益氣活血方藥對老年大鼠肝臟衰老相關(guān)基因表達的影響(一)

1、益氣活血方藥對老年大鼠肝臟衰老相關(guān)基因表達的影響(一)作者：黎志萍，趙偉康，徐品初，陳方敏，金國琴，姚明忠 【關(guān)鍵詞】 肝細胞摘要目的：觀察益氣、活血方藥對老年大鼠肝臟衰老相關(guān)基因表達的影響。方法：以自然衰老大鼠為衰老模型，采用RTPCR、Western blotting法研究益氣、活血方藥對老年大鼠肝臟p16、p21、增殖細胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen, PCNA）、cyclin D1和cyclin E mRNA轉(zhuǎn)錄和蛋白表達的影響。結(jié)果：老年大鼠肝臟p16、p21、cyclin D1 mRNA轉(zhuǎn)錄和蛋白的表達增加；PCNA、cyclin E

2、 mRNA轉(zhuǎn)錄和蛋白的表達降低。與老年大鼠比較，益氣、活血方藥可下調(diào)老年大鼠肝臟cyclin D1 mRNA轉(zhuǎn)錄和蛋白表達，上調(diào)促進增殖基因cyclin E mRNA轉(zhuǎn)錄和蛋白表達，但對p16、p21和PCNA的調(diào)節(jié)作用不明顯。結(jié)論：益氣、活血方藥主要通過調(diào)控cyclin D1和cyclin E mRNA轉(zhuǎn)錄和蛋白表達而促進細胞增殖。關(guān)鍵詞衰老大鼠; 肝細胞; p16; p21; 增殖細胞核抗原; cyclin D1; cyclin E; 益氣方; 活血方Effects of recipes for replenishing qi and activating blood on senesce

3、nce related gene expressions in the liver of aging ratsABSTRACT Objective: To observe the effects of recipes for replenishing qi and activating blood on p16, p21, proliferating cell nuclear antigen (PCNA), cyclin D1 and cyclin E gene expressions in the liver of aging rats. Methods: A recipe for repl

4、enishing qi and a recipe for activating blood were administered to aging rats respectively, and the effects of the above recipes on the expressions of senescence related genes (p16, p21, PCNA, cyclin D1 and cyclin E) were examined by RTPCR and Western blotting methods. Results: The expressions of p1

5、6, p21 and cyclin D1 mRNAs and proteins in the liver of the untreated aging rats were upregulated, while the expressions of PCNA and cyclin E mRNAs and proteins decreased. As compared with the untreated aging rats, both recipes could downregulate the expressions of cyclin D1 mRNA and protein and upr

6、egulate the expressions of cyclin E mRNA and protein, but had no obvious effects on the expressions of mRNAs and proteins of p16, p21 and PCNA. Conclusion: Recipes for replenishing qi and activating blood can improve the liver cell proliferation of aging rats via downregulating the expressions of cy

7、clin D1 mRNA and protein and upregulating the expressions of cyclin E mRNA and protein.KEY WORDS aging rats; hepatocytes; p16; p21; proliferating cell nuclear antigen; cyclin D1; cyclin E; qibenefiting recipe; bloodactivating recipe 隨著細胞及分子生物學的發(fā)展，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)一些與細胞衰老密切相關(guān)的基因及轉(zhuǎn)錄因子（反式作用因子）13?？v觀歷代中醫(yī)文獻，延緩衰老的方藥基本屬

8、于補腎、健脾、益氣和活血范疇。近代研究顯示：上述四類方藥均有不同程度抗自由基、調(diào)節(jié)免疫功能、提高肝臟蛋白質(zhì)含量、改善肝臟超微結(jié)構(gòu)等延緩衰老的作用4。實驗研究還表明：補腎方藥能促進老年大鼠肝臟cHras、cmyc、cfos、cjun mRNA的表達，下調(diào)p53 mRNA的表達5。本實驗從細胞增殖調(diào)控角度，根據(jù)中醫(yī)理論，從益氣活血的抗衰經(jīng)典方中分別選擇幾味有代表性的中藥組成小復(fù)方，以自然衰老大鼠為衰老模型，應(yīng)用RTPCR和Western blotting法研究益氣、活血方藥對老年大鼠肝臟衰老相關(guān)基因p16、p21、cyclin D1、增殖細胞核抗原(proliferating cell nucle

9、ar antigen, PCNA)和cyclin E表達的影響。1材料與方法1.1實驗中藥 益氣方選用黨參、黃芪、炙甘草（取自時氏醫(yī)道保元湯），活血方選用川芎、當歸、赤芍（取自經(jīng)方四物湯）。中藥制劑采用水提醇沉法制備后，分裝于消毒好的塑料瓶中，于20 保存。1.2實驗動物 SD雄性大鼠（上海中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供）24只，分成青年對照組（5月齡）、老年對照組（22月齡）、老年益氣組（22月齡）和老年活血組（22月齡）。老年益氣組和活血組的用藥劑量為臨床成人劑量的20倍（按每千克體質(zhì)量的用藥量進行換算），采用飲料方式給藥，每周服藥5 d，停藥2 d，自1822月齡連續(xù)給藥4個月。1.3RTP

10、CR 肝組織細胞總的RNA按Trizol一步法提取，具體步驟按試劑說明書操作。actin PCR引物6：5CCAGCCATGTACGTTGCTATCCAG 3，5GGAACCGCTCATTGCCAATGGTGA 3，擴增片段為378 bp；p16 PCR引物：5ATGGAGTCCTCTGCAGATAG 3，5TTAG CGCTGCTTTGGGGGTT 3，擴增片段為480 bp；p21PCR引物：5ATGTCCGATCCTGGTGATGT3，5GGGCTTTCTCTTGCAGAAGA 3，擴增片段為495 bp；cyclin D1 PCR引物：5ATGGAACACCAGCTCCTGTG 3，5

11、TGGTGTTCCATGTCGGTGG 3，擴增片段為888 bp；PCNA PCR引物：5ATGTTTGAGGCACGCCTGAT3，5AGATCCTTCTTCATCTTCGA 3，擴增片段為786 bp；cyclin E PCR引物：5AAAGAAGAAGGTGGTTCCGA 3，5TCATTCTGTCTCCT GCTCAC 3，擴增片段為1 191 bp。PCR擴增反應(yīng)總體積為50 l。擴增程序為：95 （30 s） 變性94 （30 s）退火55 (30 s)延伸72 (30 s)30個循環(huán)72 （7 min）4 貯存。根據(jù)目的片段的長短及引物的Tm值設(shè)置退火溫度及延伸時間。PCR產(chǎn)物

12、鑒定電泳，紫外燈下觀察，圖像分析系統(tǒng)掃描。1.4Western Blotting 采用放射免疫沉淀測定法(radioimmunoprecipitation assay, RIPA)7。取肝臟組織100 mg加入單去污細胞裂解液900 l，冰浴中勻漿。勻漿后立即加入100 l蛋白酶抑制劑苯甲基磺酰氟液(phenylmethylsulphonyl fluoride, PMSF)和40 l混合蛋白酶抑制complete液(complete EDTAfree protease inhibitor cocktail tablet, 1片加1 ml水），4 10 000 r/min離心10 min，取上清

13、液于70 冷凍保存。24 h后10 000 r/min離心10 min，取上清液分裝，70 冷凍保存。Lowry (FolinCiocalteau)法8測定蛋白含量。各組蛋白各取30 g，采用十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecylsulfatepolyacrylamide gel electrophoresis, SDSPAGE)和免疫印跡反應(yīng)，用Supersignal ECL發(fā)光劑熒光顯色X光膠片曝光，觀察蛋白條帶。1.5圖像處理及統(tǒng)計分析 RTPCR、Westernblotting實驗結(jié)果分別采用Leica Q500IW和上海復(fù)日Smartview 2001生物電泳

14、圖像分析系統(tǒng)進行圖像分析。所有實驗數(shù)據(jù)均采用SPSS 9.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計處理，統(tǒng)計學方法采用方差分析及q檢驗。2結(jié)果2.1益氣、活血方藥對大鼠肝臟衰老相關(guān)基因mRNA表達的影響與青年組比較，老年大鼠肝臟p16、p21、cyclin D1基因mRNA的表達明顯上調(diào)（P0.01），PCNA和cyclin E mRNA的表達明顯下調(diào)（P0.01）。與老年組比較，益氣、活血方藥組cyclin D1基因mRNA的表達明顯下調(diào)（P0.01），而cyclin E mRNA的表達則明顯上調(diào)。益氣、活血方藥對p16、p21和PCNA mRNA的表達有改善作用，但無統(tǒng)計學意義。見圖1、圖2、表1。2.2益氣、

15、活血方藥對大鼠肝臟衰老相關(guān)基因蛋白表達的影響與青年組比較，老年大鼠肝臟p16、p21、cyclin D1基因蛋白表達明顯上調(diào)（P0.01），PCNA和cyclin E蛋白表達明顯下調(diào)（P0.01）。與老年組比較，益氣、活血方藥組cyclin D1基因蛋白表達明顯下調(diào)（P0.01），而cyclin E蛋白表達明顯升高（P0.01）。見表2、圖3。圖1 p16和p21瓊脂糖凝膠電泳（略）Fig 1 Agarose gel electrophoresis of p16 and p21M: Marker; 1:Young control group; 2: Untreated group; 3: Qi

16、benefiting recipetreated group; 4: Bloodactivating recipe treated group圖2 cyclin D1、PCNA和cyclin E瓊脂糖凝膠電泳（略）Fig 2 Agarose gel electrophoresis of cyclin D1, PCNA and cyclin EM: Marker; 1: Young control group; 2: Untreated group; 3: Qibenefiting recipetreated group; 4: Bloodactivating recipetreated gro

17、up表1 益氣、活血方藥對大鼠肝臟衰老相關(guān)基因mRNA表達的影響（目的基因/actin）（略）Tab 1 Effects of qibenefiting and bloodactivating recipes on mRNA expressions of p16, p21, PCNA, cyclin D1 andcyclin E genes in the liver of rats (target gene/actin)*P0.05,*P0.01, vs young control group; P0.01, vs untreated group表2 益氣、活血方藥對大鼠肝臟衰老相關(guān)基因蛋白表

18、達的影響（目的基因/actin）（略）Tab 2 Effects of qibenefiting and bloodactivating recipes on protein expressions of p16，p21，PCNA，cyclin D1 andcyclin E genes in the liver of rats (target gene/actin)*P0.01, vs young control group; P0.01, vs untreated group圖3 p16、p21、PCNA、cyclin D1和cyclin E蛋白印跡雜交結(jié)果（略）Fig 3 Western

19、blotting results of p16, p21, PCNA, cyclin D1 and cyclin E genes1:Young control group; 2: Untreated group; 3: Qibenefiting recipetreated group; 4: Bloodactivating recipetreated group3討論衰老是生物體在其生命的后期階段所出現(xiàn)的進行性、全身性、內(nèi)在性，由多因素共同作用的循序漸進的退化過程。近年來從基因水平研究衰老過程已成為衰老機制研究中的熱點。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)：有些細胞增殖調(diào)控相關(guān)基因，主要是原癌基因、抑癌基因及端粒酶調(diào)控相

20、關(guān)基因等，在年輕和衰老細胞中的表達明顯不同。原癌基因是一組參與細胞增殖和生長調(diào)控的基因。細胞衰老時，多數(shù)原癌基因的表達水平降低，少數(shù)升高。由于原癌基因表達產(chǎn)物大多是信號傳導途徑或細胞周期蛋白相關(guān)成員，它們的表達水平降低或活性減弱，會使細胞對刺激的反應(yīng)性降低，或使細胞周期進程減慢，從而降低細胞增殖水平。抑癌基因的主要功能是對細胞分裂和生長進行適當抑制，防止細胞周期失控導致無限擴增和分裂生長。衰老時，有些抑癌基因的表達或活性增加。具有細胞增殖調(diào)控功能的衰老相關(guān)基因包括p21、p16、細胞周期素（cyclin）D1、周期素依賴性激酶(cyclindependent kinases, CDK) 2、p

21、53、視網(wǎng)膜母細胞瘤（retinablastoma, Rb）基因和PCNA等。上述衰老相關(guān)基因的調(diào)控是相互聯(lián)系的9。中醫(yī)認為人體的生長、發(fā)育和衰老與“腎”密切相關(guān)?！澳I精虛衰”是衰老的主要原因。同時又認為“脾胃為血氣陰陽之根蒂”，“脾胃既和，其人壽；脾胃不和，其人夭”，因此也重視奉養(yǎng)脾胃精氣在延年中的作用。素問?至真要大論還提出“氣血正平，長有天命”，氣血運行失常，則能影響臟腑、經(jīng)絡(luò)、陰陽等方面功能的平衡，出現(xiàn)五臟六腑各方面病變，加速衰老過程。因此縱觀歷代文獻有關(guān)“耐老”、“不老”方藥，研究其治法基本屬于補腎、健脾、益氣、活血范疇。本實驗主要在比較補腎、健脾、益氣、活血方藥對衰老的人胚肺二倍體

22、成纖維細胞2BS細胞增殖調(diào)控作用的基礎(chǔ)上，進一步觀察益氣、活血方藥對老年大鼠肝臟衰老相關(guān)基因p16、p21、cyclin D1、PCNA和cyclin E的mRNA轉(zhuǎn)錄和蛋白表達的影響，以探討益氣、活血方藥對老年大鼠肝臟細胞增殖的作用機制。結(jié)果表明：老年大鼠肝臟p16、p21、cyclin D1基因mRNA和蛋白表達明顯升高；PCNA、cyclin E mRNA和蛋白表達明顯降低。提示：老年大鼠肝臟細胞周期蛋白依賴的激酶抑制因子p21、p16表達增高，可能通過抑制cyclin D1CDK4和cyclin ECDK2的活性，使Rb蛋白磷酸化水平降低，從而抑制細胞增殖。p21還可能與PCNA結(jié)合，

23、使DNA合成受阻。由于細胞不能進入增殖周期，最終發(fā)生衰老。細胞周期蛋白cyclin D1是原癌基因的表達物，與CDK4結(jié)合后，可促進G1/S期轉(zhuǎn)變。文獻報道：衰老時cyclin D1蛋白水平升高，但cyclin D1CDK4復(fù)合物活性降低，影響細胞增殖10。本實驗結(jié)果顯示：衰老大鼠肝臟cyclin D1的升高與文獻報道一致。PCNA為DNA聚合酶的附屬蛋白，參與DNA復(fù)制；cyclin E與CDK2結(jié)合，參與G1/S期的轉(zhuǎn)變。本實驗結(jié)果顯示：與青年鼠比較，老年大鼠PCNA和cyclin E的表達明顯下調(diào)，則必然影響細胞周期的正常運行，抑制細胞增殖。益氣、活血方藥能不同程度降低老年大鼠肝臟cyclin D1基因mRNA和蛋白的表達，上調(diào)肝臟cyclin E基因mRNA和蛋白的表達，但對p16、p21、PCNA mRNA和蛋白的表達作用不明顯。結(jié)合本實驗室前期實驗流式細胞儀檢測細胞周期的結(jié)果（益氣、活血方藥可降低老年大鼠肝組織細胞G0/G1期比例，增加G2/G1期細胞比值），提示益氣、活血方藥可促進老年大鼠肝組織細胞的增殖11。益氣、活血方藥還能不同程度提高2BS衰老細胞的代謝活力和降低衰老相關(guān)半乳糖苷酶的活力12,13，推測益氣、活血方藥促進老年大鼠肝組織細胞增殖的作