綠色熒光蛋白gfp標(biāo)記方法

1、纖維素降解菌的GFP標(biāo)記 gfp質(zhì)粒的提取質(zhì)粒的提取試驗(yàn)路線gfp質(zhì)粒質(zhì)粒+X-3感受態(tài)細(xì)胞感受態(tài)細(xì)胞 X-3感受態(tài)細(xì)胞的制備感受態(tài)細(xì)胞的制備電擊轉(zhuǎn)化電擊轉(zhuǎn)化X-3-gfp標(biāo)記菌標(biāo)記菌經(jīng)過(guò)傳代培養(yǎng)驗(yàn)證其穩(wěn)定性，同時(shí)檢測(cè)其經(jīng)過(guò)傳代培養(yǎng)驗(yàn)證其穩(wěn)定性，同時(shí)檢測(cè)其相關(guān)理化特性（相關(guān)理化特性（ph，溫度，含氧量，轉(zhuǎn)，溫度，含氧量，轉(zhuǎn)速等）是否受到影響，確定速等）是否受到影響，確定gfp標(biāo)記的細(xì)標(biāo)記的細(xì)菌可以用于進(jìn)一步研究菌可以用于進(jìn)一步研究GFP標(biāo)記菌落觀察油鏡觀察本實(shí)驗(yàn)所需的的材料1.LB培養(yǎng)基：蛋白胨培養(yǎng)基：蛋白胨 10g，NaCl 10 g，酵母浸膏，酵母浸膏5 g，蒸餾水，蒸餾水 1000ml，

2、pH 7.02.抗生素壯觀霉素（抗生素壯觀霉素（Spectinomycine Spe）購(gòu)自）購(gòu)自Sigma公司公司3.PEB洗滌液：蔗糖洗滌液：蔗糖93.1g， MgCl2 0.2g，KH2PO4 0.953g,H2O 1000ml, pH 7.43.電轉(zhuǎn)儀：伯樂(lè)電轉(zhuǎn)儀：伯樂(lè)MicroPulser電穿孔儀電穿孔儀4.立體熒光顯微鏡：（立體熒光顯微鏡：（Leica MZ12）為瑞士萊卡儀器公司產(chǎn)品）為瑞士萊卡儀器公司產(chǎn)品5.熒光顯微鏡：熒光顯微鏡：ECLIPSE 80i高級(jí)研究型顯微鏡高級(jí)研究型顯微鏡6.離心機(jī)：離心機(jī)：EPPENDORF7.凝膠成像儀：凝膠成像儀：BIO-RAD Univers

3、al Hood Gel-Doc UV Imaging System8.質(zhì)粒質(zhì)粒DNA：購(gòu)自：購(gòu)自AxyGEN生產(chǎn)的生產(chǎn)的AxyPrep質(zhì)粒質(zhì)粒DNA 一.gfp質(zhì)粒的提取 1.先在卡那培養(yǎng)基上過(guò)夜培養(yǎng)菌液，然后提取該菌液進(jìn)行實(shí)驗(yàn)先在卡那培養(yǎng)基上過(guò)夜培養(yǎng)菌液，然后提取該菌液進(jìn)行實(shí)驗(yàn)2.按照按照AxyGEN生產(chǎn)的生產(chǎn)的AxyPrep質(zhì)粒質(zhì)粒DNA說(shuō)明書(shū)上的方法進(jìn)行相說(shuō)明書(shū)上的方法進(jìn)行相關(guān)操作關(guān)操作3.采用采用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行質(zhì)粒瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行質(zhì)粒DNA檢測(cè)檢測(cè) a.凝膠制備：瓊脂糖凝膠制備：瓊脂糖 （1g）+TAE（100ml） 微波加熱微波加熱至透明倒至透明倒 入制膠板中入制膠板中 b

4、.2 l質(zhì)粒質(zhì)粒+2 l單染料滴在制膠板上，同時(shí)做單染料滴在制膠板上，同時(shí)做mark對(duì)照對(duì)照 c.140v，30min d.電泳結(jié)束后，用紫外凝膠成像儀和紫外凝膠成像系統(tǒng)觀察電泳結(jié)束后，用紫外凝膠成像儀和紫外凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果，并記錄結(jié)果，并記錄二.X-3感受態(tài)細(xì)胞的制備1.從LB固體平板上挑取新鮮的x-3菌株單菌落于50 ml LB液體培養(yǎng)基中，30，170 r/min 振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，按照 1%接種比例接入100 ml LB液體培養(yǎng)基中，30，170 r/min 振蕩培養(yǎng)，每1 h 測(cè)定1 次 OD6002.收集生長(zhǎng)中期的培養(yǎng)物于冰水浴中放置20 min 后，用PEB洗滌液沖洗細(xì)胞4 次

5、。具體過(guò)程：用50ml PEB洗滌液沖洗離心過(guò)的菌體，輕輕混勻，然后放于離心機(jī)（8000r,5min）離心，重復(fù)四次。這些過(guò)程都需要隨時(shí)放在冰盒上，保持冷卻。三.電擊轉(zhuǎn)化及熒光觀察1.用用250lPEB洗滌液沖洗最后一次離心的菌體，分別分裝到洗滌液沖洗最后一次離心的菌體，分別分裝到50l的的離心管中離心管中2.取取50l感受態(tài)細(xì)胞感受態(tài)細(xì)胞+1l質(zhì)粒（梯度分別為質(zhì)粒（梯度分別為1l，2.5l，5l）置于電）置于電轉(zhuǎn)杯上，用槍頭輕輕吹吸，冰上冷卻轉(zhuǎn)杯上，用槍頭輕輕吹吸，冰上冷卻3.電轉(zhuǎn)儀電擊電轉(zhuǎn)儀電擊4.立即用立即用LB培養(yǎng)液活化（培養(yǎng)液活化（1ml），轉(zhuǎn)移到離心管中，震蕩培養(yǎng)），轉(zhuǎn)移到離心管中

6、，震蕩培養(yǎng)1h(120r,37)5.取轉(zhuǎn)化后的菌液，分別取取轉(zhuǎn)化后的菌液，分別取10 ，50， 100l菌液涂布于含有菌液涂布于含有100g/ml壯觀霉素的壯觀霉素的LB固體培養(yǎng)基上，固體培養(yǎng)基上，30培養(yǎng)培養(yǎng)6.取相關(guān)切片在熒光顯微鏡下觀察是否標(biāo)記上。取相關(guān)切片在熒光顯微鏡下觀察是否標(biāo)記上。9、 人的價(jià)值，在招收誘惑的一瞬間被決定。22.2.2622.2.26Saturday, February 26, 202210、低頭要有勇氣，抬頭要有低氣。*2/26/2022 3:23:29 AM11、人總是珍惜為得到。22.2.26*Feb-2226-Feb-2212、人亂于心，不寬余請(qǐng)。*Satu

7、rday, February 26, 202213、生氣是拿別人做錯(cuò)的事來(lái)懲罰自己。22.2.2622.2.26*February 26, 202214、抱最大的希望，作最大的努力。2022年2月26日星期六*22.2.2615、一個(gè)人炫耀什么，說(shuō)明他內(nèi)心缺少什么。2022年2月*22.2.26*February 26, 202216、業(yè)余生活要有意義，不要越軌。*2/26/202217、一個(gè)人即使已登上頂峰，也仍要自強(qiáng)不息。*22.2.26謝謝大家謝謝大家2021/4/2699、 人的價(jià)值，在招收誘惑的一瞬間被決定。2022-2-262022-2-26Saturday, February 2

8、6, 202210、低頭要有勇氣，抬頭要有低氣。2022-2-262022-2-262022-2-262/26/2022 3:23:29 AM11、人總是珍惜為得到。2022-2-262022-2-262022-2-26Feb-2226-Feb-2212、人亂于心，不寬余請(qǐng)。2022-2-262022-2-262022-2-26Saturday, February 26, 202213、生氣是拿別人做錯(cuò)的事來(lái)懲罰自己。2022-2-262022-2-262022-2-262022-2-262/26/202214、抱最大的希望，作最大的努力。2022年2月26日星期六2022-2-262022-

9、2-262022-2-2615、一個(gè)人炫耀什么，說(shuō)明他內(nèi)心缺少什么。2022年2月2022-2-262022-2-262022-2-262/26/202216、業(yè)余生活要有意義，不要越軌。2022-2-262022-2-26February 26, 202217、一個(gè)人即使已登上頂峰，也仍要自強(qiáng)不息。2022-2-262022-2-262022-2-262022-2-26謝謝大家謝謝大家9、 人的價(jià)值，在招收誘惑的一瞬間被決定。2022-2-262022-2-26Saturday, February 26, 202210、低頭要有勇氣，抬頭要有低氣。2022-2-262022-2-262022-2-262/26/2022 3:23:29 AM11、人總是珍惜為得到。2022-2-262022-2-262022-2-26Feb-2226-Feb-2212、人亂于心，不寬余請(qǐng)。2022-2-262022-2-262022-2-26Saturday, February 26, 202213、生氣是拿別人做錯(cuò)的事來(lái)懲罰自己。2022-2-262022-2-262022-2-262022-2-262/26/202214、抱最大的希望，作最大的努力。2022年2月26日星期六2022-2-262022-2-262022-2-2615、一個(gè)人炫耀什么，說(shuō)明他內(nèi)心缺