丙肝病毒核心基因克隆載體pGEMHCVcore的構(gòu)建

1、    丙肝病毒核心基因克隆載體pGEMHCV/core的構(gòu)建【摘要】  目的 構(gòu)建丙肝病毒核心基因克隆載體pGEM-HCV/core，為進(jìn)一步 研究 外部引導(dǎo)序列（external guide sequence, EGS）引導(dǎo)核糖核酸酶P在RNA水平阻斷丙肝病毒核心基因的表達(dá)做好前期基礎(chǔ)。 方法  將含HCV全長基因的pBRTMHCV1301l質(zhì)粒于大腸桿菌JMl09內(nèi)擴(kuò)增；提取pBRTMHCV1301l質(zhì)粒；從pBRTMHCV1301l質(zhì)粒中PCR擴(kuò)增出HCV核心基因片段并將其插入pGEM3Z克隆載體；以得到重

2、組的pGEM-HCV/core克隆載體；最后EcoR I and Hind III雙酶切鑒定HCV核心基因克隆載體。結(jié)果 pGEM-HCV/core克隆載體經(jīng)雙酶切、凝膠電泳證明插入片段與HCV 核心基因片段大小相符；經(jīng)測序證明其插入序列與HCV core基因序列一致。結(jié)論 成功構(gòu)建了HCV 核心基因的克隆載體pGEM-HCV/core。 【關(guān)鍵詞】  HCV；core基因；載體；EGSAbstract:Objective To construct the clone plasmid containing the core gene of HCV, preparing fo

3、r the research of blockage of the expression of HCV core gene guided by EGS at the level of mRNA.Methods After expanding plasmid pBRTM /HCV13011 (containing the whole genome of HCV) through E. coli JM109.  The  core gene with pBRTM /HCV13011 is amplified with PCR as the template;

4、 The core segment was inserted into the clone plasmid pGEM3Z. Plasmid pGEM-HCV/core was digested with EcoR I and Hind III. Results The PCR result of HCV core has correct size and sequences. Conclusion The clone plasmid pGEMHCV/core has successfully been constructed.Key words:HCV; core gene; vector;

5、EGS在HCV的眾多基因片段中，核心蛋白基因具有包裹病毒核酸、維持病毒外形的功能，是導(dǎo)致病毒持續(xù)感染的關(guān)鍵因素。因此通過阻斷丙型肝炎病毒核心基因的表達(dá)以抑制丙肝病毒復(fù)制的研究已受到廣泛的關(guān)注。本研究旨在采用pGEM3Z克隆載體構(gòu)建pGEMHCV/core克隆載體，為進(jìn)一步研究指導(dǎo)序列性M1核酶(M1 ribozyme of guide sequence,M1GS)在RNA水平阻斷HCV 核心基因的表達(dá)，為開展包括抗HCV疫苗和藥物研發(fā)等臨床 應(yīng)用 提供重要的物質(zhì)基礎(chǔ)。1 材料與方法 1.1 材料大腸桿菌菌株JM109，購自鼎國生物公司。用CaCl2法制備感受態(tài)菌，-80 保存。質(zhì)粒pBRTM

6、HCV13011，由美國華盛頓大學(xué)Rice教授惠贈，具有HCV全長基因；pGEM3Z克隆載體由本試驗(yàn)室保存。1.2 主要試劑EcoRI、HindIII、T4 DNA連接酶及Taq酶均購自大連寶生物公司。DNA MarkerIII及DNA Marker DL2000分別購自北京奇華盛生物公司及威佳生物公司。質(zhì)粒提取試劑盒購自康龍生物公司。DNA片段純化試劑盒購自尚能生物公司。1.3 引物上游引物：5GGCGAATTCATGAGCACGAATC CTAAAC 3(包含EcoRI位點(diǎn))；下游引物：5CCTAAGCTTGGCTGAAGCGGGCAC 3(包含HindIII位點(diǎn))；引物由英俊生物公司合成

7、。1.4 方法1.4.1 質(zhì)粒的擴(kuò)增及純化應(yīng)用0.1 mol/L的CaCl2溶液制備JM109感受態(tài)菌；將質(zhì)粒pBRTMHCV13011及pGEM3Z克隆載體分別轉(zhuǎn)化JM109感受態(tài)菌，篩選陽性菌落，小量制備質(zhì)粒DNA，經(jīng)酶切及瓊脂糖凝膠電泳 分析 選出含相應(yīng)質(zhì)粒的陽性細(xì)菌克隆,見圖1。 將轉(zhuǎn)化有pBRTMHCV13011及pGEM3Z克隆載體的細(xì)菌分別接種于含四環(huán)素和含氨芐青霉素的平板中，倒置于生化培養(yǎng)箱37 恒溫培養(yǎng)16 h。挑單個菌落分別接種于含四環(huán)素和含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，劇烈振蕩過夜，用蓋寧微量質(zhì)粒提取試劑盒提取pBRTMHCV13011及pGEM3Z。M：Marker;

8、1：pBRTMHCV13011圖1 pBRTMHCV13011質(zhì)粒（略）Fig.1 pBRTMHCV13011 plasmid1.4.2 HCV核心基因的PCR擴(kuò)增用PCR方法以pBRTMHCV1301l質(zhì)粒為模板擴(kuò)增HCV 核心基因序列，在上游引入EcoRI酶切位點(diǎn)，并在下游引入BamHI酶切位點(diǎn)，并在兩端各加入3個保護(hù)堿基。PCR的反應(yīng)程序如下：94 變性5 min，94 45 s，55 45 s，72 聚合延伸反應(yīng)5 min，共循環(huán)30次。PCR產(chǎn)物經(jīng)DNA片段純化試劑盒清潔。1.4.3 克隆載體的構(gòu)建先用EcoRI、HindIII分別酶切HCV 核心基因片段（PCR回收產(chǎn)物）和pGEM

9、3Z克隆載體，經(jīng)37 酶切過夜后用DNA片段純化試劑盒清潔酶切產(chǎn)物。然后將經(jīng)雙酶切的pGEM3Z克隆載體與HCV core片段16連接過夜。最后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化JM109感受態(tài)大腸桿菌，于37 恒溫培養(yǎng)1620 h，觀察結(jié)果。1.4.4 克隆載體的鑒定經(jīng)氨芐青霉素培養(yǎng)基篩選，挑取克隆行EcoRI、HindIII雙酶切以及瓊脂糖電泳篩選出含有HCV核心蛋白基因片段大小的陽性克隆。陽性克隆者送英俊生物公司測序。2 結(jié)果 2.1 質(zhì)粒的擴(kuò)增及純化質(zhì)粒pBRTMHCV13011是由HCV全長基因（9.6 kb）和pBR322載體(4 361 bp)重組形成的質(zhì)粒，大小約為13 961 bp,如圖1所示。

10、pGEM3Z克隆載體大小為2 743 bp, 如圖2所示。2.2 HCV核心基因的PCR擴(kuò)增PCR擴(kuò)增的HCV核心蛋白基因序列約為582 bp(由于HCV core序列為573 bp，再加保護(hù)堿基和酶切位點(diǎn)9 bp共582 bp)，PCR擴(kuò)增結(jié)果見圖3。M：Marker; 1：pGEM3Z質(zhì)粒圖2 pGEM3Z質(zhì)粒（略）Fig.2 pGEM3Z plasmidM：Marker DL2000; 1：PCR results of core gene圖3 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的凝膠電泳圖譜（略）Fig.3 Agarose gel electrophoresis of PCR amplification o

11、f core gene2.3 pGEMHCV/core的構(gòu)建core片段經(jīng)酶切、連接已成功克隆到載體pGEM3Z中，構(gòu)建了重組質(zhì)粒pGEMHCV/core（圖4）。2.4 pGEMHCV/core的鑒定用EcoRI和HindIII限制內(nèi)切酶對重組質(zhì)粒pGEMHCV/core酶切鑒定顯示插入片段與HCV核心蛋白基因片段大小相符 (圖5)。用T7和Sp6引物對克隆片段進(jìn)行DNA序列 分析 ，測序結(jié)果證實(shí)插入片段確為HCV 核心蛋白基因序列，含有573個核苷酸。M: Marker; 1:plasmid pGEMHCV/core圖4 構(gòu)建成功的質(zhì)粒pGEMHCV/core（略）Fig.4 Constr

12、uction of plasmid pGEMHCV/core1: PGEM3Zcore; 2: PGEM3Zcore digested with EcoR I and Hind ；3.recycled core segment; M: Marker圖5 pGEMHCV/core酶切鑒定電泳圖譜（略）Fig.5 pGEMHCV/core digested with EcoR I and Hind3 討論  HCV核心蛋白是丙肝病毒的重要結(jié)構(gòu)蛋白，它在病毒增殖和感染、慢性致病、肝細(xì)胞癌變、免疫功能障礙中起重要作用1。已有 研究 證明：HCV 核心蛋白基因在丙肝病毒的復(fù)制及增殖起

13、著重要作用：HCV核心蛋白在病毒衣殼包裝中起關(guān)鍵作用2，HCV核心蛋白是產(chǎn)生感染性病毒顆粒的必要因素之一3。HCV多呈長期慢性感染，HCV核心蛋白起極其重要的作用。慢性HCV核心蛋白能通過下調(diào)抗原提呈細(xì)胞的主要組織抗原和共刺激分子的表達(dá)同時誘導(dǎo)IL10性T細(xì)胞生成而抑制由樹突狀細(xì)胞誘導(dǎo)的特異性CD4+ 和 CD8+T細(xì)胞免疫反應(yīng)4，而致使丙肝病毒在體內(nèi)不易被清除而呈慢性感染。最近研究還發(fā)現(xiàn)：HCV核心蛋白能通過下調(diào)干擾素介導(dǎo)的抗病毒基因表達(dá)致使機(jī)體HCV病毒在體內(nèi)長期慢性感染5。在近年關(guān)于HCV致瘤性的研究中，核心蛋白被證明可與PA28（一種核蛋白酶）聯(lián)合作用致使肝細(xì)胞變性、壞死甚至癌變等6；

14、核心蛋白可刺激體內(nèi)NO的形成，而NO早已被認(rèn)為造成和促進(jìn)DNA突變的重要因素，這無疑更突出了核心蛋白與HCV致癌機(jī)制的重要聯(lián)系。HCV核心蛋白通過下調(diào)白細(xì)胞介素2而誘導(dǎo)機(jī)體無免疫反應(yīng)狀態(tài)7，并還可上調(diào) 影響 T細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的無反應(yīng)基因和新異基因表達(dá)8，致使機(jī)體免疫功能障礙。HCV感染是我國慢性病毒性肝炎的主要病原體之一，可導(dǎo)致肝硬化及肝癌等嚴(yán)重后果。由于其基因高度變異極易慢性化， 目前 尚無可防治丙型肝炎的有效 方法 。M1GS技術(shù)是近幾年快速 發(fā)展 起來的一種新型核酶反義技術(shù)9,10，M1GS由M1RNA及GS序列構(gòu)成。其中M1RNA是埃希大腸桿菌的RNase P RNA亞單位，能識別前體tR

15、NA的二級結(jié)構(gòu)而特異切割5端前導(dǎo)序列，使之形成成熟的tRNA 5端。而GS則根據(jù)靶RNA設(shè)計而成，能與靶mRNA互補(bǔ)結(jié)合，形成類似前體tRNA的二級結(jié)構(gòu)，能引導(dǎo)M1RNA對靶RNA進(jìn)行靶向切割。因此M1GS能將靶RNA切割成為5端及3端產(chǎn)物。而核心蛋白是丙型肝炎病毒蛋白中最保守的蛋白之一，它在HCV病毒的復(fù)制、致病以及拮抗機(jī)體抗病毒起重要作用，因此通過EGS引導(dǎo)核糖核蛋白酶P在RNA水平阻斷HCV核心蛋白基因的表達(dá)為抗HCV 治療 提供了一條思路。本實(shí)驗(yàn)采用PGEM3Z克隆載體構(gòu)建了pGEMHCV/core載體。DNA測序結(jié)果顯示，載體插入的HCV 核心蛋白基因片段含有573個核苷酸，其讀碼框

16、和插入方向完全正確，保證了胞外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的正確性。此基因表達(dá)載體的成功構(gòu)建為EGS引導(dǎo)核糖核酸酶P靶向切割HCV核心蛋白RNA的研究打下基礎(chǔ)。此基因的胞外轉(zhuǎn)錄、胞外切割反應(yīng)等方面的工作我們正在進(jìn)行。【 參考  文獻(xiàn) 】 1 IRSHAD M, DHAR I.Hepatitis C virus core protein: an update on its molecular biology, cellular functions and clinical implicationsJ.Med Princ Pract,2006,15(6):405-416.2 KLEIN K C,

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18、ues essential for production of infectious virusJ.J Virol,2007,81(19):10220-10231.4 ZIMMERMANN M, FLECHSIG C, LA MONICA N. Hepatitis C virus core protein impairs in vitro priming of specific T cell responses by dendritic cells and hepatocytesJ.J Hepatol,2008,48(1):51-60.5 MORI Y, MORIISHI K, MATSUUR

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