Abstract：Cadmium (Cd) is one of biological t

34、oxicity strongest heavy metals. In soil excessive Cd is easily by plant absorbed and accumulated, and affects the plant the growth, the cell division and metabolism activity, then creates the crop yield and the quality drops. However certain dosage lanthanum may alleviate toxicity of the cadmium to

35、the plant to cause the plant each physiological target to tend to normal. This experiment uses the cadmium and the lanthanum simultaneous processing leaves of Rosa chinensis , then determination leaves spontaneous light, delayed luminescence, SOD vigor and MDA content then research alleviation funct

36、ion of lanthanum to cadmium coercion.Key words：ultraweak luminescence; lanthanum; Cadmium ; Rosa chinensis; 致謝本研究是在魏振林老師、王麗燕老師的悉心指導下完成的。特別感謝魏振林老師在論文選題、開題設想、給予我悉心指導；王麗燕老師和蘇亞南師哥在具體實施過程中給予我極大的幫助，他們嚴謹?shù)墓ぷ髯黠L和治學態(tài)度令我欽佩，更值得我學習。本實驗的部分數(shù)據(jù)是在物理系完成，十分感謝劉貴忠老師給于的幫助。在此謹致以學生誠摯的謝意和感激!英文譯文：原文：Molecular mechanisms of cad

37、mium induced mutagenicity譯文：鎘誘變性的分子機制鎘是一種世界普遍關注的一種人類只致癌物質(zhì)，由于他有極長的半衰期因而容易在環(huán)境中積累，一些管理組織把它的化合物劃分為致癌物質(zhì)，鎘影響細胞的增殖、分化、凋亡和其他的一些細胞生理活動。而且可以導致許多致癌作用有關的分子損傷,很長一段時間內(nèi)鎘被認為是一種非遺傳毒性的致癌物質(zhì)，因為在細菌和動物細胞檢測體系中鎘只表現(xiàn)出很弱的誘變性，最近我們證明鎘作為一種很強的誘變劑誘發(fā)多基因的刪除，因為我們在檢驗一個實驗體系時同時檢測到了基因內(nèi)和多基因座的突變，在此，我們討論鎘的兩種主要的誘變機理()鎘誘導產(chǎn)生ROS()鎘抑制DNA的修復。實驗證據(jù)

38、證明鎘至少對于與濃度相關的環(huán)境接觸來說，通過誘變DNA的氧化損傷誘發(fā)了突變，并通過抑制修復內(nèi)源和外源的DNA損傷降低了基因的穩(wěn)定性，這些損傷轉(zhuǎn)而增加了突變的可能性，相應地增加了癌的發(fā)生。關鍵詞：鎘、癌、DNA修復、遺傳毒性、誘變性、活性氧序言鎘以及他的化合物都被認為是人類的致癌物質(zhì)，除癌癥外，它們還對健康產(chǎn)生各種各樣的影響，人們關于鎘誘導癌癥的機理知道的很少，因此我們不能對接觸鎘的危險性作出正確的估計，其主要的困難是估計發(fā)生的各個階段即：癌的起始、促進和發(fā)展階段的作用機理。雖然已經(jīng)提出了各種鎘作用的途徑，包括基因表達的調(diào)節(jié)、信號轉(zhuǎn)導和DNA甲基化的抑制，但有兩種機制在分子水平占統(tǒng)治體地位：()

39、誘導了ROS的產(chǎn)生()抑制了DNA的修復，細胞內(nèi)ROS的增加與突變以及細胞信號的改變、凋亡都有著密切的關系，而DNA修復的胰子增加了遺傳的不穩(wěn)定性，因而增加了突變的機率，我們將從這個角度討論在這種致癌金屬的誘變性和遺傳毒性中誘導產(chǎn)生ROS以及干擾DNA修復的作用。鎘 一種環(huán)境致癌物質(zhì)自然界中，鎘與鋅、鉛、銅共同存在與礦石中，過去鎘的化合物被用作PVC產(chǎn)品、顏料以及各種合金的穩(wěn)定劑；現(xiàn)在鎘更普遍地被用在鎳-鎘充電電池中，金屬鎘還經(jīng)常被用作反腐蝕劑，大氣中鎘的主要來源與火山運動、森林大火和風載的土壤顆粒。環(huán)境中鎘的人為來源于鎘的提煉與應用、鎳的冶煉、化石燃料的燃燒和磷肥的應用，它們都可能包含高濃度

40、的鎘。20世紀鎘的釋放量大大增加，其中一個原因就是含鎘的產(chǎn)品很少被回收利用，而是經(jīng)常同生活廢品一樣倒掉，大氣中鎘的人為來源的釋放量是自然來源的3-10倍。鎘主要的職業(yè)性接觸是在非鐵金屬的冶煉、產(chǎn)品及工序以及電子垃圾的回收利用中；非職業(yè)性的接觸主要是吸煙，煙包括相對高濃度的鎘，對于非職業(yè)性接觸的非吸煙者飲食是接觸鎘的主要途徑。人對鎘的吸收主要取決于接觸鎘的途徑，僅有正常劑量的5%被腸胃吸收，而90%多是有肺吸收的。鎘是通過二價金屬載體-1（DMT-1）吸收的，但無論是哪種途徑，鎘一旦被吸收，它很快被從血液中清除而集中在某些組織中，鎘主要積累在肝和腎中，因為這些組織可以產(chǎn)生大量的可以緊密結(jié)合鎘的金

41、屬硫蛋白（MT），鎘有極長的生物半衰期這使它有積累毒性，而至今為止仍沒有一個對慢性鎘中毒行之有效的治療方法，如果長時間接觸鎘可以引發(fā)不可逆的腎小管損傷，骨質(zhì)疏松癥、非肥大性肺氣腫、貧血、嗜曙紅細胞增多、嗅覺缺失及慢性鼻炎。鎘作為一種嚴重的環(huán)境污染物的一個例子就是在日本神通川引發(fā)的痛痛病，這種病表現(xiàn)為劇烈的疼痛、骨折、蛋白尿癥和嚴重的骨質(zhì)疏松癥，這種病似乎是由于攝食被礦渣污染的水稻和水引起的。國際癌癥研究會以及美國國家毒物學綱要把鎘劃分為一種人類致癌物質(zhì)，這種劃分是基于許多證明鎘的職業(yè)性接觸與肺癌有關的研究數(shù)據(jù)上的；還有一些研究表明鎘在人類腎、肝、造血系統(tǒng)以及膀胱、胃癌中起一定作用，最近有新的證

42、據(jù)證明接觸環(huán)境中的鎘與前列腺癌以及胰腺腫瘤有關，盡管如此，鎘的接觸與非肺癌的發(fā)生之間明確的關系還沒有確定，因為受到流行病學研究的限制：長期并大量接觸鎘的個體數(shù)量很少、過去鎘接觸的信息有限以及接觸其它致癌物質(zhì)對接觸鎘的人群有深刻的影響。即使證據(jù)在增加，特別是對腎癌來說，但鎘的接觸與非肺癌的發(fā)生之間的聯(lián)系仍是不確定的。在動物中，鎘可以通過不同的接觸途徑有效地在許多部位誘導癌，在小鼠中，鎘的吸入可以誘發(fā)肺腺癌，這一點被人類數(shù)據(jù)證實。同許多其他金屬類似，鎘鹽在皮下或肌內(nèi)注射的部位可以誘發(fā)間致癌。但在人類中這些聯(lián)系是不確定的，在嚙齒動物中，鎘誘變性的另一些靶位點包括肝、腎上腺、胰腺、垂體、前列腺和造血系

43、統(tǒng)。除嚙齒動物睪丸的腫瘤外，鎘的誘變性機制我們了解，在小鼠的睪丸中，鎘可以誘發(fā)良性腫瘤，但這好像是由于早期的毒性的損害和睪丸功能的喪失造成的，而不是由于鎘特有的致癌性引起的。鎘作為一種具有遺傳毒性和誘變性的致癌物質(zhì)長期以來，鎘被認為是一種非遺傳毒性的致癌物質(zhì)，鎘及鎘的化合物是有毒性的，它們可以使BACB/C3T3細胞轉(zhuǎn)變?yōu)槟[瘤細胞，也可以使人的前列腺上皮細胞轉(zhuǎn)變?yōu)槟[瘤細胞，以及使人的前列腺上細胞永生，但對細菌卻無突變作用，并且在哺乳動物細胞中對hprt或tr座位的突變作用也相對較弱，盡管如此，鎘的化合物是有效的斷裂劑，在不同的哺乳動物細胞中，鎘化合物的接觸可以誘發(fā)染色體的畸變、姐妹染色體的交換

44、以及DNA的損害，比如：DNA單鏈或雙鏈的斷裂，DNA和蛋白質(zhì)的交聯(lián)，僅只有高細胞毒劑量才有以上效應。鎘的弱誘變活性表明：鎘或者主要作為一種非遺傳毒性致癌物質(zhì)，或者鑒于一些染色體的數(shù)據(jù)，鎘誘發(fā)的hprt位點的突變是不能存活的。hprt基因在X染色體上，而X染色體這個區(qū)域許多位點的刪除包括一些關鍵基因的刪除可能是致死的，而且突變也是不能存活的。大體上來說，hprt位上刪除超過了百萬個堿基極少能被修復，因此我們可能低估了主要誘發(fā)大片段刪除的試劑的誘變能力。在我們的研究中，我們用人倉鼠雜交細胞株，這種細胞在檢測基因內(nèi)和多位點突變方面是非常靈敏的，AL細胞包括一套倉鼠的染色體加上一條人的11號染色體。

45、人的這條染色體編碼一系列的CD59來檢測突變結(jié)果，因為它的表達或缺乏可以很容易地在complementmedialed cytotoxicity assay 中檢測。因為只有11p13.5區(qū)的很少一部分對AL細胞的存活是必需的，所以人的11號染色體上從少數(shù)幾個到140000000個堿基的突變都可以被檢測到。利用這個實驗體系，我們發(fā)現(xiàn)鎘是一種有效的誘變劑，一般認為在估計一種誘變劑的致癌能力時，用每半數(shù)致死量（如Do，即將存活率達到0.37時的濃度定義為致死劑量）產(chǎn)生的突變數(shù)比每單位劑量產(chǎn)生的突變數(shù)更適合。AL細胞在Do劑量時（2.7uM，5小時；或0.7uM，24小時）鎘分別誘發(fā)每105個存活細

46、胞中產(chǎn)生90和93個CD59突變細胞。當我們比較在Do產(chǎn)生的CD59突變細胞時，我們發(fā)現(xiàn)鎘的誘變能力與絲裂霉素相當，但低于亞砷酸鹽（140/105），石棉纖維（165/105）和射線（130105），為了確定在用鎘處理的AL細胞中引起CD59表現(xiàn)型的突變類型，我們用引物序列對定位于人類11號染色體短臂（wilm，parathy roid hormone coualase RAS）或長臂（A1）的標記基因進行多復PCR，突變圖譜分析表明大部分（86）鎘誘導的CD59突變丟失了位于11號染色體上的許多標記基因，這就意味著鎘主要誘導大片段刪除突變。但問題是鎘如何誘發(fā)DNA損害，一些金屬可以直接與DN

47、A接合，或者在DNA鏈間、DNA蛋白質(zhì)之間形成交連，這些損傷可以導致突變。盡管如此，在體外體系中，鎘只是很弱地與DNA接合，而且在細胞內(nèi)還有許多對鎘具有高度親和力的生物配位體，包括MTs，因此鎘直接作用于DNA而導致突變似乎是一件不大可能的事。鎘誘導ROS的形成。ROS，同H2O2和O2一樣可在氧化代謝中持繼的產(chǎn)生,但他們也不與DNA直接反應，它們在催化氧化還原反應的金屬離子存在的情況下可以通過Fencon和Haber Weiss反應轉(zhuǎn)變?yōu)楦呋钚缘牧u基自由基。自由基作用于DNA可以導致DNA鏈的斷裂和堿基的轉(zhuǎn)變，最終導致突變和腫瘤的發(fā)生。鎘的確誘發(fā)氧化壓力，包括脂質(zhì)的過氧化，但不同于其他金屬，

48、鎘不參與Fenten反應，用激光掃描共焦點顯微鏡及探針DCF來測量細胞內(nèi)ROS的產(chǎn)量，我們發(fā)現(xiàn)在AL細胞中，氯化鎘誘導ROS的形成并依賴于時間和劑量，在用1uM CdCl2處理人的細胞一小時后，DCF的熒光密度有微小的增加；2小時后熒光密度增加了57，并與控制有關。Yang等已闡述了鎘誘導胎兒成纖維細胞中ROS的形成，而S2uslerciesielska el al發(fā)現(xiàn)鎘在Hela細胞以及牛主動脈內(nèi)皮細胞中誘導O2及H2O2的形成。鎘誘發(fā)ROS形成的確切機制還不清除，但鎘可以減少細胞內(nèi)谷胱甘鈦的量，降低抗氧化酶、超氧化物歧化酶、過氧化氯酶活性，因而導致在接觸鎘的細胞中ROS的積累和氧化壓力的增

49、加。鎘使細胞內(nèi)ROS增加的另一個機制是鎘從細胞質(zhì)及細胞膜的蛋白質(zhì)中置換鐵及銅離子，因而增加了這些離子的濃度，它們通過Fention反應參與ROS的生成。已證明鎘促進了一個時間依賴型的生物膜中離子的釋放，有實驗表明小鼠暴露于致癌劑量的鎘12天后，其睪丸中鐵的含量增加。鎘通過ROS誘導突變的證據(jù)。我們用兩種互補的方法研究在AL突變檢測體系里鎘誘發(fā)的細胞毒性和誘變性中ROS的作用。在第一種方法中，在自由基清除劑存在的情況下用CdCl2 處理細胞，第二種方法中細胞在接觸CdCl2之間先除去細胞內(nèi)的谷胱甘鈦。如果用CdCl2和自由基清除劑（0.5DMSO）共同處理細胞，則Cad2的誘變能力將降低倍，但是

50、對Cad2的細胞毒性缺沒有影響。鎘誘變的突變性可以被羥基自由基清除DNSO所抑制的發(fā)現(xiàn)與抗氧化酶（如超氧化物歧化酶D甘露醇、硫醇）抑制鎘誘導的DNA單鏈的斷裂染色體的畸變以及hprt座位基因的突變的結(jié)果是一致的。在另一種方法中，培養(yǎng)細胞用去硫醇藥物BSO處理。BSO是一種谷氨酰半胱氨酸合成酶的競爭性抑制劑，用BOS處理細胞可以在用cacl2處理前降低細胞內(nèi)谷胱甘鈦的量。谷胱甘鈦以及其他一些小分子量的硫醇，都有顯著的自由基清除劑的功能，它們有助于維持細胞的整體性。雖然細胞自身調(diào)節(jié)的細胞內(nèi)谷胱甘鈦不會導致細胞死亡，但它的缺失會增強各物試劑的細胞毒性和誘變性，如離子化軸射、重金屬，一些化、療藥物、石

51、棉。用BOS預處理細胞會增強CdCl2的細胞毒性和誘變性。這個結(jié)果進一步證實了細胞內(nèi)的硫醇在保護哺乳動物細胞免受鎘的毒性影響中起著重要的作用。表1：在AL細胞中，自由基清除積（DMSO）和谷胱肽去除劑BSO對cacl2的細胞毒性和誘變性的影響。藥物a Do(um)b Mrc Mr/DodCacl2 2.7 34 90Cacl2+DMSO 2.8 13 37Cacl2+BSO 1.1 95 100a:在添加或去除0.5%（v/v）DMSO或用25umBSO預處理后再分別用0、1.25、2.5、5、10uM CdCl2處理細胞5小時。b:Do，即從劑量曲線的線性部分推算出存活率降到0.37時的濃度

52、，定義為致死劑量。c:Mr.突變率，突變劑量曲線線性部分的斜率，表示每uM CdCl2每105個存活細胞中的突變數(shù)。d:Mr/Do，Do濃度時的突變率。哺乳動物細胞中鎘誘導的DNA的氧化損傷。如果鎘主要通過ROS產(chǎn)生遺傳毒性和誘變性，那么鎘誘導的特有的DNA損傷就等同于氧化損害。ROS誘導的大量DNA突變損害都是8-OhdG，而8-OHdG是一種可靠的生物標記，用8-OhdG的單克隆抗體以及免疫過氧化物酶染色，我們發(fā)現(xiàn)對細胞進行CdCl2處理（1.25、2.5、5.0umcacl2處理5或24小時）會引起劑量依賴性的8-OhdG加和物的增加，并隨處理時間的加長而積累。如果用CdCl2和DMSO

53、(0.5%v/v)處理5小時，可以完全防止8-OhdG的形成，延長處理時間造成8-OhdG的積累可能是由于鎘的存在抑制了DNA損傷的修復，在人的淋巴母細胞中也發(fā)現(xiàn)了鎘誘導的DNA鏈的損害和8-OhdG的形成，這些發(fā)現(xiàn)為ROS在CdCl2處理的哺乳動物細胞中誘導遺傳毒性應答提供了新的證據(jù)。鎘的誘變性中包括抑制DNA的修復的證據(jù)至少，在非毒性濃度下，如果有其他多種致癌物質(zhì)出現(xiàn)比如：紫外線照射抑制細胞生長的鉑化合物，苯甲酰比和Alkylating agents，鎘可以產(chǎn)生明顯的毒性效應。現(xiàn)在有證據(jù)證明，鎘主要作用于DNA修復系統(tǒng)，最終導致不能消除內(nèi)源和外源的DNA損傷，因而增加了腫瘤的發(fā)生幾率。內(nèi)源

54、和外源的物質(zhì)會不斷的造成DNA分子的損傷，而多種不同的DNA損傷修復系統(tǒng)使突變頻率保持在較低的水平。除了脫氨基作用、水解作用和非酶促的DNA堿基的甲基化，活性氧的攻擊被認為是DNA的內(nèi)源性損傷的主要來源。DNA的氧化損傷主要通過切除修復來消除的。切出修復的第一步就是由特有的DNA N-糖苷酶識別并水解損傷堿基，形成AP位點，然后AP位點被脫嘌呤核酸酶出去，形成的斷裂的DNA鏈由新合成的DNA補充，最后把兩個末端連接在一起。Potts 等 發(fā)現(xiàn)，相對于非適應的細胞在鎘適應的肺泡上皮細胞中H2O2誘導的DNA損傷不能被有效的修復，我們的研究發(fā)現(xiàn)當用鎘處理用H2O2處理過的細胞時，鎘降低了H2O2誘

55、導產(chǎn)生的8-OhdG的清除，最近Zharkov和Roserquis的發(fā)現(xiàn)也支持這個結(jié)果，他們發(fā)現(xiàn)鎘使mOggl使活，在用鎘對AL細胞的24個小時的培養(yǎng)中我們觀察到的8-OhdG的積累很可能是由于8-OhdG清除的抑制造成的。我們進一步研究了生物相關的低濃度的鎘對用UV照射和烷化劑（MMS、MNU）處理過的CHO細胞中引起的DNA損傷修復的影響，實驗中我們運用彗星電泳或和單細胞凝膠電泳，他們對于單鏈或雙鏈損傷、堿不穩(wěn)定位點、DNA-DNA/DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)以及在單細胞水平上與不完全的切除修復有關的單鏈斷裂的檢測十分靈敏。 彗星電脈證明是UV 誘導的DNA損傷是單鏈的斷裂，它是NER過程中形成的

56、中間體。在清除UV射線、環(huán)境及食物中的致癌物質(zhì)誘導的DNA損傷以及一些損制細胞生長的藥物，如：順一二胺二氯化鉑，產(chǎn)生的DNA損傷中NER是主要的修復系統(tǒng)。修復過程中由DNA損傷的認別引發(fā)的，而在哺乳動物細胞中損傷的認別是由15-20個不同的蛋白質(zhì)和酶來完成的。在損傷部位兩側(cè)切開后，損傷的DNA鏈除去，空缺通過聚合酶和連接酶的作用填補。在僅用UV射線處理的CHO細胞里迅速地形成DNA鏈的損害，照射后頭60min內(nèi)是一個快速的重新聚合的階段。如果先用1um Cacl2預處理細胞再用UV照射，DNA鏈損傷的形成明顯減慢，而且經(jīng)過60min的修復后，DNA鏈的損傷水平也沒有降低，這些結(jié)果表明，鎘抑制了

57、NER的起始步驟，即：DNA損傷的識別和（或）切開、切除步驟2干擾了Hella細胞中UV誘導的DNA損傷的識別，他還進一步發(fā)現(xiàn)這個影響可以通過向細胞提取物中增加二價鎂或鋅而得到逆轉(zhuǎn)。這表明失活發(fā)生在蛋白質(zhì)水平而不是扭曲DNA的結(jié)構或干擾基因表達或修復蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄。鋅指蛋白對鎘特別敏感，因為鎘可以取代DNA接合基序鋅指結(jié)構中的鋅。我們都知道許多DNA修復蛋白中的DNA接合結(jié)構域都包括鋅指結(jié)構，如：在識別UV誘導的DNA損傷中起關鍵作用的XPA及作為損傷識別中輔助因子的RPA。最近已證明鎘抑制XPA結(jié)合到UV誘導產(chǎn)生的寡核苷酸上。MMS和MNU直接烷基化DNA堿基的氮原子和氧原子。彗星電泳顯示損傷主要是AP位點處的損傷和在BER中形成的中間物。在MMS處理的細胞中，DNA鏈的損傷 uM CdCl2預處理的細胞中MMS誘導的DNA鏈的損害在修復的頭兩個小時中積累，這表明細胞中形成了AP位點或DNA鏈的損害，但BER的進行被阻礙了。同時Hartmann和Speit的報告以及Lynn等的報告與此是一致的，Hartmann和Spei發(fā)現(xiàn)鎘抑制了人類白細胞中MMS誘導的DNA損害的修復。而Lyn