高效液相色譜法測(cè)定貴州產(chǎn)銀杏葉提取物中萜類內(nèi)酯的含量

1、高效液相色譜法測(cè)定貴州產(chǎn)銀杏葉提取物中萜類內(nèi)酯的含量                       作者：彭全材， 楊占南，胡繼偉，鐘麗，蔣翠紅 【摘要】  目的研究銀杏葉提取物中的銀杏萜類內(nèi)酯A，B，C及白果內(nèi)酯的含量測(cè)定方法并對(duì)貴州銀杏藥材銀杏萜類內(nèi)酯的含量進(jìn)行調(diào)查研究。方法本實(shí)驗(yàn)采用甲醇超聲提取樣品，HPLC梯度洗脫。結(jié)果銀杏萜類內(nèi)酯日內(nèi)和日間精密度的R

2、SD均小于1.5%，穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)的RSD為0.65%（n=5），最低檢測(cè)限為0.50 g/ml，加樣回收率為97.7%，97.2%，94.7%，94.6%,RSD（n=5）分別為2.8%,2.3%,2.5%,2.1%。銀杏葉提取物樣品中GA，GB，GC和BB的總含量均符合中國(guó)藥典（2005版）標(biāo)準(zhǔn)。結(jié)論該方法縮減了樣品的前處理步驟，節(jié)約了實(shí)驗(yàn)時(shí)間，適用于銀杏葉提取物中的銀杏萜類內(nèi)酯A、B、C及白果內(nèi)酯含量測(cè)定；同時(shí)也證明貴州作為一個(gè)藥材大省，銀杏的質(zhì)量也相對(duì)較好。 【關(guān)鍵詞】  高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測(cè)； 銀杏葉提取物； 萜類內(nèi)酯Abstract：ObjectiveTo devel

3、op a method for measurement of ginkgolide A,B,C, Bilobalide in the Ginkgo biloba extract from Guizhou Province.MethodsThe Ginkgo biloba leaves was extracted with methanol and gradient elution.ResultsThe theoretical plate number of Ginkgolide was 6088 ,the resolution was 1.42 and the tailing factor w

4、as 1.01.The Intra-day and inter-day precision (RSD) were all less than 1.5%, while the recurrence (RSD) was 0.65% (n=5).The limit of detection was 0.5g/ml,the average recovery rates were 97.7%,97.2%,94.7% and 94.6%.ConclusionOur developed method can shorten the time used for Ginkgo biloba leaves pre

5、treatment,and is a simple and reliable method to determine the content of ginkgolied A,B,C and Bilobalide in the Ginkgo biloba extract.The results also prove that the quality of Ginkgo biloba in Guizhou Province is relatively good.Key words：High-performance liquid chromatography with evaporative lig

6、ht-scattering detection;  Ginkgo biloba extract;  Ginkgolide    銀杏Ginkgo biloba Linn是我國(guó)的特有樹種，又稱為白果樹、公孫樹，屬銀杏科銀杏屬植物，原產(chǎn)于我國(guó)，是當(dāng)今地球上最古老的樹種之一。它的生命力非常頑強(qiáng)，從中生代的白堊紀(jì)晚期至新生代第四紀(jì)，地球上的氣候發(fā)生變化，一百五十余種銀杏類植物幾乎全部滅絕，唯獨(dú)銀杏戰(zhàn)勝了惡劣的環(huán)境存活至今1。銀杏是我國(guó)二級(jí)保護(hù)植物，其果營(yíng)養(yǎng)豐富，品味甘美；其葉、根、皮含有多種藥用成分，尤其是銀杏葉中有效成分提取物“黃酮苷”和“萜內(nèi)酯”具

7、有極高的藥用價(jià)值。銀杏作為一種藥物應(yīng)用已經(jīng)有 600 年的歷史了，早在宋朝我國(guó)民間就使用銀杏葉治療哮喘和支氣管炎，其藥用最早載于神農(nóng)本草經(jīng)，傳統(tǒng)用于益肺氣， 定喘嗽，縮小便，止白濁，生食降痰消毒殺蟲2。銀杏葉一般作為銀杏藥用部位，其味苦澀、性平，有毒，歸肺經(jīng)，是傳統(tǒng)的止咳平喘藥，銀杏葉提取物常用的質(zhì)量控制指標(biāo)是黃酮和銀杏內(nèi)酯3，4，銀杏總內(nèi)酯(Total Lactone of Ginkgo,TLG)為銀杏葉提取物其所含萜內(nèi)酯成分( Extract of Ginkgo biloba , EGb761)包括銀杏內(nèi)酯A ，B，C 和白果內(nèi)酯， 簡(jiǎn)稱為 GA ，GB，GC 和 BB ，是主要的活性成分

8、5，具有抗血小板活化因子(PAF)6、保護(hù)中樞神經(jīng)系統(tǒng) 7，8、對(duì)缺血損傷的逆轉(zhuǎn)保護(hù)等作用，對(duì)抗血小板凝聚，抗老年癡呆癥有明顯的功效。也有研究表明銀杏總內(nèi)酯具有促進(jìn)學(xué)習(xí)記憶能力的作用，其作用可能與增強(qiáng)機(jī)體抗氧化能力有關(guān)9。還有多項(xiàng)臨床觀察證實(shí) EGb 能有效防治冠心病10，現(xiàn)在已發(fā)現(xiàn)銀杏制品可治療 47 種疾病11。銀杏內(nèi)酯 A ，B，C 為二萜內(nèi)酯，白果內(nèi)酯為倍半萜內(nèi)酯，它們都具有 3 個(gè)五元內(nèi)酯環(huán)和一個(gè)罕見的特丁基等結(jié)構(gòu)特征，迄今尚未發(fā)現(xiàn)存在于其他任何植物中。我們運(yùn)用 ChemDraw 軟件構(gòu)建了GA ，GB，GC 和BB的共同骨架分子結(jié)構(gòu)（圖1），同時(shí)使用 Chem3D 軟件模擬了其3D

9、構(gòu)象（圖2），這樣就有便于我們直觀地了解其最低能量(energy minimum) 時(shí)的分子構(gòu)象。    中國(guó)藥典2005 版第部 HPLC-ELSD 選用正丙醇-甲醇-四氫呋喃為流動(dòng)相等梯度洗脫測(cè)定銀杏葉提取物中的內(nèi)酯，樣品前處理要經(jīng)過水浴溶解-加鹽酸-醋酸乙酯萃取-醋酸溶液洗滌-醋酸乙酯洗滌-蒸干-定容等過程，方法復(fù)雜、回收率比較難把握、而且重現(xiàn)性較差等。    本實(shí)驗(yàn)采用 HLPC-ELSD 梯度洗脫測(cè)定銀杏葉提取物中的內(nèi)酯，簡(jiǎn)化了前處理步驟，具有回收率和重現(xiàn)性高，精密度好等優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)也證實(shí)貴州產(chǎn)銀杏葉提取物中的內(nèi)酯含量，對(duì)貴州

10、產(chǎn)銀杏藥材的發(fā)展進(jìn)行初步考證研究。1  器材1.1 儀器島津高效液相色譜儀：HPLC-20AT；20l進(jìn)樣閥；Model 300 ELSD；HW-2000 色譜工作站；藥材粉碎機(jī)；瑞士BUCHI旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀；Simplicity 185 personal 超純水器(美國(guó)Milli2 pore公司)；色譜條件：迪馬C18色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 m)；美國(guó)ELMA T660/H超聲波清洗器(功率360W，頻率35 kHz)。1.2 試藥對(duì)照品銀杏萜類內(nèi)酯 A、B、C 及白果內(nèi)酯購(gòu)于中國(guó)藥品生物研究所，批號(hào)分別為110862 - 200305，110863 - 20

11、0204，110864 - 200203 ，110865 - 200303；銀杏葉提取物分別來自于貴州多家知名藥廠送樣。高效液相色譜流動(dòng)相組成為色譜純甲醇及超純凈水。2 方法與結(jié)果2.1  對(duì)照品溶液和樣品溶液制備2.1.1  對(duì)照品溶液的配制 分別精密稱取對(duì)照品GA，GB，GC BB 各3，3，3，4 mg置于10 ml量瓶中加甲醇到刻度，搖勻即得混合對(duì)照品溶液，分別取 2.50，0.50，0.25，0.05 ml，分別置于10 ml 量瓶中加甲醇到刻度，搖勻，即得混合對(duì)照品溶液，將上述5組對(duì)照品置于冰箱中備用。2.1.2  樣品溶液的配制精密稱定銀杏葉提取物粗

12、粉約 0.1 g(過40目篩，40干燥至恒重)置于 25 ml 量瓶中，加甲醇定容至刻度，超聲處理15 min，放冷，搖勻，0.20 m 濾膜過濾，取續(xù)濾液，上機(jī)備用。2.2  色譜條件2.2.1  色譜條件流動(dòng)相：A相為水，B相為甲醇，梯度洗脫。B相隨時(shí)間變化：30%（012min），30%45%（1225min線性），45%30%（2540min），40min（stop）；流速1.0ml/min；柱溫40，進(jìn)樣20l。2.2.2  蒸發(fā)光散射檢測(cè)器條件漂移管溫度：80，載氣(空氣)壓力40 psi，放大系數(shù)(gain)為9。   

13、 根據(jù)對(duì)照品的保留時(shí)間定性、峰面積比計(jì)算GA，GB，GC，BB的含量。2.3  色譜柱的選擇分別用 Symmetry C18色譜柱(3.9 mm×150 mm，5 m)、shim-pack C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5m)、迪馬C18色譜柱(4.6 mm×300 mm，5 m)進(jìn)行對(duì)照品和樣品的測(cè)定，結(jié)果表明，上述3種柱子峰型都很好，但從分離效果和效率綜合考慮，我們選擇了 shim-pack C18 色譜柱(4.6 mm×250 mm，5m)。對(duì)照品與樣品的分析圖譜見圖3。百事通2.4  前處理方法及檢測(cè)器的選擇曾采用

14、藥典方法先水浴溶解、醋酸乙酯萃取、醋酸溶液洗滌、醋酸乙酯洗滌、蒸干、定容等過程進(jìn)行處理和用甲醇直接超聲處理進(jìn)行比較，結(jié)果表明，甲醇直接超聲提取,提取率偏高，而按中國(guó)藥典提取液雜質(zhì)少分離效果較好，但考慮到超聲直接提取也可以將樣品較好的分離且回收率高，操作簡(jiǎn)便，故選擇甲醇作為提取溶劑超聲提取。    銀杏萜類內(nèi)酯A、B、C 及白果內(nèi)酯測(cè)定常用的檢測(cè)器有紫外檢測(cè)器和示差折光檢測(cè)器。紫外檢測(cè)器適用于帶紫外吸收特征基團(tuán)的物質(zhì)，如果沒有紫外吸收，則需經(jīng)衍生化技術(shù)轉(zhuǎn)化成有紫外特征吸收的物質(zhì)，但這種操作復(fù)雜，且準(zhǔn)確度受衍生物的穩(wěn)定性的影響大； 示差折光檢測(cè)器是一種通用型檢測(cè)器，要

15、求恒溫、恒流速，且無法采用梯度洗脫，其檢測(cè)靈敏度也不夠高，所以對(duì)銀杏萜類內(nèi)酯A、B、C 及白果內(nèi)酯的分離效果自然就差了。蒸發(fā)光散射檢測(cè)器(ELSD)作為一種新型通用型檢測(cè)器，彌補(bǔ)了HPLC傳統(tǒng)檢測(cè)器的不足，特別是對(duì)無紫外或紫外末端吸收的大分子有機(jī)化合物的檢測(cè)，具有極大的優(yōu)越性。2.5  線性關(guān)系考察將不同濃度的對(duì)照品溶液依次進(jìn)樣,分別重復(fù)3次,以對(duì)照品溶液濃度的自然對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)(X),峰面積的自然對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo)(Y)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性回歸。結(jié)果見表1。表1  4種萜類內(nèi)酯的線性方程、相關(guān)系數(shù)與線性范圍（略）2.6  精密度實(shí)驗(yàn)與穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)以，對(duì)照品溶液，在1d 之內(nèi)

16、連續(xù)進(jìn)樣5次，以及連續(xù) 5 d 分別進(jìn)樣，根據(jù)所得峰面積分別計(jì)算日內(nèi)精密度和日間精密度。銀杏內(nèi)酯對(duì)照品溶液低、中、高 3 個(gè)濃度的日內(nèi)精密度和日間精密度的RSD分別為1.1%，0.9%，0.7%和1.5%，0.7%，0.8% ，結(jié)果表明方法的精密度良好。    取第 2 批次銀杏葉提取物的備用液, 按色譜條件進(jìn)行測(cè)定，分別在0，3，6，12，18，24，36和 48 h 測(cè)定總萜類內(nèi)酯的含量，考察穩(wěn)定性，RSD為0.65%。2.7 回收率實(shí)驗(yàn)精密稱取樣品2的粗粉 5 份，各約 0.1g，分別加入 3mg對(duì)照品，分別按“2.1.2”項(xiàng)下條件制成樣品溶液，每份測(cè)定6次

17、，20ml進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算加樣回收率。銀杏葉提取物中白果內(nèi)酯、銀杏內(nèi)酯A、B、C加樣回收的平均回收率結(jié)果見表2。表2  銀杏葉提取物中各萜內(nèi)酯的回收率（略）2.8  檢測(cè)限考察將銀杏萜類內(nèi)酯對(duì)照品溶液進(jìn)行稀釋，以信噪比為31時(shí)，確定其最低檢測(cè)限，其最低平均檢測(cè)限為 0.50g/ml。2.9  樣品測(cè)定結(jié)果貴州當(dāng)?shù)厮帍S不同批次的銀杏葉提取物樣品測(cè)定結(jié)果見表3。表3  銀杏葉提取物中萜類內(nèi)酯的含量（略）    我們也對(duì)其進(jìn)行了數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)處理（見圖4）。通過統(tǒng)計(jì)圖我們可以清晰的發(fā)現(xiàn)這次實(shí)驗(yàn)中所調(diào)查的樣品之間的差異性和規(guī)律性。3

18、0; 討論    本實(shí)驗(yàn)所建立的 HPLC-ELSD 方法與目前常用的銀杏內(nèi)酯含量測(cè)定方法相比，操作簡(jiǎn)便，不需水浴酸化，減少樣品的前處理所帶來的誤差，提高了分析的精確度。    方法學(xué)考察結(jié)果顯示該方法準(zhǔn)確度高、專屬性強(qiáng)、靈敏度及穩(wěn)定性均較好，測(cè)定方法可靠，測(cè)定結(jié)果能客觀反映銀杏的質(zhì)量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果對(duì)銀杏藥材、銀杏內(nèi)酯原料及制劑的質(zhì)量控制都有重要的意義，可為銀杏藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制訂提供科學(xué)依據(jù)。    從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出, 從銀杏內(nèi)酯A ，B， C 和白果內(nèi)酯的單個(gè)成分含量上看存在一定的差異性，但銀杏中總萜類內(nèi)

19、酯含量差別比較小，不同批次的銀杏葉提取物中總萜類內(nèi)酯含量平均為7.18%。按照中國(guó)藥典( 2005 版)規(guī)定銀杏葉提取物中總萜類內(nèi)酯的含量不得低于6.0%的標(biāo)準(zhǔn)，10批次的貴州銀杏葉提取物的質(zhì)量均符合要求，結(jié)果表明如果對(duì)貴州銀杏原料嚴(yán)格控制質(zhì)量，從藥材的采集、貯藏到原料的提取都制定嚴(yán)格統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，貴州銀杏的應(yīng)用將有很大發(fā)展?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】  1郁青,王成章.銀杏葉加工現(xiàn)狀和前景J.林產(chǎn)化工通訊,1999,33(1):19.2李時(shí)珍.本草綱目,第 3 冊(cè)M.北京:人民衛(wèi)生出版社,1995：1801.3Wang H, Chen S Z, Zhao G B, et al. Analysis of the factors that affected active ingredients from Ginkgo leaves J. China Trad Herb Drugs , 1999, 30 (8) : 631.4Li CY. Research development of Ginkgo J. World Phytomed,1993,14(5):270.5Braquet P. The ginkgo lides: potent platelet activating factorantagonists