發(fā)酵工程試驗(yàn)指導(dǎo)

1、 實(shí)驗(yàn) 1 KLa的測(cè)定方法氧是難溶氣體，在25和1個(gè)大氣壓下，純水中溶解度為0.25 mol/m3左右。在好氧發(fā)酵過程中，氧氣由氣相傳遞到液相，為微生物消耗。氧的傳遞過程限速阻力位液膜階段，此時(shí)Kla是描述氧的傳遞性能的重要參數(shù)。1.目的掌握利用亞硫酸鹽測(cè)定容積氧體積傳遞系數(shù)的方法，了解氧傳遞在好氧發(fā)酵過程中的重要作用。2原理以Cu離子為催化劑，溶解于水中的O2能立即將水中的SO32-氧化為SO42-，其氧化反應(yīng)的速度幾乎與SO32-濃度無關(guān)。實(shí)際上是O2一經(jīng)溶入液相，立即就被還原掉。這種反應(yīng)特性使溶氧速率成為控制氧化反應(yīng)的因素。其反應(yīng)式如下：Cu2+2Na2SO3+O2 2Na2SO4剩余

2、的Na2SO3與過量的碘作用Na2SO3 + I2 + H2O Na2SO4 + 2HI剩余的I2用標(biāo)準(zhǔn)Na2S2O3溶液滴定。I2+ 2Na2S2O3 Na2S4O6+2NaIO2 Na2SO3 I2 Na2S2O31 2 2 4可見，每溶解1mol O2，將消耗2mol Na2SO3，將少消耗2mol I2，將多消耗4mol Na2S2O3。因此可根據(jù)兩次取樣滴定消耗Na2S2O3的摩爾數(shù)之差，計(jì)算體積溶氧速率。公式如下：式中 NV：兩次取樣滴定消耗Na2S2O3體積之差，M：Na2S2O3濃度，t：兩次取樣時(shí)間間隔，hV0：取樣分析液體積。 將上述NV值代入公式即可計(jì)算出kLa 由于溶液

3、中SO3-2在Cu2+催化下瞬即把溶解氧還原掉，所以在攪拌作用充分的條件下整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中溶液中的溶氧濃度C=0。 在0.1Mpa(1atm)下，25ºC時(shí)空氣中氧的分壓為0.021MPa，根據(jù)亨利定律，可計(jì)算出C*=0.24mmol/L，但由于亞硫酸鹽的存在，C*的實(shí)際值低于0.24mmol/L，因此一般規(guī)定C*=0.21mmol/L。所以kLa=NV/0.21 亞硫酸鈉氧化法的優(yōu)點(diǎn)是不需專用的儀器，適用于搖瓶及小型試驗(yàn)設(shè)備中kLa的測(cè)定。缺點(diǎn)是：測(cè)定的是亞硫酸鈉溶液的體積溶氧系數(shù)kLa，而不是真實(shí)的發(fā)酵液中的kLa。 3. 試劑 a. 0.1mol/LNa2S2O3溶液（需要標(biāo)定）

4、，在使用前1-2周配置 b.淀粉溶液：稱取1g淀粉，放入100mL的水中加熱攪拌煮沸2-3min.c.0.05mol/L的I2溶液：稱取30gKI，加入10mL,溶解，再稱取19.5g碘攪拌充分溶解，定容1.5L（根據(jù)實(shí)驗(yàn)用量調(diào)節(jié)），避光保存。d. 0.1mol/L硫酸銅溶液4. 儀器吸管，50mL三角瓶、酸式滴定管、300-500mL三角瓶。5. 實(shí)驗(yàn)步驟及方法測(cè)定Kla的反應(yīng)裝置，加入適當(dāng)濃度，如x mol/L（0.050.45mol/L）Na2SO3溶液，每升Na2SO3溶液加入1 ml 0.1mol/L硫酸銅溶液.。在通風(fēng)攪拌后開始計(jì)時(shí)（準(zhǔn)確秒表）及間隔準(zhǔn)確時(shí)間取樣時(shí)，取樣量略少于2.

5、5/x,以便于取樣為準(zhǔn)。取樣時(shí)注意，迅速取樣10ml Na2SO3溶液加入0.05mol/L的I2溶液25ml溶液中。吸管一定要盡可能的靠近碘液液面。然后用標(biāo)準(zhǔn)的0.1mol/LNa2S2O3溶液進(jìn)行滴定。6. 實(shí)驗(yàn)記錄及報(bào)告反應(yīng)液組成 Na2SO3： mol/L實(shí)驗(yàn)條件反應(yīng)器名稱及規(guī)格反應(yīng)液體積反應(yīng)溫度轉(zhuǎn)速、絕對(duì)氣壓兩次取樣間隔t/s兩次滴定Na2S2O3溶液體積差Kla（1/h）Kla（1/h）平均值思考題1.實(shí)際發(fā)酵過程中能否用此法進(jìn)行測(cè)定容積氧傳遞系數(shù)？2. 對(duì)于幾十立方的發(fā)酵罐該法是否可行？3. 為什么要吸管一定要盡可能的靠近碘液液面實(shí)驗(yàn)2 菌體生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)參數(shù)的求取（第一部分）目的和

6、要求掌握DNS法測(cè)定還原糖和多糖的方法，繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線。一. 原理3，5-二硝基水楊酸與還原糖共熱后被還原成棕紅色的氨基化合物，在一定范圍內(nèi)還原糖的量和反應(yīng)液的顏色深度成正比。因此，可利用分光光度計(jì)進(jìn)行比色測(cè)定，求得樣品的含糖量。材料與試劑a) 材料：葡萄糖（分析純）、蒸餾水b) 試劑：DNS液1）以稱取3,5-二硝基水楊酸（C7H4N2O7）6.3 g，氫氧化鈉 21.0 g充分溶解于500 ml蒸餾水中（水先煮沸10分鐘后冷卻） （2）加入酒石酸鉀鈉（C4H4O6KNa·4H2O）182.0g，苯酚（在50水中融化） 5.0g，偏重亞硫酸鈉（NaS2O5）5.0g，攪拌至全溶，定

7、容至1000 ml。 （3）充分溶解后盛于棕色瓶中，放置10天后便可使用。平時(shí)盛一小瓶放在外面使用，其它儲(chǔ)于冰箱中。此溶液每月配制一次。c) 器材：容量瓶、吸管（1mL,5mL,25mL）、烘箱、試管架、吸耳球、稱量紙、分光光度計(jì)、燒杯、恒溫水浴鍋、離心機(jī)、記號(hào)筆、電爐、搪瓷缸二. 操作方法a) 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作管號(hào)012345葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液(mL)00.20.40.40.81.0蒸餾水(mL)21.81.61.41.21.0DNS試劑(mL) 1.5沸水浴(min) 5冷卻 流水冷卻蒸餾水(mL) 21.5A540三. 結(jié)果1. 以吸光度為橫坐標(biāo)，葡萄糖質(zhì)量為縱坐標(biāo)作圖。并借助計(jì)算機(jī)計(jì)算出相關(guān)系

8、數(shù)和曲線方程。 動(dòng)力學(xué)參數(shù)求?。ǖ诙糠郑┳?0世紀(jì)40年代至今，微生物生理學(xué)者和生物化學(xué)工程學(xué)者提出了許多關(guān)于微生物生長(zhǎng)的動(dòng)力學(xué)模型。這些生長(zhǎng)模型根據(jù)Tsuchiya理論可分為 （1）確定論的非結(jié)構(gòu)模型，是一種理想狀況，不考慮細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)，每個(gè)細(xì)胞之間無差別。 （2）確定論的結(jié)構(gòu)模型，每個(gè)細(xì)胞之間無差別，細(xì)胞內(nèi)部有多個(gè)組分存在。 （3）概率論的非結(jié)構(gòu)模型，不考慮細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)，每個(gè)細(xì)胞之間有差別。 （4）概率論的結(jié)構(gòu)模型，考慮細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)，每個(gè)細(xì)胞之間有差別。 從工程角度看，理想的微生物生長(zhǎng)模型應(yīng)具備下列4個(gè)條件： （1）要明確建立模型的目的。 （2）明確地給出建立模型的假定條件，這樣才能明確

9、模型的適用范圍。 （3）希望所含有的參數(shù)，能夠通過實(shí)驗(yàn)逐個(gè)確定。 （4）模型應(yīng)盡可能簡(jiǎn)單。目前，常使用確定論的非結(jié)構(gòu)模型是Monod方程。莫諾方程（Monod方程），式中： ：生長(zhǎng)比速(h-1)max：最大生長(zhǎng)比速(h-1)S: 單一限制性基質(zhì)濃度(mol/L)KS: 微生物對(duì)基質(zhì)的半飽和常數(shù)(mol/L)Sm0.5mKSScrit根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)，細(xì)菌生長(zhǎng)速率可以表示為根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)，細(xì)菌的生長(zhǎng)速率可以表示為因此在短時(shí)間內(nèi)上式可表示為以 作圖，為一直線則符合monod方程，通過斜率和截距可求取動(dòng)力參數(shù)Ks與rmax.二、方法步驟1.培養(yǎng)基配置：葡萄糖 30g ，NaCl 5g，牛肉膏

10、5g ，蛋白胨 10g， 水 1000ml；分裝值500ml三角瓶中裝瓶量為200mL,0.1Mpa蒸汽滅菌25min.2. 待培養(yǎng)基降至室溫，無菌接入種子10mL,放置于37恒溫?fù)u床振蕩培養(yǎng)；3.按照以下方法取樣進(jìn)行測(cè)定時(shí)間t發(fā)酵液中葡萄糖濃度S菌體吸光度OD600nm8h9h10h11h12h注意：葡萄糖濃度較高稀釋后，（具體稀釋倍數(shù)以吸光度測(cè)定值在020.8之間為準(zhǔn)）測(cè)定的吸光度乘以稀釋倍數(shù)根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行換算為濃度。同樣當(dāng)菌體濃度吸光度大于1時(shí)，要適當(dāng)稀釋（具體稀釋倍數(shù)以吸光度測(cè)定值在020.8之間為準(zhǔn)）測(cè)定的吸光度乘以稀釋倍數(shù)。三數(shù)據(jù)分析序號(hào)tXX11(S8h+ S9h)/2(8h時(shí)

11、的OD600nm9h時(shí)的OD600nm)9h時(shí)的OD600nm-8h時(shí)的OD600nm（9h時(shí)的OD600nm+8h時(shí)的OD600nm）/2求取方法見上例如234以作圖，符合monod方程，通過斜率和截距可求取動(dòng)力參數(shù)Ks與rmax.五、實(shí)驗(yàn)分析六、總結(jié)實(shí)驗(yàn)3 發(fā)酵罐的構(gòu)造和操作原理 目的要求了解生物發(fā)酵罐的基本結(jié)構(gòu)和操作方法實(shí)驗(yàn)原理發(fā)酵罐是最常見和常用的生物反應(yīng)器，已經(jīng)實(shí)現(xiàn)生物發(fā)酵各種工藝參數(shù)的在位測(cè)定和自動(dòng)控制。內(nèi)容發(fā)酵罐基本結(jié)構(gòu)與操作方法。發(fā)酵罐的基本結(jié)構(gòu)：生物發(fā)酵罐系統(tǒng)=罐體系統(tǒng)+控制機(jī)箱+空氣壓縮機(jī)+蒸汽發(fā)生器操作流程：開機(jī)空罐滅菌加入培養(yǎng)液實(shí)罐滅菌冷卻接種工藝參數(shù)設(shè)定運(yùn)行：發(fā)酵+通

12、氣終點(diǎn)：放料清洗關(guān)機(jī)。1. 罐體系統(tǒng)罐身：由硼硅玻璃和不銹鋼（316L）加工而成。密封件：機(jī)械密封、硅橡膠“O”型圈。罐蓋：排氣冷凝器口、pH電極口、取樣放料孔、取樣回氣孔、液位電極口、接種口、溫度電極口、DO電極口、接地線插口、進(jìn)氣孔、單孔補(bǔ)料孔、三口補(bǔ)料孔、泡沫電極口。2. 管閥系統(tǒng) 管閥系統(tǒng)由EW冷卻水電磁閥、W1一溢流水閥、W2一排水排汽閥、S一進(jìn)蒸汽調(diào)節(jié)閥、G氣路調(diào)節(jié)閥、不銹鋼管路、優(yōu)質(zhì)膠管、接頭等組成。3.pH電極的校止 進(jìn)入pH電極校止后，顯示界面如下圖所示。pH：*.* CALIBTEMP：*C AUTOSLOPE：*.* +/-ZERO：* +/- 校正時(shí)，溫度補(bǔ)償是自動(dòng)的，

13、校正溫度應(yīng)選擇于發(fā)酵液工作溫度附近。操作人員須將隨機(jī)提供的溫度電極和pH電極一同插入中性標(biāo)準(zhǔn)溶液，如pH=6.86，通過面板調(diào)整零位ZERO，(用箭頭鍵移動(dòng)光標(biāo)到ZERO行的+/-上，按ENTER鍵即可)使屏幕上pH指示值接近6.86，再將pH計(jì)和溫度電極一起插入標(biāo)準(zhǔn)的酸性或堿性溶液，如pH=4.0。調(diào)整斜率SLOPE(用箭頭鍵移動(dòng)光標(biāo)到SLOPE行的+/-上，按ENTER鍵即可)使pH指示接近4，再重復(fù)上述過程1-2次，使pH指示達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)溶液的pH值即可。斜率SLOPE的變化范圍：0.39-1.89，零位ZERO的變化范圍122-143，校正完畢用ESC鍵退出。 實(shí)罐滅菌后及發(fā)酵過程中應(yīng)對(duì)p

14、H電極進(jìn)行在線校正。從罐內(nèi)取出樣品后，即用標(biāo)準(zhǔn)pH計(jì)檢測(cè)樣品的pH值，再進(jìn)入CALIB程序，調(diào)整零位ZERO，使液晶顯示器顯示的pH值與標(biāo)準(zhǔn)pH計(jì)顯示值相同。顯然，你應(yīng)保證這標(biāo)準(zhǔn)pH計(jì)是正確的。4. DO2電極的校正進(jìn)入DO2電極校正后，顯示界面如下圖所示。DO2：*% CALIBTEMP：*C AUTOSLOPE：*.* +/-ZERO：* +/-校正時(shí)，溫度補(bǔ)償是自動(dòng)的，校正溫度應(yīng)選擇在發(fā)酵：工作溫度附近。操作員將溶氧電極放入些遮酸鈉趣盤遙遮，調(diào)整零位ZERO，使DO2指示接近于0%，最好為1%-2%，再將溶氧電極取出，以空氣作為100%溶氧量來標(biāo)定，調(diào)楚斜率SLOPE使DO2達(dá)到100%

15、，再重復(fù)上述過程12次即可。SLOPE的調(diào)整范圍：0.52.0，ZERO的調(diào)整范圍：125。校正完畢用ESC鍵退出。實(shí)罐滅菌后，在接種發(fā)酵剛開始，應(yīng)對(duì)DO2電極進(jìn)行在線校正，進(jìn)入CALIB程序，調(diào)整斜率SLOPE，使液晶顯示器顯示的DO2值達(dá)到100%。5. 實(shí)罐滅菌 第一步 裝上已校正好的pH、DO電極 第二步 按工藝要求在罐內(nèi)放入發(fā)酵培養(yǎng)液。 第三步 夾套加熱，開啟攪拌，待溫度上升至90左右，停止夾套加熱，關(guān)閉攪拌； 第四步 空氣過濾器、取樣口通入蒸汽加熱。當(dāng)滅菌接近15min左右結(jié)束時(shí)，關(guān)閉空氣過濾器蒸汽，打開空氣過濾器排污閥，啟動(dòng)空氣壓縮機(jī)，通入空氣過濾器。 第五步 控制蒸汽閥門和尾氣

16、閥門大小穩(wěn)定罐體蒸汽壓在0.1MPa至滅菌結(jié)束； 第六步 打開冷卻水關(guān)閉排污閥，啟動(dòng)攪拌，降溫 。 6 接種采用火焰接種法7. 發(fā)酵控制參數(shù)設(shè)定，進(jìn)入發(fā)酵，定時(shí)取樣分析，并控制。發(fā)酵結(jié)束，放罐，拔出電極并加以保護(hù)，清洗發(fā)酵罐，滅菌。報(bào)告1.繪畫生物發(fā)酵罐的詳細(xì)結(jié)構(gòu)。2.說明生物發(fā)酵罐的操作方法。3.說明生物發(fā)酵罐操作的注意事項(xiàng)。實(shí)驗(yàn)4 枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)條件優(yōu)化在工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)中，發(fā)酵培養(yǎng)基的設(shè)計(jì)是十分重要的，因?yàn)榕囵B(yǎng)基的成分對(duì)產(chǎn)物濃度、菌體生長(zhǎng)都有重要的影響。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方法發(fā)展至今可供人們根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要來選擇的余地也很大。目前最常用的方法有,單因素法（One at a time）、正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)（O

17、rthogonal design）、均勻設(shè)計(jì) (Uniform design)、全因子實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)(Full factorial design)、部分因子設(shè)計(jì)(fractional factorial design)、 Plackett-Burman設(shè)計(jì)（Plackett-Burman design）中心組合設(shè)計(jì)（Central composite design）、 BoxBehnken設(shè)計(jì)(BoxBehnken design)、響應(yīng)曲面分析法、改進(jìn)單純形優(yōu)化法(Modified simplex method)、遺傳算法(Genetic algorithm，GA)等。正交設(shè)計(jì)法（4學(xué)時(shí)）目的要求掌

18、握發(fā)酵工藝條件或參數(shù)的多因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和操作方法。實(shí)驗(yàn)原理發(fā)酵過程涉及到數(shù)個(gè)工藝參數(shù)，每個(gè)參數(shù)有多個(gè)水平，每個(gè)因素之間還存在交互作用。采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法進(jìn)行多因素、多水平的試驗(yàn)，可以大大減少實(shí)驗(yàn)，并確定各因素之間的交互作用。實(shí)驗(yàn)次數(shù)可以減少為：水平數(shù)的平方次。在多因素試驗(yàn)中，隨著實(shí)驗(yàn)因素的增多，處理數(shù)據(jù)呈幾何級(jí)數(shù)增長(zhǎng)。例如，2個(gè)因素各取3個(gè)水平的試驗(yàn)（簡(jiǎn)稱32試驗(yàn)），有32=9個(gè)處理，3因素各取3個(gè)水平的試驗(yàn)（簡(jiǎn)稱33驗(yàn)），有33=27個(gè)處理，4因素各取3個(gè)水平的試驗(yàn)（簡(jiǎn)稱34驗(yàn)），有34=81個(gè)處理處理數(shù)太多，試驗(yàn)規(guī)模變大，會(huì)給試驗(yàn)帶來許多困難。采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，可以大大減少試驗(yàn)次數(shù)。正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)是利用一套規(guī)格化的表格正交表來安排試驗(yàn)，適用于多因素、多水平、試驗(yàn)誤差大、周期長(zhǎng)等的試驗(yàn)，是效率較高的一種試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法。教學(xué)內(nèi)容分組進(jìn)行多個(gè)因素多個(gè)水平的多因素試驗(yàn)，測(cè)定實(shí)驗(yàn)結(jié)果。根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)備條件，本實(shí)驗(yàn)為4因素3水平實(shí)驗(yàn)，正交實(shí)驗(yàn)次數(shù)為9次，采用L9（34）正交設(shè)計(jì)表。表1 試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)表序號(hào)試驗(yàn)因素/劑量水平1水平2水平31接種量/%15102裝瓶體積/mL/瓶25501503pH678表2 L9（34）