PCR的基本步驟及注意(20210125030742)

1、（DNApolymerase I ）最早于1955年發(fā)現(xiàn)，而較具有實驗價值及實用性的Klenowfragment of E. Coli 則是于70年代的初期由 Dr. H. Klenow 所發(fā)現(xiàn)，但由于此酶不耐高 溫，高溫能使之變性，因此不符合使用高溫變性的聚合酶鏈式反應(yīng)?，F(xiàn)今所使用的酶（簡稱Taqpolymerase）, 則是于1976年從溫泉中的（ Thermusaquaticus ）分離出來的。它的特性就在于能 耐高溫，是一個很理想的酶，但它被廣泛運用則于80年代之后。PCR最初的原始雛形概念是類似修復(fù)復(fù)制，它是于 1971年由Dr. Kjell Kleppe提出。他發(fā)表了第一個單純且短

2、暫復(fù)制（類似PCR前兩個周期反應(yīng)）的實驗。而現(xiàn)今所發(fā)展出來的PCR則于1983由Dr. Kary B. Mullis 發(fā)展出的，Dr. Mullis當(dāng)年服務(wù)于 PE公司，因此 PE公司在 PCR界有著特殊的地位。Dr. Mullis 并于1985年與Saiki等人正式發(fā)表了第一篇相關(guān)的論文。此后，PCR的運用一日千里，相關(guān)的論文發(fā)表質(zhì)量可以說是令眾多其它研究方法難望其項背。隨后PCR技術(shù)在生物科研和臨床應(yīng)用中得以廣泛應(yīng)用，成為分子生物學(xué)研究的最重要技術(shù)。Mullis 也因此獲得了 1993年化學(xué)獎。PCR原理DNA的是生物進化和傳代的重要途徑。雙鏈DNA在多種酶的作用下可以變性成單鏈，在DNA

3、聚合酶的參與下，根據(jù)復(fù)制成同樣的兩分子挎貝。在實驗中發(fā)現(xiàn)，DNA在高溫時也可以發(fā)生變性解鏈，當(dāng)溫度降低后又可以復(fù)性成為雙鏈。因此，通過溫度變化控制DNA的變性和復(fù)性，加入設(shè)計，DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的體外復(fù)制。但是，DNA聚合酶在高溫時會失活，因此，每次循環(huán)都得加入新的DNA聚合酶，不僅操作煩瑣，而且價格昂貴，制約了PCR技術(shù)的應(yīng)用和發(fā)展。發(fā)現(xiàn)耐熱 DNA聚合酶-Taq酶對于PCR的應(yīng)用有里程碑的意義，該酶可以耐受90 c以上的高溫而不失活，不需要每個循環(huán)加酶，使PCR技術(shù)變得非常簡捷、同時也大大降低了成本，PCR技術(shù)得以大量應(yīng)用，并逐步應(yīng)用于臨床。PCR技術(shù)的基本原理類似于

4、DNA的天然復(fù)制過程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補的寡核背酸引物。PCR由變性-退火-延伸三個基本反應(yīng)步驟構(gòu)成：模板 DNA的變性：模板 DNA經(jīng)加熱至 93 c左右一定時間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng) PCR擴增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準備；模板DNA與引物的退火（復(fù)性）：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55 c左右，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結(jié)合；引物的延伸：DNA模板-引物結(jié)合物在的作用下，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板 DNA鏈互補的半保留復(fù)制鏈，重復(fù)循環(huán)變性 -退火-延伸三過程就可獲得更

5、多的“半 保留復(fù)制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個循環(huán)需24分鐘，23小時就能將待擴擴增放大幾百萬倍。 PCR反應(yīng)體系與反應(yīng)條件1 .標準的PCR反應(yīng)體系10 X擴增緩沖液4種dNTP昆合物200 g l引物10 100 g l2Vg模板DNATaq DNA聚合酶g lMg2+L加雙或三蒸水100glPCR反應(yīng)五要素：參加PCR反應(yīng)的物質(zhì)主要有五種即：引物（PCR引物為DNA片段，細胞內(nèi) DNA復(fù)制的引物為一段RNA鏈）、酶、dNTP、模板和緩沖液（其中需要 Mg2+） o引物有多種設(shè)計方法，與PCR在實驗中的目的決定。但基本原則相同PCR所用的酶主要有兩種來源：Taq和P

6、fu。分別來自兩種不同的噬熱菌。其中 Taq擴增效率高但易發(fā)生錯配。Pfu擴增效率弱但有糾錯功能。所以實際使用時根據(jù)需要必須做不同的選擇模板即擴增用的DNA,可以是任何來源，但有兩個原則，第一純度必須較高，第二濃度不能太高以免抑制緩沖液的成分最為復(fù)雜，除水外一般包括四個有效成分：緩沖體系，一般使用HEPES或MOPS緩沖體系；一價陽離子，一般采用鉀離子，但在特殊情況下也可使用鏤根離子；二價陽離子，即 鎂離子，根據(jù)反應(yīng)體系確定，除特殊情況外不需調(diào)整；輔助成分，常見的有 DMSO甘油等，主要用來保持酶的活性和幫助DNA接觸纏繞結(jié)構(gòu)2、PCR引物設(shè)計PCR反應(yīng)中有兩條引物，即5端引物和 3引物。設(shè)計

7、引物時以一條DNA單鏈為基準（常以信息鏈為基準），5端引物與位于待擴增片段5端上游的一小段DNA序列相同；3端引物與位于待擴增片段 3 端的一小段 DNA序列互補。引物設(shè)計的基本原則引物長度：15-30bp ,常用為 20bp左右。引物堿基：G+C含量以40-60%為宜，G+C太少擴增效果不佳，G+C過多易出現(xiàn)非特異條帶。ATGC最好隨機分布，避免5個以上的嗯吟或的成串排列。引物內(nèi)部不應(yīng)出現(xiàn)互補序列。兩個引物之間不應(yīng)存在互補序列，尤其是避免3 端的互補重疊。引物與非特異擴增區(qū)的序列的同源性不要超過70%,引物3末端連續(xù) 8個堿基在待擴增區(qū)以外不能有完全互補序列，否則易導(dǎo)致非特異性擴增。引物3

8、端的堿基，特別是最末及倒數(shù)第二個堿基，應(yīng)嚴格要求配對，最佳選擇是G和Co引物的5 端可以修飾。如附加限制酶位點，引入突變位點，用生物素、熒光物質(zhì)、地高 辛標記，加入其它短序列，包括起始密碼子、終止密碼子等。v引物設(shè)計軟件Primer （自動搜索）*vOligo6 （引物評價）vVector NTI SuitvDNAsisvOmigavDNAstarvPrimer3(在線服務(wù))3、模板的制備PCR的模板可以是 DNA,也可以是 RNA模板的取材主要依據(jù)PCR的擴增對象，可以是病原體標本如病毒、細菌、真菌等。也可以是病理生理標本如細胞、血液、羊水細胞等。法醫(yī)學(xué)標本有血斑、精斑、毛發(fā)等。標本處理的基

9、本要求是除去雜質(zhì)，并部分純化標本中的核酸。多數(shù)樣品需要經(jīng)過SDS和蛋白酶K處理。難以破碎的細菌，可用溶菌酶加EDTA處理。所得到的粗制DNA經(jīng)酚、氯仿抽提純化，再用乙醇沉淀后用作PCR反應(yīng)模板。4、PCR反應(yīng)條件的控制PCR反應(yīng)的緩沖液提供合適的酸堿度與某些離子鎂離子濃度總量應(yīng)比dNTPs的濃度高，常用 L底物濃度 dNTP以等摩爾濃度配制， 20200umol/LTaqDNA 聚合酶 (100ul )引物濃度一般為 L反應(yīng)溫度和循環(huán)次數(shù)變性溫度和時間95 , 30s退火溫度和時間低于引物Tm值5 c左右，一般在 4555c延伸溫度和時間72 , 1min/kb (10kb內(nèi))Tm 值=4(G

10、+C) +2(A+T)循環(huán)次數(shù)：一般為2530次。循環(huán)數(shù)決定 PCR擴增的產(chǎn)量。模板初始濃度低，可增加循環(huán)數(shù)以便達到有效的擴增量。但循環(huán)數(shù)并不是可以無限增加的。一般循環(huán)數(shù)為30個左右，循環(huán)數(shù)超過30個以后，DNA聚合酶活性逐漸達到飽和，產(chǎn)物的量不再隨循環(huán)數(shù)的增加而增加，出現(xiàn)了所 謂的“平臺期”。PCR步驟標準的PCR過程分為三步：變性(90C-96C):雙鏈 DNA模板在熱作用下，氫鍵斷裂，形成單鏈DNA2 .退火(25C-65C):系統(tǒng)溫度降低，引物與DNA模板結(jié)合，形成局部雙鏈。3.延伸(70C-75 C):在(在 72 c左右，活性最佳)的作用下，以dNTP為原料，從引物的5端-3端延伸

11、，合成與模板互補的DNA鏈。每一循環(huán)經(jīng)過變性、退火和延伸,DNA含量即增加一倍。現(xiàn)在有些 PCR因為擴增區(qū)很短，即使 Taq酶活性不是最佳也能在很短的時間內(nèi)復(fù)制完成，因 此可以改為兩步法，即退火和延伸同時在60C-65 c間進行，以減少一次升降溫過程，提高了反應(yīng)速度。PCR檢測PCR反應(yīng)擴增出了高的拷貝數(shù)，下一步檢測就成了關(guān)鍵。熒光素（，）染色是最常用的檢測手 段。電泳法檢測特異性是不太高的，因此引物兩聚體等非特異性的雜交體很容易引起誤判。但因 為其簡捷易行，成為了主流檢測方法。近年來以為代表的檢測方法，有逐漸取代電泳法的趨勢。PCR反應(yīng)特點特異性強PCR反應(yīng)的特異性決定因素為：引物與模板 D

12、NA特異正確的結(jié)合；堿基配對原則；Taq DNA聚合酶合成反應(yīng)的忠實性；靶基因的特異性與保守性。其中引物與模板的正確結(jié)合是關(guān)鍵。引物與模板的結(jié)合及引物鏈的延伸是遵循堿基配對原則 的。聚合酶合成反應(yīng)的忠實性及TaqDNA聚合酶耐高溫性，使反應(yīng)中模板與引物的結(jié)合（復(fù)性）可以在較高的溫度下進行，結(jié)合的特異性大大增加，被擴增的靶也就能保持很高的正確度。再通過選 擇特異性和保守性高的靶基因區(qū)，其特異性程度就更高。靈敏度高PCR產(chǎn)物的生成量是以指數(shù)方式增加的，能將（pg=10-12）量級的起始待測模板擴增到微克（Rg=-6）水平。能從100萬個細胞中檢出一個靶細胞；在病毒的檢測中， PCR的靈敏度可達 3

13、個RFU（）;在細菌學(xué)中最小檢出率為 3個細菌。簡便、快速PCR反應(yīng)用耐高溫的 Taq DNA聚合酶，一次性地將反應(yīng)液加好后，即在DNA擴增液和水浴鍋上進行變性-退火-延伸反應(yīng)，一般在 24小時完成擴增反應(yīng)。擴增產(chǎn)物一般用電泳分析，不一定要 用同位素，無放射性污染、易推廣。對標本的純度要求低不需要分離病毒或細菌及培養(yǎng)細胞，DNA粗制品及RNA均可作為擴增模板?？芍苯佑门R床標本如血液、體腔液、洗嗽液、毛發(fā)、細胞、活組織等DNA擴增檢測。PCR的循環(huán)參數(shù)1、預(yù)變性（Initial denaturation ） 模板DNA完全變性與 PCR酶的完全?活對PCR能否成功至關(guān)重要，建議加熱時間參考試劑說明書，一般未修飾的Taq酶激活時間為兩分鐘。2、循環(huán)中的變性步驟循環(huán)中一般 95 C, 30秒足以使各種靶DNA序列完全變性，可能的情況下可縮短該步驟時間變性時間過長損害酶活性，過短靶序列變性不徹底，易造成擴增失敗。3、引物退火(Primer annealing )退火溫度需要從多方面去決定，一般根據(jù)引物的Tm值為參考，根據(jù)擴增的長度適當(dāng)下調(diào)作為退火溫度。然后在此次實驗基礎(chǔ)上做出預(yù)估。退火溫度對 PCR的特異性有較大影響。4、引物延伸引物延伸一般在 72 c進行(Taq酶最適溫度