食品生物技術(shù)復(fù)習(xí)題(完整答案版)

1、一 基因工程與食品（一） 名詞解釋1.基因工程：是指將目的基因通過(guò)體外重組后導(dǎo)入受體細(xì)胞內(nèi)，使這個(gè)基因能在受體細(xì)胞內(nèi)復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯表達(dá)的技術(shù)。2.限制酶：是一類能夠識(shí)別雙鏈DNA分子中某種特定核苷酸序列并由此切割DNA雙鏈結(jié)構(gòu)的核酸內(nèi)切酶。3.DNA連接酶：是一種能在ATP或NAD+存在下催化雙鏈DNA片段緊靠在一起的3羥基末端與5磷酸基團(tuán)末端之間形成磷酸二酯鍵，使兩末端連接起來(lái)的酶。4.DNA聚合酶：能夠催化DNA復(fù)制和修復(fù)DNA分子損傷的一類酶，可在其催化下進(jìn)行DNA體外合成反應(yīng) DNA修飾酶：這類酶能對(duì)DNA分子進(jìn)行一些比如3末端加dNTP或5末端添加/脫除磷酸基團(tuán)等等的修飾 T4噬菌

2、體多核苷酸激酶：是一種能催化-磷酸從ATP分子轉(zhuǎn)移給DNA或RNA分子的5-OH末端的酶，它對(duì)底物分子長(zhǎng)度沒(méi)有限制。5.堿性磷酸酶：這種酶能催化核酸分子脫掉5磷酸基團(tuán)，從而使DNA或RNA片段的5-P末端轉(zhuǎn)換成5-OH末端6.啟動(dòng)子：是指一段能被宿主RNA聚合酶特異性識(shí)別和結(jié)合并指導(dǎo)目的基因轉(zhuǎn)錄的DNA序列，是基因表達(dá)調(diào)控的重要元件。 8.終止子：是指一段終止RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄的DNA序列，分為本征終止子和依賴終止信號(hào)的終止子。 11.克隆載體：是指能在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行自我復(fù)制的外源基因運(yùn)載體，如細(xì)菌質(zhì)粒、噬菌體、M13噬菌體及粘粒等。12.質(zhì)粒：是一些存在于微生物細(xì)胞染色體外的小型閉合環(huán)狀雙鏈DNA

3、分子，是能夠進(jìn)行獨(dú)立復(fù)制并保持恒定遺傳的復(fù)制子。 13.穿梭質(zhì)粒：是指一類由人工構(gòu)建的具有兩種不同復(fù)制起點(diǎn)和選擇標(biāo)記，因而可在兩種不同的寄主細(xì)胞中存活和復(fù)制，并可以攜帶外源DNA在不同物種的細(xì)胞間往返穿梭的質(zhì)粒載體。 14.粘粒載體：是一類人工構(gòu)建的含有DNA粘性末端cos序列和質(zhì)粒復(fù)制子的雜種質(zhì)粒載體。 15.噬菌粒：是指質(zhì)粒載體與M13噬菌體的基因間隔區(qū)重組而成的噬菌體載體，同時(shí)具有二者的復(fù)制起點(diǎn)。 16.感受態(tài)細(xì)胞：是指具有能夠接受外源DNA的生理狀態(tài)的受體細(xì)胞，一般處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后期，時(shí)間短暫，但經(jīng)氯化鈣等處理可使細(xì)胞進(jìn)入這一狀態(tài)。17.轉(zhuǎn)化：是指把帶有目的基因的重組質(zhì)粒DNA引入受體

4、細(xì)胞的過(guò)程。 18.轉(zhuǎn)染：是指將重組噬菌體DNA直接引入受體細(xì)胞的過(guò)程。 19.轉(zhuǎn)導(dǎo)：是指將重組噬菌體DNA包裝到噬菌體頭部成為有感染力的噬菌體顆粒，再以此噬菌體為載體，將頭部重組DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞中。 20.化學(xué)轉(zhuǎn)化法：對(duì)受體細(xì)胞經(jīng)過(guò)氯化鈣、氯化銣等化學(xué)試劑的處理，使細(xì)胞膜的通透性發(fā)生暫時(shí)性的改變從而使受體細(xì)胞進(jìn)入感受態(tài)，再經(jīng)過(guò)熱擊、冷凍等處理即可將外源DNA攝入。 21.電穿孔轉(zhuǎn)化法：是指利用脈沖電場(chǎng)將DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞的方法。 基因定點(diǎn)誘變：是在體外特異性地取代、插入或缺失DNA序列中任何一個(gè)特定堿基的技術(shù),包括盒式取代誘變、寡核苷酸引物誘變及PCR定點(diǎn)誘變等22.SD序列：Shine-

5、Dalgarno序列，即核糖體結(jié)合位點(diǎn)，是指原核基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)下游的一段DNA序列，它與核糖體16S rRNA特異配對(duì)而與宿主核糖體結(jié)合，對(duì)mRNA的翻譯起決定性作用。23. DNA體外重組：是指將目的基因（外源DNA片段）用DNA連接酶在體外連接到合適的載體DNA上形成重組DNA。24.抗生素抗性基因插入失活法：載體的抗藥性基因內(nèi)具有限制酶的識(shí)別位點(diǎn)，用某種限制酶消化并再此位點(diǎn)插入外源DNA時(shí)，抗藥性基因不再被表達(dá)，當(dāng)這個(gè)重組載體轉(zhuǎn)化宿主菌并在藥物選擇平板上培養(yǎng)時(shí)，根據(jù)對(duì)該藥物由抗性轉(zhuǎn)為敏感，便可篩選出重組轉(zhuǎn)化子。25.-半乳糖苷酶基因插入失活法：質(zhì)粒載體上LacZ基因編碼的-半乳糖苷酶N

6、端與受體細(xì)菌編碼的C端片段實(shí)現(xiàn)互補(bǔ)而具有酶活性，可在IPTG誘導(dǎo)下分解生色底物X-gal并形成藍(lán)色菌落，但當(dāng)外源片段插入質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)后，使-半乳糖苷酶的N端失活從而破壞互補(bǔ)，因此帶有重組質(zhì)粒的細(xì)菌將產(chǎn)生白色菌落，從而可依據(jù)菌落的顏色篩選出可能帶有重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子菌落。26.電鏡R-環(huán)檢測(cè)法：在分子雜交中，核酸探針與部分變性的雙鏈DNA分子中的互補(bǔ)單鏈形成雜合雙鏈，同時(shí)另一條單鏈向外突出，二者形成泡狀體，即R環(huán)結(jié)構(gòu)，可用電鏡直接觀察，從而可以檢測(cè)雙鏈DNA中是否含有目的序列。（二） 問(wèn)答題1. 基因工程載體必須滿足哪些基本條件？（1） 能獨(dú)立自主的復(fù)制（2） 能便利的加以檢測(cè)（3） 都能容易

7、進(jìn)入宿主細(xì)胞中去，也易從宿主細(xì)胞中分離純化出來(lái)。 2. 質(zhì)粒載體有什么特征，有哪些主要類型？特征： (1)染色體外的雙鏈環(huán)狀DNA分子 (2)大小為1200kb； (3)能獨(dú)立于染色體外進(jìn)行自我復(fù)制，每個(gè)細(xì)胞中可含10200個(gè)拷貝。 (4) 分高拷貝數(shù)和低拷貝數(shù)質(zhì)粒或窄宿主范圍和廣宿主范圍 (5)質(zhì)粒包含:復(fù)制起始區(qū)、選擇標(biāo)記基因和限制性核酸內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)主要類型：pBR322、pUC193. 噬菌體載體有哪些？攜帶能力分別有多大？入-噬菌體 DNA長(zhǎng)度約為48.5kb(分子量3.2×107)柯氏質(zhì)粒粘尾質(zhì)粒 其本身分子量小，如pHC79僅6.5kb，可容納40kb左右的DNA片段

8、。4. 什么是穿梭載體？復(fù)制型載體又稱穿梭載體: 能在兩種不同的生物體內(nèi)復(fù)制和往來(lái)穿梭的載體.5. 表達(dá)載體應(yīng)該具備什么條件？表達(dá)載體（Expression vector）具有克隆載體的基本元件（ori,Ampr,Mcs等）還具有轉(zhuǎn)錄/翻譯所必需的DNA順序的載體。為了有效的轉(zhuǎn)錄，必需有強(qiáng)大的能夠被宿主細(xì)胞識(shí)別的啟動(dòng)子，為了實(shí)現(xiàn)翻譯，克隆基因必需有合適的SDs和RbS。這樣一個(gè)基因表達(dá)需要的具有表達(dá)和調(diào)控能力的載體稱表達(dá)載體。6. 限制性內(nèi)切核酸酶的特點(diǎn)與使用注意事項(xiàng)有哪些？ 一類專門(mén)切割DNA的酶，它們能特異結(jié)合一段被稱為限制酶識(shí)別順序的特殊DNA序列。并切割dsDNA。 所謂限制（rest

9、riction）=切割（clearage）=水 解（hydrolysis）該部位的核苷鍵（磷酸二酯鍵）限制酶都是從原核生物中發(fā)現(xiàn)的（400多種E/350M）。所有的限制酶可分成3類。 （1）、型，兼具限制與修飾活性，它們識(shí)別與切割順序不在一個(gè)地方，不產(chǎn)生特異性的DNA片段，與基因工程意義不大（有說(shuō)型識(shí)別核苷酸切割的位點(diǎn)一致，但罕見(jiàn)）。 （2）型 基因工程說(shuō)到的限制酶是型酶，具有此類酶的微生物限制修飾系統(tǒng)分別由限制酶和甲基化酶來(lái)完成。型酶分子量小，僅需Mg2作為催化反應(yīng)的輔因子，識(shí)別與切割位點(diǎn)相同，產(chǎn)生特異的DNA片段7 如何將不同DNA 分子末端進(jìn)行連接？ 1） T4 DNA連接酶2） 用末端

10、核苷酸轉(zhuǎn)移酶給平末端加上同聚物尾巴之后，再用DNA連接酶連接。 常用的連接方法： 同聚物加尾法 銜接物法 接頭連接法 8. 堿性磷酸酶有什么作用？該酶用于脫去DNA（RNA）5末端的磷酸根，使5-P成為5-OH，該過(guò)程稱核酸分子的脫磷酸作用。當(dāng)需要5端同位素標(biāo)記或?yàn)榱吮苊釪NA片段自身連接（或環(huán)化）時(shí)可進(jìn)行脫磷酸反應(yīng)。 9. 末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶有哪些作用？能催化5脫氧核苷三磷酸進(jìn)行53方向的聚合作用，逐個(gè)地將脫氧核苷酸分子加到線性DNA分子的3-OH末端。它不需要模板，可以用含有的3-OH片段為引物，在3-OH端加入核苷酸達(dá)幾百個(gè)。 它作用的底物可以是具有3-OH 末端的單鏈DNA, 也可以

11、是具有3-OH突出末端的雙鏈DNA10. 在基因工程研究和應(yīng)用中，為什么必須使用載體來(lái)克隆外源DNA 片段？要把一個(gè)有用的基因（目的基因研究或應(yīng)用基因）通過(guò)基因工程手段送到生物細(xì)胞（受體細(xì)胞），需要運(yùn)載工具（交通工具）攜帶外源基因進(jìn)入受體細(xì)胞，這種運(yùn)載工具就叫做載體（vector）。11. 分析影響限制性內(nèi)切核酸酶酶切的因素有哪些？1.) 反應(yīng)溫度： 連接缺口的溫度：37度 連接粘性末端的最佳溫度： 415度2.)連接酶的用量： 平末端DNA分子的連接反應(yīng)中，最適12個(gè)單位。 粘性末端DNA片斷之間的連接，酶濃度0.1個(gè)單位 ATP的用量10mol-1mmol/L之間3.) 提高外源片斷與載體

12、的濃度的比值（1020倍）12 什么是基因組文庫(kù)法？其構(gòu)建方法是怎樣的？ 采用限制性酶將基因組DNA切成片段，每一DNA片段都與一個(gè)載體分子拼接成重組DNA。將所有的重組DNA分子都引入宿主細(xì)胞并進(jìn)行擴(kuò)增，得到分子克隆的混合體。簡(jiǎn)單的說(shuō)就是匯集某一基因組所有序列的重組群體以噬菌體和柯斯質(zhì)粒為載體構(gòu)建 其具體的構(gòu)建方法：1）從生物體提取大片斷的基因組DNA；2）用適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶（常為4堿基識(shí)別位點(diǎn)）進(jìn)行部分酶切或超聲波打斷基因組DNA ；3）在瓊脂凝膠電泳上或蔗糖梯度離心篩選適當(dāng)長(zhǎng)度的DNA片斷（根據(jù)載體的要求）； 4）載體的酶切、回收；5）將處理好的基因組DNA片斷與載體連接；6）將重組子

13、導(dǎo)入宿主細(xì)胞7）文庫(kù)的鑒定、收集、保存；13. 什么是cDNA文庫(kù)法？它的構(gòu)建流程是什么？cDNA：指體外用逆轉(zhuǎn)錄酶催化，以mRNA為模板合成的互補(bǔ)DNA。cDNA文庫(kù)：匯集某生物成熟mRNA為模板逆轉(zhuǎn)錄而成cDNA序列的的重組群體噬菌體和質(zhì)粒為載體構(gòu)建操作程序）總RNA的提?。蛔⒁庖种泼傅幕钚?，鹽酸胍，二乙基焦碳酸）mRNA的分離：選用高度分化的組織，末端帶有poly A.）cDNA雙鏈的合成： ）cDNA與載體的連接）噬菌體的包裝以及轉(zhuǎn)染或質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化14. 構(gòu)建cDNA 文庫(kù)需要用到哪些工具酶？ 逆轉(zhuǎn)錄酶，DNA聚合酶I，單鏈核酸酶 S1，末端轉(zhuǎn)移酶，限制性核酸內(nèi)切酶，DNA連接酶 15.

14、合成cDNA 第二條鏈有哪些方法?合成 cDNA 第二條鏈有兩種方法。一種方法是利用 cDNA 第一鏈的 3' 末端常常出現(xiàn)發(fā)夾環(huán)的特征，這種發(fā)夾結(jié)構(gòu)是反轉(zhuǎn)錄酶在第一鏈末端“返折”并且進(jìn)行復(fù)制第一鏈的結(jié)果，它為合成 cDNA 第二鏈提供了有用的引物。用這種方法合成的雙鏈 cDNA 在一端有一個(gè)發(fā)夾環(huán)，可以用單鏈特異的 S1 核酸酶切去。但是 S1 核酸酶的處理，常常會(huì)“修剪 ” 過(guò)多的 cDNA 順序，使 cDNA 丟失了 mRNA 5' 端的部分順序。 另一種方法是用大腸桿菌的 RNase H 進(jìn)行修飾。 RNase H 能識(shí)別 RNA-DNA 雜交分子并把其中的 RNA 切

15、割成短的片段，這些 RNA 短片段仍與 cDNA 第一鏈結(jié)合，可被新合成的 DNA 所取代。新合成的 DNA 存在切口，用 DNA 連接酶把這些切口連接在一起形成一條完整的 DNA 鏈。 RNase H 法優(yōu)于 S1 核酸酶法，它能獲得包括 mRNA 5' 端全部或絕大部分的更長(zhǎng)順序 cDNA 分子。 二 發(fā)酵工程1、 什么是種子的擴(kuò)大培養(yǎng)？將保存的處于休眠狀態(tài)的生產(chǎn)菌種接入到試管斜面活化后,再經(jīng)過(guò)茄子瓶或搖瓶以及種子罐擴(kuò)大培養(yǎng)而獲得一定數(shù)量和質(zhì)量的純種過(guò)程2， 什么是培養(yǎng)基?培養(yǎng)基的配置原則定義: 一種人工配制的, 供微生物生長(zhǎng)繁殖和形成代謝產(chǎn)物用的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)物質(zhì).培養(yǎng)基的配制原則：a

16、根據(jù)不同微生物的營(yíng)養(yǎng)需要配制不同的培養(yǎng)基b注意速效碳（氮）源和緩效碳（氮）源的配合使用，發(fā)揮各自的優(yōu)勢(shì)c營(yíng)養(yǎng)成分的恰當(dāng)配比（C/N一般取100 : 0.22.0）d滲透壓，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)要有合適的濃度e合適的pH值（注意生理酸性鹽、生理堿性鹽和緩沖劑的加入）f氧化還原電位g考慮營(yíng)養(yǎng)成分的加入順序，避免生產(chǎn)沉淀 3、 什么是前體？某些化合物加到發(fā)酵培養(yǎng)基中，能直接被微生物在生物合成過(guò)程結(jié)合到產(chǎn)物分子中去，而其自身結(jié)構(gòu)并沒(méi)有多大變化，但產(chǎn)物的量卻因加入而有較大的提高。有些氨基酸、核苷酸和抗生素發(fā)酵必須添加前體物質(zhì)才能獲得較高的產(chǎn)率。4、 什么是生長(zhǎng)因子？生長(zhǎng)因子的來(lái)源？從廣義來(lái)說(shuō)，凡是微生物生長(zhǎng)不可缺少

17、的微量有機(jī)物質(zhì)，如氨基酸、嘌呤、嘧啶、維生素等均稱為生長(zhǎng)因子。其功能是構(gòu)成細(xì)胞的組成分，促進(jìn)生命活動(dòng)的進(jìn)行。生長(zhǎng)因子不是所有微生物都必需的，它只是對(duì)于某些自己不能合成這些成分的微生物才是必不可少的營(yíng)養(yǎng)物。提供生長(zhǎng)因子的農(nóng)副產(chǎn)品原料：1）玉米漿2）麩皮水解液3）糖蜜4）酵母：可用酵母膏、酵母浸出液或直接用酵母粉。5、種子擴(kuò)大培養(yǎng)的目的與要求及一般步驟？ （1）目的：其任務(wù)是要得到純而壯的培養(yǎng)物，獲得活力旺盛的、接種數(shù)量足夠的培養(yǎng)物。 （2）種子的要求 菌種細(xì)胞的生長(zhǎng)活力強(qiáng)，轉(zhuǎn)種至發(fā)酵罐后能迅速生長(zhǎng)，延遲期短。 菌種生理狀態(tài)穩(wěn)定，如菌絲形態(tài)、菌絲生長(zhǎng)速率和種子培養(yǎng)液的特性等符合要求。 菌體濃度及總

18、量能滿足大容量發(fā)酵罐接種量的要求。 無(wú)雜菌污染，保證純種發(fā)酵。 菌種適應(yīng)性強(qiáng)，能保持穩(wěn)定的生產(chǎn)能力。 （3）一般步驟：休眠孢子母斜面活化搖瓶種子或茄子瓶斜面或固體培養(yǎng)基孢子一級(jí)種子罐二級(jí)種子罐發(fā)酵罐6. 泡沫對(duì)發(fā)酵有哪些有益之處，哪些有害之處？少量泡沫的作用：（有益之處）一定數(shù)量的泡沫是正常現(xiàn)象，可以增加氣液接觸面積，導(dǎo)致氧傳遞速率增加；大量的泡沫引起許多負(fù)作用：（有害之處）發(fā)酵罐的裝料系數(shù)減少、氧傳遞系統(tǒng)減小；增加了菌群的非均一性；造成大量逃液，增加染菌機(jī)會(huì)；嚴(yán)重時(shí)通氣攪拌無(wú)法進(jìn)行，菌體呼吸受到阻礙，導(dǎo)致代謝異?；蚓w自溶；消泡劑的添加將給提取工序帶來(lái)困難。7、 什么是接種量？對(duì)于細(xì)菌、放線

19、菌及霉菌常用的接種量是多少？接種量移入種子的體積/接種后培養(yǎng)液的體積 細(xì)菌5、放線菌20 霉菌10%8、 什么是發(fā)酵級(jí)數(shù)？發(fā)酵級(jí)數(shù)對(duì)發(fā)酵有何影響，影響發(fā)酵級(jí)數(shù)的因素有哪些？一般由菌絲體培養(yǎng)開(kāi)始計(jì)算發(fā)酵級(jí)數(shù)，但有時(shí)，工廠從第一級(jí)種子罐開(kāi)始計(jì)算發(fā)酵級(jí)數(shù) 谷氨酸：三級(jí)發(fā)酵 一級(jí)種子（搖瓶）二級(jí)種子 （小罐）發(fā)酵 青霉素：三級(jí)發(fā)酵 一級(jí)種子 （小罐）二級(jí)種子（中罐）發(fā)酵 1、發(fā)酵級(jí)數(shù)確定的依據(jù)：級(jí)數(shù)受發(fā)酵規(guī)模、菌體生長(zhǎng)特性、接種量的影響。 2、級(jí)數(shù)大，難控制、易染菌、易變異，管理困難，一 般2-4級(jí)。 3、 在發(fā)酵產(chǎn)品的放大中，反應(yīng)級(jí)數(shù)的確定是非常重要的一個(gè)方面 種子罐種子制備的工藝過(guò)程，因菌種不同而

20、異，一般可分為一級(jí)種子、二級(jí)種子和三級(jí)種子的制備。 孢子(或搖瓶菌絲)被接入到體積較小的種子罐中，經(jīng)培養(yǎng)后形成大量的菌絲，這樣的種子稱為一級(jí)種子. 把一級(jí)種子轉(zhuǎn)入發(fā)酵罐內(nèi)發(fā)酵，稱為二級(jí)發(fā)酵。如果將一級(jí)種子接入體積較大的種子罐內(nèi)，經(jīng)過(guò)培養(yǎng)形成更多的菌絲，這樣制備的種子稱為二級(jí)種子.將二級(jí)種子轉(zhuǎn)入發(fā)酵罐內(nèi)發(fā)酵，稱為三級(jí)發(fā)酵。同樣道理，使用三級(jí)種子的發(fā)酵，稱為四級(jí)發(fā)酵9、影響微生物需氧的因素有哪些？ 如何調(diào)節(jié)搖瓶發(fā)酵的供氧水平？如何調(diào)節(jié)通氣攪拌發(fā)酵罐的供氧水平？影響微生物需氧的因素：（1）培養(yǎng)基的成分和濃度（2）菌齡（3）發(fā)酵條件a調(diào)節(jié)攪拌轉(zhuǎn)速或通氣速率來(lái)控制供氧；b控制補(bǔ)料速度來(lái)控制基質(zhì)的濃度，從

21、而達(dá)到最適的菌體濃度，保證產(chǎn)物的比生長(zhǎng)速率維持在最大值，又不會(huì)使需氧大于供氧。c采用調(diào)節(jié)溫度（降低培養(yǎng)溫度可提高溶氧濃度）、液化培養(yǎng)基、中間補(bǔ)水、添加表面活性劑等工藝措施，來(lái)改善溶氧水平。如何調(diào)節(jié)搖瓶發(fā)酵的供氧水平？ 往復(fù)，頻率80-120分/次，振幅 8cm 旋轉(zhuǎn)，偏心距轉(zhuǎn)速250rpm 裝液量，一般取1/10左右：250ml 15-25 ml 500ml 30 ml750ml 80 ml如何調(diào)節(jié)通氣攪拌發(fā)酵罐的供氧水平？ 一般認(rèn)為，發(fā)酵初期較大的通風(fēng)和攪拌而產(chǎn)生過(guò)大的剪切力，對(duì)菌體的生長(zhǎng)有時(shí)會(huì)產(chǎn)生不利的影響，所以有時(shí)發(fā)酵初期采用小通風(fēng)，停攪拌，不但有利于降低能耗，而且在工藝上也是必須的。但

22、是通氣增大的時(shí)間一定要把握好。10、pH對(duì)發(fā)酵的影響表現(xiàn)在哪些方面？ 發(fā)酵過(guò)程的pH控制可以采取哪些措施？Ph對(duì)發(fā)酵的影響表現(xiàn)：1）影響酶的活性，當(dāng)pH值抑制菌體中某些酶的活性時(shí)，會(huì)阻礙菌體的新陳代謝；2）影響微生物細(xì)胞膜所帶電荷的狀態(tài)，改變細(xì)胞膜的通透性，影響微生物對(duì)營(yíng)養(yǎng)物的吸收和代謝產(chǎn)物的排泄；影響培養(yǎng)基中某些組分的解離，進(jìn)而微生物對(duì)這些成分的吸收；3）pH值不同，往往引起菌體代謝過(guò)程的不同，使代謝產(chǎn)物的質(zhì)量和比例發(fā)生改變。4）影響氧的溶解,氧化還原電位,營(yíng)養(yǎng)物的物理狀態(tài)等。發(fā)酵過(guò)程中的ph控制采取的措施：1）首先考慮和試驗(yàn)發(fā)酵培養(yǎng)基的基礎(chǔ)配方，使它們有個(gè)適當(dāng)?shù)呐浔?，使發(fā)酵過(guò)程中的pH值變

23、化在合適的范圍內(nèi)。2）在發(fā)酵過(guò)程中直接補(bǔ)加酸或堿和補(bǔ)料的方式來(lái)控制；補(bǔ)充生理酸性物質(zhì)（如(NH4)2SO4）和生理堿性物質(zhì)（如NaNO3）來(lái)控制。3）選用不同代謝速度的碳源和氮源種類和比例4）通過(guò)調(diào)整通氣量11、發(fā)酵過(guò)程溫度的選擇有什么依據(jù)？在生長(zhǎng)階段，應(yīng)選擇最適生長(zhǎng)溫度；在產(chǎn)物分泌階段，應(yīng)選擇最適生產(chǎn)溫度。發(fā)酵溫度可根據(jù)不同菌種、不同產(chǎn)品進(jìn)行選擇。12. 濕熱滅菌原理，采用高溫瞬時(shí)滅菌原因是什么。濕熱滅菌的原理：每一種微生物都有一定的最適生長(zhǎng)溫度范圍，當(dāng)微生物處于最低限溫度以下時(shí)，代謝作用幾乎停止而處于休眠狀態(tài)。當(dāng)溫度超過(guò)最高限度時(shí)，微生物細(xì)胞中的原生質(zhì)體和酶的基本成分蛋白質(zhì)發(fā)生不可逆的變化

24、，即凝固變性，使微生物在很短時(shí)間內(nèi)死亡。濕熱滅菌就是根據(jù)微生物的這種特性進(jìn)行的。【在同一溫度下，濕熱效力比干熱為大。 原因：（1）濕熱中細(xì)菌菌體蛋白較易凝固； （2）濕熱的穿透力比干熱大； （3）濕熱的蒸汽有潛熱存在。 】采用高溫瞬時(shí)滅菌的原因：由于滅菌時(shí)的活化能E大于培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)成分破壞的活化能E，因此，隨著溫度升高，滅菌速率常數(shù)增加的倍數(shù)>培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)成分分解的速率常數(shù)的增加倍數(shù)。即當(dāng)滅菌溫度升高時(shí)，微生物殺滅速度提高，超過(guò)了培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)成分破壞的速度。據(jù)測(cè)定，每升高10，速率常數(shù)的增加倍數(shù)為Q10。在熱滅菌的過(guò)程中，同時(shí)發(fā)生微生物死亡和培養(yǎng)基成分破壞兩個(gè)過(guò)程。溫度能加速其過(guò)程進(jìn)行的速度

25、，當(dāng)溫度升高時(shí)，微生物死亡的速度更快，因此可以采用較高的溫度，較短的滅菌時(shí)間，以減少培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)成分的破壞，這就是通常所說(shuō)的“高溫瞬時(shí)滅菌法”。13. 工業(yè)化菌種的要求？1）細(xì)胞或菌體 菌體形態(tài)、菌體濃度以及培養(yǎng)液的外觀。菌體形態(tài)可通過(guò)顯微鏡觀察來(lái)確定，以單細(xì)胞菌體為種子的質(zhì)量要求是菌體健壯、菌形一致、均勻整齊，有的還要求有一定的排列或形態(tài)。以霉菌、放線菌為種子的質(zhì)量要求是菌絲粗壯，對(duì)某些染料著色力強(qiáng)、生長(zhǎng)旺盛、菌絲分枝情況和內(nèi)含物情況良好。 菌體的生長(zhǎng)量也是種子質(zhì)量的重要指標(biāo)，生產(chǎn)上常用離心沉淀法、光密度法和細(xì)胞計(jì)數(shù)法等進(jìn)行測(cè)定。種子液外觀如顏色、黏度等也可作為種子質(zhì)量的粗略指標(biāo) 生化指標(biāo)種子

26、液的糖、氮、磷含量的變化和pH值變化是菌體生長(zhǎng)繁殖、物質(zhì)代謝的反映，不少產(chǎn)品的種子液質(zhì)量是以這些物質(zhì)的利用情況及變化為指標(biāo) 產(chǎn)物生成量種子液中產(chǎn)物的生成量是多種發(fā)酵產(chǎn)品發(fā)酵中考察種子質(zhì)量的重要指標(biāo)，因?yàn)榉N子液中產(chǎn)物生成量的多少是種子生產(chǎn)能力和成熟程度的反映。 酶活力測(cè)定種子液中某種酶的活力，作為種子質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)，是一種較新的方法。如土霉素生產(chǎn)的種子液中的淀粉酶活力與土霉素發(fā)酵單位有一定的關(guān)系，因此種子液淀粉酶活力可作為判斷該種子質(zhì)量的依據(jù)。 此外，種子應(yīng)確保無(wú)任何雜菌污染。 14. 什么叫自然選育？自然選育在工藝生產(chǎn)中的意義？自然選育就是不經(jīng)人工處理，利用微生物的自然突變進(jìn)行菌種選育的過(guò)程。自然

27、選育在工業(yè)生產(chǎn)上的意義：自然選育可以有效地用于高性能突變株的分離。自然選育雖然突變率很低，但卻是工廠保證穩(wěn)產(chǎn)高產(chǎn)的重要措施。15. 發(fā)酵生產(chǎn)用的碳源有哪些？常用的糖類有哪些，各自有何特點(diǎn)？在微生物發(fā)酵過(guò)程中，普遍以碳水化合物作為碳源。碳源來(lái)源葡萄糖純葡萄糖，水解淀粉乳糖純?nèi)樘?，乳清粉淀粉大麥，花生粉，燕麥粉，黑麥粉，大豆粉等蔗糖甜菜糖蜜，甘蔗糖蜜，粗紅糖，精白糖等生產(chǎn)疫苗時(shí)通常用牛血清蛋白、牛肉汁等蛋白質(zhì)作為碳源。酒精、簡(jiǎn)單的有機(jī)酸、烷烴等含碳物質(zhì)也可作為碳源。甲醇作為底物生產(chǎn)單細(xì)胞蛋白（SCP）用烷烴進(jìn)行有機(jī)酸、維生素等的生產(chǎn)網(wǎng)絡(luò)答案：碳源:糖類（淀粉、葡萄糖、蔗糖等）、油脂（動(dòng)、植物油）、

28、有機(jī)酸（琥珀酸、檸檬酸、乳酸、乙酸等）和低碳醇（甲醇、乙醇等）。 糖類:葡萄糖，所有的微生物都能利用葡萄糖，但是會(huì)引起葡萄糖效應(yīng)糖蜜，是制糖生產(chǎn)時(shí)的結(jié)晶母液，它是制糖工業(yè)的副產(chǎn)物。主要含有蔗糖，總糖可達(dá)50%75%。一般糖蜜分甘蔗糖蜜和甜菜糖蜜葡萄糖蜜。淀粉、糊精，缺點(diǎn)：難利用、發(fā)酵液比較稠、一般>2.0%時(shí)加入一定的-淀粉酶。成分比較復(fù)雜，有直鏈淀粉和支鏈淀粉等等。優(yōu)點(diǎn)：來(lái)源廣泛、價(jià)格低，可以解除葡萄糖效應(yīng)。16. 什么是生理性酸性物質(zhì)？什么是生理性堿性物質(zhì)？無(wú)機(jī)氮源被菌體作為氮源利用后，培養(yǎng)液中就留下了酸性或堿性物質(zhì)，這種經(jīng)微生物生理作用（代謝）后能形成酸性物質(zhì)的無(wú)機(jī)氮源叫生理酸性物

29、質(zhì)，如硫酸胺，若菌體代謝后能產(chǎn)生堿性物質(zhì)的則此種無(wú)機(jī)氮源稱為生理堿性物質(zhì)，如硝酸鈉。正確使用生理酸堿性物質(zhì)，對(duì)穩(wěn)定和調(diào)節(jié)發(fā)酵過(guò)程的pH有積極作用。17. 為何氧容易成為好氧發(fā)酵的限制性因素？氧是需氧微生物生長(zhǎng)所必需的。氧往往容易成為控制因素，是因?yàn)檠踉谒械娜芙舛群艿?，培養(yǎng)基因含有大量的有機(jī)和無(wú)機(jī)物質(zhì)，氧的溶解度比水中還要更低。在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期即使發(fā)酵液中的氧濃度達(dá)到飽和，若此時(shí)終止供氧，發(fā)酵液中的溶氧可在幾分鐘內(nèi)全部耗盡，使溶氧成為控制因素。18簡(jiǎn)述通用試發(fā)酵罐的結(jié)構(gòu)【通用式發(fā)酵罐：具有通氣和攪拌裝置的立式圓筒形發(fā)酵罐。是目前大生產(chǎn)中最常用的發(fā)酵罐。其容積可從幾升到幾百噸不等。包括罐體、攪拌系統(tǒng)

30、、傳熱系統(tǒng)、通氣系統(tǒng)。 （1）罐體 （2）攪拌系統(tǒng)包括：驅(qū)動(dòng)電機(jī)、攪拌軸；渦輪攪拌器、攪拌葉；擋板；軸封（端面軸封） （3）傳熱系統(tǒng)包括夾層傳熱、蛇管傳熱（一般有4組、6組、8組）。 （4）通氣系統(tǒng)包括單孔管、多孔環(huán)管】 通用式發(fā)酵罐的主要部件=罐體 攪拌器 擋板 軸封 空氣分布管 消泡器 冷卻管（或夾套）聯(lián)軸器 中間軸承 人孔 管路等19、 什么是種子的擴(kuò)大培養(yǎng)？種子擴(kuò)大培養(yǎng)是指將保存在砂土管、冷凍干燥管中處休眠狀態(tài)的生產(chǎn)菌種接入試管斜面活化后，再經(jīng)過(guò)扁瓶或搖瓶及種子罐逐級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng),最終獲得一定數(shù)量和質(zhì)量的純種過(guò)程。這些純種培養(yǎng)物稱為種子20、 種子擴(kuò)大培養(yǎng)的目的與要求、一般步驟？休眠孢子母

31、斜面活化搖瓶種子或茄子瓶斜面或固體培養(yǎng)基孢子一級(jí)種子罐二級(jí)種子罐發(fā)酵21、 在大規(guī)模發(fā)酵的種子制備過(guò)程中，為什么包括實(shí)驗(yàn)室階段和生產(chǎn)車(chē)間階段？實(shí)驗(yàn)室階段培養(yǎng)物選擇的原則：種子能擴(kuò)培到一定的量和質(zhì)，獲得一定數(shù)量和質(zhì)量的孢子/菌體。培養(yǎng)基的選擇應(yīng)該是有利于菌體的生長(zhǎng)，對(duì)孢子培養(yǎng)基應(yīng)該是有利于孢子的生長(zhǎng)。在原料方面，實(shí)驗(yàn)室種子培養(yǎng)階段，規(guī)模一般比較小，因此為了保證培養(yǎng)基的質(zhì)量，培養(yǎng)基的原料一般都比較精細(xì)。 生產(chǎn)車(chē)間階段培養(yǎng)物的選擇原則最終一般都是獲得一定數(shù)量的菌絲體。培養(yǎng)基選擇首先考慮的是有利于孢子的發(fā)育和菌體的生長(zhǎng)，所以營(yíng)養(yǎng)要比發(fā)酵培養(yǎng)基豐富。在原料方面：不如實(shí)驗(yàn)室階段那么精細(xì)，而是基本接近于發(fā)酵

32、培養(yǎng)基，這有兩個(gè)方面的原因: 一是成本二是馴化 22、 什么是接種量？            移入種子的體積 接種量               接種后培養(yǎng)液的體積23 什么是種齡？種齡確定的依據(jù)？種齡是指種子罐中培養(yǎng)的菌體開(kāi)始移入下一級(jí)種子罐或發(fā)酵罐時(shí)的培養(yǎng)時(shí)間。 原則：對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期末，細(xì)胞活力強(qiáng)，菌體濃度相對(duì)較大，但是最終由實(shí)驗(yàn)結(jié)果定。三 酶工程

33、1. 酶分離純化操作的一般程序和目的？：動(dòng)物、植物或微生物細(xì)胞細(xì)胞破碎發(fā)酵液酶提取酶分離純化酶濃縮酶貯存目的：將酶以外的所有的雜質(zhì)盡可能的除去。2. 如何檢查一種酶制劑是否達(dá)到了純的制劑？要檢測(cè)酶的制劑是否達(dá)到純的制劑（即不含雜質(zhì)及雜質(zhì)酶），可以有以下幾種方法： （1） 層析法：包括紙層析、凝膠層析、柱層析及親和層析 （2） 電泳法：包括SDS凝膠電泳法和聚丙烯酰胺凝膠電泳法 （3） 超離心法：不同的酶分子大小不同，在重力場(chǎng)中具有不同的沉降系數(shù)，從而可以通過(guò)超離心方法分離目的酶與雜質(zhì)酶。 （4） 免疫反應(yīng)法：由于酶分子可作為一種抗原物質(zhì)，而抗原與抗體之間具有專一的親和力，故可選用目的酶的抗體與

34、酶制劑進(jìn)行免疫擴(kuò)散或免疫電泳，從而判斷酶的制劑是否純凈。 （5） 氨基酸序列分析法：采用特定的化學(xué)物質(zhì)從酶的N末端將氨基酸殘基逐個(gè)水解下來(lái)，最終可獲知該酶的氨基酸序列，從而也可以判斷出酶制劑是否純凈。 3. 有三種酶蛋白，其相對(duì)分子質(zhì)量和等電點(diǎn)各不相同，試設(shè)計(jì)一個(gè)方案來(lái)分離純化這三種蛋白質(zhì)?！?、沉淀， 2、電泳：蛋白質(zhì)在高于或低于其等電點(diǎn)的溶液中是帶電的，在電場(chǎng)中能向電場(chǎng)的正極或負(fù)極移動(dòng)。根據(jù)支撐物不同，有薄膜電泳、凝膠電泳等。 3、透析：利用透析袋把大分子蛋白質(zhì)與小分子化合物分開(kāi)的方法。 4、層析：a.離子交換層析，利用蛋白質(zhì)的兩性游離性質(zhì)，在某一特定PH時(shí)，各蛋白質(zhì)的電荷量及性質(zhì)不同，故

35、可以通過(guò)離子交換層析得以分離。如陰離子交換層析，含負(fù)電量小的蛋白質(zhì)首先被洗脫下來(lái)。 b.分子篩，又稱凝膠過(guò)濾。小分子蛋白質(zhì)進(jìn)入孔內(nèi)，滯留時(shí)間長(zhǎng)，大分子蛋白質(zhì)不能時(shí)入孔內(nèi)而徑直流出。 5、超速離心：既可以用來(lái)分離純化蛋白質(zhì)也可以用作測(cè)定蛋白質(zhì)的分子量。不同蛋白質(zhì)其密度與形態(tài)各不相同而分開(kāi)。】4. 細(xì)胞破碎的目的、方法及原理。目的：許多酶存在于細(xì)胞內(nèi)。為了提取這些胞內(nèi)酶，首先需要對(duì)細(xì)胞進(jìn)行破碎處理。方法及原理：a機(jī)械破碎-通過(guò)機(jī)械運(yùn)動(dòng)產(chǎn)生的剪切力，使組織、細(xì)胞破碎。-搗碎法 研磨法勻漿法 b物理破碎-通過(guò)各種物理因素的作用，使組織、細(xì)胞的外層結(jié)構(gòu)破壞，而使細(xì)胞破碎。-溫度差破碎法 壓力差破碎法 超

36、聲波破碎法c化學(xué)破碎-通過(guò)各種化學(xué)試劑對(duì)細(xì)胞膜的作用，而使細(xì)胞破碎-有機(jī)溶劑：甲苯、丙酮 丁醇、氯仿 表面活性劑：Triton、Tweend酶促破碎-通過(guò)細(xì)胞本身的酶系或外加酶制劑的催化作用，使細(xì)胞外層結(jié)構(gòu)受到破壞，而達(dá)到細(xì)胞破碎-自溶法 外加酶制劑法5 常用沉淀法的種類及原理。鹽析法分離蛋白質(zhì)的原理。沉淀分離方法 分離原理【鹽析沉淀法】 利用不同蛋白質(zhì)在不同的鹽濃度條件下溶解度不同的特性，通過(guò)在酶液中添加一定濃度的中性鹽，使酶或雜質(zhì)從溶液中析出沉淀，從而使酶與雜質(zhì)分離【等電點(diǎn)沉淀法】利用兩性電解質(zhì)在等電點(diǎn)時(shí)溶解度最低，以及不同的兩性電解質(zhì)有不同的等電點(diǎn)這一特性，通過(guò)調(diào)節(jié)溶液的pH值，使酶或雜

37、質(zhì)沉淀析出，從而使酶與雜質(zhì)分離【有機(jī)溶劑沉淀法】利用酶與其它雜質(zhì)在有機(jī)溶劑中的溶解度不同，通過(guò)添加一定量的某種有機(jī)溶劑，使酶或雜質(zhì)沉淀析出，從而使酶與雜質(zhì)分離【復(fù)合沉淀法】在酶液中加入某些物質(zhì)，使它與酶形成復(fù)合物而沉淀下來(lái)，從而使酶與雜質(zhì)分離6 酶固定化后性質(zhì)會(huì)發(fā)生什么變化？原因是什么？水溶性酶與水不溶性載體通過(guò)固定化技術(shù)結(jié)合形成水不溶性酶。固定化酶的特點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：1.不溶于水，易于與產(chǎn)物分離； 2.可反復(fù)使用； 3.可連續(xù)化生產(chǎn)； 4.穩(wěn)定性好。缺點(diǎn)：固定化過(guò)程中往往會(huì)引起酶的失活網(wǎng)絡(luò)【1穩(wěn)定性一般比游離酶的穩(wěn)定性好如對(duì)熱的穩(wěn)定性、保存穩(wěn)定性、抵抗性、對(duì)變性及的耐受性等 2最適溫度一

38、般與游離酶差不多但是有些固定化酶的最適溫度與游離酶相比有比較明顯的變化 3最適pH值往往會(huì)發(fā)生變化需要引起注意。因素有兩個(gè)載體的帶電性質(zhì)和催化反應(yīng)產(chǎn)物的性質(zhì) 4底物特異性可能有所不同其變化與底物分子質(zhì)量的大小有一定關(guān)系。對(duì)于低分子量的底物變化前后不大。特異性的改變時(shí)由于載體空間位組作用引起的大分子底物難于接近酶而使催化速度大大減低】7 簡(jiǎn)述酶的提取方法及影響酶提取的主要因素。8試論述如何利用本章所學(xué)的各種分析技術(shù)對(duì)特定的蛋白酶進(jìn)行酶學(xué)性質(zhì)（如分子質(zhì)量、pI、帶電狀態(tài)、亞基組成、溶解性等）研究。9 層析在實(shí)驗(yàn)室和工業(yè)化生產(chǎn)中應(yīng)用很廣泛，何為層析？簡(jiǎn)述常用的三種層析分離方法的原理及適用范圍。層析技

39、術(shù)是近代生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)中常用的分析方法之一，任何層析過(guò)程都是在兩個(gè)相中進(jìn)行的。一是固定于支持物上的固定相，另一是流經(jīng)固定相的流動(dòng)相，由于樣品中各組分理化性質(zhì)（如溶解度、吸附能力、分子形狀、分子所帶電荷的性質(zhì)和數(shù)量、分子表面的特殊基團(tuán)、分子量等）不同，表現(xiàn)出對(duì)固定相和流動(dòng)相的親和力各不相同。當(dāng)混雜物通過(guò)多孔的支持物時(shí)，它們受固定相的阻力和受流動(dòng)相的推力也不同，各組分移動(dòng)速度各異并在支持物上集中分布于不同的區(qū)域，從而各組分得以分離。常用的層析分離方法吸附層析；分配層析；離子交換層析；凝膠層析；親和層析。10常用沉淀法的種類及原理。鹽析法分離蛋白質(zhì)的原理同511膜分離的種類、原理及應(yīng)用。膜分離-膜分離

40、所使用的薄膜主要是由丙烯腈、醋酸纖維素、賽璐玢以及尼龍等高分子聚合物制成的高分子膜。有時(shí)也可以采用動(dòng)物膜等。膜分離過(guò)程中，薄膜的作用是選擇性地讓小于其孔徑的物質(zhì)顆粒或分子通過(guò)，而把大于其孔徑的顆粒截留。膜的孔徑有多種規(guī)格可供使用時(shí)選擇。1加壓膜分離 -微濾 超濾 反滲透2電場(chǎng)膜分離 -電滲析 離子交換膜電滲析 3擴(kuò)散膜分離 -透析12比較吸附層析、疏水層析、離子交換層析、凝膠過(guò)濾、親和層析 在原理、層析介質(zhì)、操作及應(yīng)用方面的異同點(diǎn)。 層析方法 + 分離依據(jù) 吸附層析- 利用吸附劑對(duì)不同物質(zhì)的吸附力不同而使混合物中各組分分離?！疚綄游鍪抢梦絼?duì)不同物質(zhì)的吸附力不同而使混合物中各組分分離的方

41、法。吸附層析是各種層析技術(shù)中應(yīng)用最早的技術(shù)。吸附劑來(lái)源豐富、價(jià)格低廉、可再生，吸附設(shè)備簡(jiǎn)單。吸附層析通常采用柱型裝置，將吸附劑裝在吸附柱中，裝置成吸附層析柱。層析時(shí)，欲分離的混合溶液自柱頂加入，當(dāng)樣品液全部進(jìn)入吸附層析柱后，再加入洗脫劑解吸洗脫。在洗脫時(shí)，層析柱內(nèi)不斷發(fā)生解吸、吸附、再解吸、再吸附的過(guò)程。 溶劑洗脫法 置換洗脫法 前緣洗脫法 】分配層析- 利用各組分在兩相中的分配系數(shù)不同，而使各組分分離。【分配層析是利用各組分在兩相中的分配系數(shù)不同，而使各組分分離的方法。在分配層析中，通常采用一種多孔性固體支持物（如濾紙、硅藻土、纖維素等）吸著一種溶劑為固定相，這種溶劑在層析過(guò)程中始終固定在多

42、孔支持物上。另一種與固定相溶劑互不相溶的溶劑可沿著固定相流動(dòng)，稱為流動(dòng)相。當(dāng)某溶質(zhì)在流動(dòng)相的帶動(dòng)流經(jīng)固定相時(shí)，該溶質(zhì)在兩相之間進(jìn)行連續(xù)的動(dòng)態(tài)分配。 紙上層析 分配薄層層析 分配氣相層析 】離子交換層析-利用離子交換劑上的可解離基團(tuán)（活性基團(tuán)）對(duì)各種離子的親和力不同而達(dá)到分離目的【離子交換劑是含有若干活性基團(tuán)的不溶性高分子物質(zhì)。通過(guò)在不溶性高分子物質(zhì)（母體）上引入若干可解離基團(tuán)（活性基團(tuán)）而制成。按活性基團(tuán)的性質(zhì)不同，離子交換劑可以分為陽(yáng)離子交換劑和陰離子交換劑。由于酶分子具有兩性性質(zhì)，所以可用陽(yáng)離子交換劑，也可用陰離子交換劑進(jìn)行酶的分離純化。 】凝膠層析-以各種多孔凝膠為固定相，利用流動(dòng)相中所

43、含各種組分的相對(duì)分子質(zhì)量不同而達(dá)到物質(zhì)分離【凝膠層析又稱為凝膠過(guò)濾，分子排阻層析，分子篩層析等。凝膠層析柱中裝有多孔凝膠，當(dāng)含有各種組分的混合溶液流經(jīng)凝膠層析柱時(shí)，大分子物質(zhì)由于分子直徑大，不能進(jìn)入凝膠的微孔，只能分布于凝膠顆粒的間隙中，以較快的速度流過(guò)凝膠柱。較小的分子能進(jìn)入凝膠的微孔內(nèi)，不斷地進(jìn)出于一個(gè)個(gè)顆粒的微孔內(nèi)外，這就使小分子物質(zhì)向下移動(dòng)的速度比大分子的速度慢，從而使混合溶液中各組分按照相對(duì)分子質(zhì)量由大到小的順序先后流出層析柱，而達(dá)到分離的目的。常用的凝膠：葡聚糖凝膠瓊脂凝膠與瓊脂糖凝膠聚丙烯酰胺凝膠 】親和層析-利用生物分子與配基之間所具有的專一而又可逆的親和力，使生物分子分離純化

44、【哪些生物分子和配基之間具有的專一而又可逆的親和力?酶與底物,酶與競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑,酶與輔助因子,抗原與抗體，酶RNA與互補(bǔ)的RNA分子或片段,RNA與互補(bǔ)的DNA分子或片段等之間，都是具有專一而又可逆親和力的生物分子對(duì)。故此,親和層析在酶的分離純化中有重要應(yīng)用.根據(jù)欲分離組分與配基的結(jié)合特性,親和層析可以分為：共價(jià)親和層析疏水層析金屬離子親和層析免疫親和層析染料親和層析凝集素親和層析 】層析聚焦-將酶等兩性物質(zhì)的等電點(diǎn)特性與離子交換層析的特性結(jié)合在一起，實(shí)現(xiàn)組分分離13 酶活力測(cè)定方法。酶活力的測(cè)定方法：有兩種主要方法即終止反應(yīng)法和連續(xù)反應(yīng)法。終止反應(yīng)法：是在恒溫反應(yīng)系統(tǒng)中，每隔一定時(shí)

45、間，取出一定體積的反應(yīng)液，用強(qiáng)酸強(qiáng)堿或SDS以及加熱等使反應(yīng)立即停止，然后用化學(xué)法放射性化學(xué)法或酶偶聯(lián)法分析產(chǎn)物的形成量或底物的消耗量。這是最經(jīng)典的酶活力測(cè)定方法，幾乎所有的酶都可以根據(jù)這一原理設(shè)計(jì)出具體的測(cè)定方法。連續(xù)反應(yīng)法：無(wú)須終止反應(yīng)，而是在酶反應(yīng)過(guò)程中用光化學(xué)儀器或電化學(xué)儀器等來(lái)監(jiān)測(cè)反應(yīng)的進(jìn)行情況，對(duì)記錄結(jié)果進(jìn)行分析，然后計(jì)算出酶活力。14 比活力、回收率的含義及用途。(1)相對(duì)酶活力: 具有相同酶蛋白量的固定化酶與游離酶活力的比值稱為相對(duì)酶活力.它與載體結(jié)構(gòu)、顆粒大小、底物分子量大小及酶的結(jié)合效率有關(guān). 相對(duì)酶活力低于75%的固定化酶,一般沒(méi)有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。（2)酶的活力回

46、收率: 固定化酶的總活力與用于固定化的酶的活力之百分比稱為酶的活力回收率將酶進(jìn)行固定化時(shí), 總有一部分酶沒(méi)有與載體結(jié)合在一起, 測(cè)定酶的活力回收率可以確定固定化的效果.一般情況下, 活力 回收率應(yīng)小于1, 但有些情況下回收率大于1，為什么？由于固定化活細(xì)胞增殖或某些抑制因素排除的結(jié)果15 親和層析的原理是什么？如何根據(jù)目的產(chǎn)物的性質(zhì)選擇洗脫方式？親和層析 是利用蛋白質(zhì)和配體專一性識(shí)別并結(jié)合的特性而分離蛋白質(zhì)的一種。 洗脫抗原上的抗體時(shí)，采用游離的抗原進(jìn)行洗脫，也可降低PH來(lái)洗脫（2.8），酶和其底物，抑制劑和激活劑，糖蛋白和糖鏈，DNA結(jié)合蛋白和DNA，膜受體蛋白和激素，帶有標(biāo)簽的基因融合蛋白

47、和該標(biāo)簽的特異性結(jié)合物（如組氨酸標(biāo)簽和鎳離子）16 固定化生物催化劑的概念以及吸附法、包埋法、共價(jià)結(jié)合法、無(wú)載體固定化酶的基本技術(shù)和原理；參照1917細(xì)胞固定化的基本技術(shù)和原理；細(xì)胞的固定化方法:1、包埋法 ：將細(xì)胞包埋在多微孔載體內(nèi)部制備固定化細(xì)胞的方法，可分為凝膠包埋法、纖維包埋法和微膠囊包埋法. 最大優(yōu)點(diǎn)：能較好地保持細(xì)胞內(nèi)的多酶反應(yīng)系統(tǒng)的活力，可以像游離細(xì)胞那樣進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)。 2、 吸附法主要是利用細(xì)胞與載體之間的吸引力（范德華力、離子鍵和氫鍵），使細(xì)胞固定在載體上，常用的吸附劑有玻璃、陶瓷、硅藻土、多孔塑料、中空纖維等.3、 此外還可利用專一的親和力來(lái)固定細(xì)胞，例如伴刀豆球蛋白與一甘

48、露聚糖具有親和力，而釀酒酵母細(xì)胞壁上含有一甘露聚糖，故可將伴刀豆球蛋白先連接到載體上，然后把酵母連接到活化了的伴刀豆球蛋白上。18. 比較使用游離酶、固定化酶和固定化細(xì)胞作為催化劑的優(yōu)缺點(diǎn)。酶：催化效率高，低能耗，低污染，大規(guī)模地應(yīng)用于食品，化工等各個(gè)領(lǐng)域。固定化酶：既能與反應(yīng)物接觸，又容易與產(chǎn)物分離，同時(shí)在載體上的酶還可以反復(fù)利用。固定化細(xì)胞：成本低，操作更容易。19簡(jiǎn)述常見(jiàn)的酶的固定化方法、固定化的原理以及各自的優(yōu)缺點(diǎn)。1.載體結(jié)合法 物理吸附 a. 物理吸附法:是制備固定化酶最早采用的方法，它以固體表面物理吸附為依據(jù)，使酶一水不溶性載體相接觸而達(dá)到酶吸附的目的 優(yōu)點(diǎn)：固定化時(shí)酶分子的構(gòu)象

49、很少或基本不發(fā)生變化。缺點(diǎn)：結(jié)合力弱(物理吸附)，易解吸附。載體：纖維素、瓊脂糖、活性炭、沸石及硅膠等。 離子吸附 b. 離子吸附法 通過(guò)離子效應(yīng)將酶分子固定到含有離子交換基團(tuán)的固相載體. 其實(shí)質(zhì)不溶性離子化合物(離子交換劑)上的可交換離子與溶液中的其它同性離子的交換反應(yīng)，是一種特殊的吸附過(guò)程，是可逆性化學(xué)吸附。 第一個(gè)離子吸附法固定化酶：DEAE(二乙氨基乙醇 ) Cellulose（纖維素）固定化過(guò)氧化氫酶第一個(gè)工業(yè)化的固定化酶：DEAE-Sephadex A-50固定化氨基酰化酶優(yōu)點(diǎn)：反應(yīng)條件溫和，固定化酶活性高。缺點(diǎn)：結(jié)合不牢固，酶在高濃度底物，高離子強(qiáng)度或pH變化時(shí)易脫落。載體：DE

50、AE-纖維素、CM（甲基）-衍生物等 鏊合法 C、金屬的氫氧化物和氧化物利用螫合作用將酶直接贅合到表面含過(guò)渡金屬化合物的載體上，具有較高的操作穩(wěn)定性。能與酶中的羧基，羥基和氨基結(jié)合螫合作用：某些有機(jī)化合物中，其部份相鄰原子上，互有多余的"電子對(duì)"，可與外來(lái)的二價(jià)金屬離子(例如ni2+，co2+，cu2+ 等)共同組成環(huán)狀(ring)，類似螃蟹的兩支大螯般共同夾住外物一樣，稱之為螫合作用。具有這種功能的化合物者，稱為chelating agent。如edta(乙二胺基四醋酸)，eta等都是常見(jiàn)的螯合劑 共價(jià)結(jié)合法 d. 共價(jià)結(jié)合法 共價(jià)結(jié)合法是通過(guò)酶分子上的功能團(tuán)，與載體表面

51、上的反應(yīng)基團(tuán)發(fā)生化學(xué)反應(yīng)形成共價(jià)鍵的一種固定化方法，是研究最多的固定化方法之一。 優(yōu)點(diǎn)；結(jié)合牢固 缺點(diǎn)；酶容易失活2、 共價(jià)交聯(lián)通過(guò)雙功能或多功能試劑，在酶分子間或酶分子和微生物細(xì)胞間形成共價(jià)鍵的連接方法。交聯(lián)劑：具有兩種相同或不同功能基團(tuán)的試劑常見(jiàn)的交聯(lián)劑有順丁烯二酸配和乙烯共聚物、戊二醛等，其中以戊二醛最為常用。 O OH C CH2 CH2 CH2 C H優(yōu)點(diǎn): 結(jié)合牢固缺點(diǎn): 反應(yīng)較為激烈,酶活回收率低 因此, 在交聯(lián)的時(shí)候盡量降低交聯(lián)劑的濃度和縮短反應(yīng)時(shí)間（共價(jià)結(jié)合法和共價(jià)交聯(lián)法區(qū)別：酶分子；（a）酶分子之間用雙功能基團(tuán)的化學(xué)交聯(lián)試劑相互交聯(lián)成水不溶性的固定化酶；（b）酶分子被偶聯(lián)到

52、水不溶性載體上形成水不溶性的固定化酶）3、 包埋法 將酶包埋在高聚物凝膠網(wǎng)格中或高分于半透膜內(nèi)的固定方法；前者又稱為凝膠包埋法，后者則稱為微囊法。 包埋法一般不需要與酶蛋白的氨基酸殘基起結(jié)合反應(yīng)，較少改變酶的高級(jí)結(jié)構(gòu)，酶的回收率較高；但它僅適用于小分于底物和產(chǎn)物的酶，為什么？ 因?yàn)橹挥行》肿游镔|(zhì)才能擴(kuò)散進(jìn)入高分子凝膠的網(wǎng)格，并且這種擴(kuò)散阻力還會(huì)導(dǎo)致固定化酶動(dòng)力學(xué)行為的改變和活力的降低20如何評(píng)價(jià)固定化酶的固定化效果？酶固定化效果的測(cè)定 - 固定化酶活力測(cè)定基本上與溶液酶相似，也以反應(yīng)初速度表示。即每毫克干重固定化酶每分鐘轉(zhuǎn)化1umol底物量或形成1umol產(chǎn)物的酶量為一個(gè)單位(umol/mg·min)，對(duì)于酶管、酶膜、酶板等，則以