應(yīng)用巢式PCR法鑒定牛早期胚胎性別

1、沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，（）：，（）：應(yīng)用巢式法鑒定牛早期胚胎性別羅光彬，孫明亮，紀英卓，曹丹（沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，沈陽；沈陽市畜牧獸醫(yī)科研所，沈陽）摘要：為獲得一種高效的牛胚胎性別鑒定方法，采用高特異性和靈敏度的巢式進行擴增。結(jié)果表明：公?？梢詳U增出的基因片段和的珠蛋白基因片段，母牛只能擴增出的珠蛋白基因片段。巢式只需個細胞就可以觀察到擴增結(jié)果，而常規(guī)則需要較多的細胞，所以牛胚胎性別鑒定時使用巢式效果更好。關(guān)鍵詞：巢式；牛；早期胚胎；性別鑒定中圖分類號：；文獻標識碼：文章編號：（），（，；，）：，：；隨著科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，我國畜牧業(yè)生產(chǎn)發(fā)生了巨大的變化，性別鑒定技術(shù)在畜牧業(yè)中的作用也日益明

2、顯。因為家畜的很多生產(chǎn)性狀與性別有關(guān)，如：在乳制品生產(chǎn)中需要較多的母畜，而在肉畜生產(chǎn)中則優(yōu)先選擇公畜；并且在消滅不理想的隱性性狀，防止性連鎖疾病，加快遺傳進展及畜群的更新等方面也起重要作用。因此，如果能夠有效地控制家畜的性別，就能更好地利用自然資源，從而服務(wù)于人類自身。世紀年代以后，這方面的研究取得了很大的進展，特別是技術(shù)和性別鑒定基因（）的發(fā)現(xiàn)，使家畜早期胚胎性別鑒定的研究成為人們關(guān)注的課題之一，。等（）首先成功應(yīng)用技術(shù)鑒定牛羊胚胎性別。我國在胚胎性別鑒定方面的研究起步較晚，但發(fā)展很快，取得了長足的進步。年，曾溢濤等應(yīng)用技術(shù)擴增序列首次進行牛胚胎性別鑒定獲得成功。之后羅應(yīng)榮等（），胡明信等（

3、），柏學(xué)進等（），呂碧文等（），陳從英等（）都應(yīng)用技術(shù)鑒定牛胚胎性別獲得成功。在使用常規(guī)法進行性別鑒定時由于靈敏度有限、取樣細胞數(shù)較少，所以其效率受到一定影響，但是取樣細胞數(shù)過多將影響胚胎活力進而導(dǎo)致低妊娠率。因此，為了獲得一種在胚胎性別鑒定過程中既少量取樣，又有較高效率的方法，進行了本試驗。材料與方法本試驗于年月至年月在沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院動物胚胎工程實驗室和中心實驗室進行。試驗樣品血液樣品采自沈陽市于洪區(qū)金氏牛羊屠宰場，胚胎樣品來自于沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院動物胚胎工程實驗室體外受精、體外培養(yǎng)的胚胎。試劑與儀器主要試劑為酶、購于天根生化科技（北京）有限公司，引物合成于寶生物工收稿日期：

4、基金項目：沈陽市科技局資助項目（；）作者簡介：羅光彬（），男，沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)教授，博士，從事動物胚胎生物工程研究。第期羅光彬等：應(yīng)用巢式法鑒定牛早期胚胎性別程（大連）有限公司，購于上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司。主要儀器為儀（凝膠成像系統(tǒng)（，美國公司）、臺式高速離心機（，美國，德國公司）、紫外分光光度計（，美國公司）等。公司）、引物合成根據(jù)文獻，合成了對巢式引物，同時根據(jù)牛珠蛋白基因序列設(shè)計合成一對內(nèi)標引物。模板的提取血樣采用酚氯仿反復(fù)抽提來獲取。胚胎細胞的提取通常有兩種方法：一是煮沸法，將胚胎細胞置于管中沸水煮后放于冰上冷卻，二是反復(fù)凍融離心取其上清作為反應(yīng)模板。法，將胚胎細胞置于管中用液氮

5、反復(fù)凍融幾次后離心，取其上清作為反應(yīng)模板。試驗設(shè)計本試驗采用高特異性和靈敏度的巢式法對牛胚胎進行性別鑒定。首先用基因和內(nèi)標基因的外引物進行約個循環(huán)的擴增，然后取第一輪擴增產(chǎn)物再加入基因內(nèi)引物和內(nèi)標引物進行第二輪個循環(huán)的擴增。體系的優(yōu)化試驗將所選定反應(yīng)體系其他條件保持不變（反應(yīng)體系），使?jié)舛确謩e為濃度的確定，進行擴增，根據(jù)擴增結(jié)果來確定最佳濃度。聚合酶用量的確定將所選定反應(yīng)體系其他條件保持不變（反應(yīng)體系），使聚合酶的用量分別為，進行擴增，根據(jù)擴增結(jié)果來確定用量。聚合酶的最佳引物濃度的確定將所選定反應(yīng)體系其他條件保持不變（反應(yīng)體系），使引物濃度分別為，進行擴增，根據(jù)擴增結(jié)果來確定最佳引物濃度。退火

6、溫度的確定將所選定反應(yīng)體系其他條件保持不變（反應(yīng)體系），使退火溫度分別為，進行擴增，根據(jù)擴增結(jié)果來確定最佳退火溫度。優(yōu)化后體系的應(yīng)用試驗準確率的測定精子細胞的擴增以已知性別的基因組為模板，應(yīng)用優(yōu)化后的反應(yīng)體系進行擴增來確定準直接以微量精子細胞（個）為模板，應(yīng)用優(yōu)化后的反應(yīng)體系進行擴增以確定該確率。反應(yīng)體系的靈敏度。胚胎擴增將一枚桑椹胚切割成份，取其中一份切割胚的為模板，應(yīng)用優(yōu)化后的反應(yīng)體系進行擴增來鑒定胚胎的性別。擴增產(chǎn)物的電泳檢測反應(yīng)結(jié)束后取擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，電壓，電泳時間，染色后紫外燈下觀察擴增結(jié)果。結(jié)果與分析?；蚪M的提取及鑒定通過分光光度計測出?；蚪M的濃度為，接近，電泳結(jié)果

7、（圖）說明該提取純度較高符合擴增要求?；蚪M性別鑒定的結(jié)果第一輪擴增結(jié)果第二輪擴增結(jié)果以基因組為模板經(jīng)過第一輪擴增后無論是雄性或雌性都只在處形成一基因組在經(jīng)過第二輪擴增后雄性在和兩處形成兩條擴增帶，而雌條外引物的擴增帶（圖），不能鑒定出性別。性只在處形成一條擴增帶（圖），可以鑒定出性別。其中是二者的內(nèi)標引物擴增帶，是雄性特異引物的擴增帶。沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報第卷優(yōu)化的結(jié)果不同濃度的影響在本試驗中，濃度在時擴增效果較好（圖）。分析其原因，可能是由于基因含量較少，在雄性特異性片段的擴增反應(yīng)中，能與雄性特異引物結(jié)合的位點就比較少，對產(chǎn)物的特異性程度也要求較高，故需要相對較高的濃度。不同聚合酶用量的影響在

8、應(yīng)用聚合酶進行反應(yīng)時，酶量偏少則產(chǎn)物相應(yīng)減少影響對結(jié)果的判定，而酶量過高則會增加產(chǎn)物的非特異性擴增。本試驗中在的擴增體系下的聚合酶用量就足夠擴增所用（圖）。不同引物濃度的影響標準反應(yīng)每條引物的典型濃度是。引物濃度過低將減少擴增產(chǎn)物的量，過高可能會引發(fā)錯配，導(dǎo)致非特異性擴增，特別是在巢式的第一輪擴增中如果外引物的濃度過高，到最后電泳時可能會同時看到內(nèi)引物和外引物所擴增的條基因帶。本試驗中引物濃度為時擴增結(jié)果較好（圖）。不同退火溫度的影響本試驗所采用的退火溫度是，提高退火溫度至有利于提高反應(yīng)的特異性。退火時間一般為，在此時間內(nèi)引物和模板可以充分結(jié)合。本試驗由于要擴增的目的序列均不超過，因此，只需要

9、就足夠了（圖）。優(yōu)化后的反應(yīng)體系為：第一輪反應(yīng)的體積為，其中含各引物，酶，共個循環(huán)。然后取第一輪反應(yīng)物作為第二輪反應(yīng)的模板，同時加入基因內(nèi)引物和內(nèi)標引物各，酶，反應(yīng)體積，共進行個循環(huán)。循環(huán)參數(shù)同為：預(yù)變性，；變性，；退火，；延伸，；最后在延伸。第期羅光彬等：應(yīng)用巢式法鑒定牛早期胚胎性別體系的應(yīng)用準確率個血液樣品鑒定結(jié)果與實際性別完全符合。即個樣品中已知性別為雄性的均為兩條擴增條帶和，所有已知性別為雌性的均為一條擴增條帶，準確率。精子細胞的擴增直接以微量精子細胞（個）為模板進行擴增，可以獲得正確的清晰的擴增帶（圖），說明該體系具有較高靈敏度可以對少量胚胎細胞進行性別鑒定。胚胎擴增切割胚的擴增結(jié)果

10、表明（圖），雖然洗卵液有污染，但卻沒有影響到性別鑒定的結(jié)果判定，然后再將其中另一份切割胚進行巢式擴增，結(jié)果一致。本試驗共鑒定枚桑椹胚和囊胚，前后兩次鑒定結(jié)果均一致，其效率明顯高于等四分胚的和羅應(yīng)榮等半胚的。結(jié)論與討論本試驗選用對巢式引物經(jīng)實驗證明完全公牛特異。但在操作過程中，特別是胚胎分割取樣或吸取胚胎細胞的過程中很容易丟失樣品，如果只使用一對公牛特異引物，很容易造成假陰性從而影響準確率，根據(jù)牛珠蛋白基因序列設(shè)計了一對內(nèi)標引物，避免了假陰性的發(fā)生，提高了準確率。在取樣細胞數(shù)量上，研究表明取樣細胞的數(shù)量影響性別鑒定的準確率，取樣細胞個就足夠用于性別鑒定。而有報道當取樣細胞小于個時，性別鑒定的效率

11、顯著降低，而較大的樣品量（個細胞）鑒定結(jié)果較成功，但是取樣細胞數(shù)過多將影響胚胎活力而導(dǎo)致妊娠率降低。在本試驗中，當取樣細胞小于個時，性別鑒定效率顯著降低，大于個時則鑒定結(jié)果較成功，與余文莉等和金方等所報道的相似。本試驗中對血液樣品擴增的準確率達，高于使用常規(guī)法擴增的準確率。對切割胚胎的擴增經(jīng)過多次重復(fù)試驗結(jié)果也均前后一致，并且準確率高于等的和等的，羅應(yīng)榮等的，呂碧文等的，與曾溢濤等，胡明信等，柏學(xué)進等，陳從英等所報道的一致，均達到，說明本試驗所選用的引物和優(yōu)化的巢式體系是可以應(yīng)用于牛早期胚胎的性別鑒定。盡管應(yīng)用巢式進行牛早期胚胎性別鑒定已獲得成功，但還有許多問題需要注意和解決。首先，大部分胚胎

12、培養(yǎng)液中含有犢牛血清，如果血清不純，將很容易造成污染；其次，在胚胎切割過程中給胚胎造成的損傷，將影響其受胎率，再加上性別鑒定胚胎冷凍后存活率過低等問題，如果能很好地解決這些問題，該技術(shù)必將進入實用化和生產(chǎn)階段，給畜牧業(yè)生產(chǎn)帶來更大的經(jīng)濟效益。參考文獻：烏達巴拉，賴雙英，石泉家畜早期胚胎性別鑒定技術(shù)的應(yīng)用畜牧與飼料科學(xué)，（）：禹學(xué)禮，粟穎華在動物胚胎性別鑒定中的應(yīng)用洛陽農(nóng)業(yè)高等?？茖W(xué)校學(xué)報，（）：，：，：沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報第卷，（）：曾溢滔，任兆瑞，胡明信，等應(yīng)用擴增牛序列進行奶牛胚胎性別鑒定中國科學(xué)（），（）：朱裕鼎，王大可，許罕華，等利用技術(shù)鑒定奶牛早期胚胎性別的研究高技術(shù)通訊，：胡明信，吳學(xué)清，高建明，等牛胚胎性別鑒定與取樣胚胎移植應(yīng)用技術(shù)的研究畜牧獸醫(yī)學(xué)報，（）：柏學(xué)進，薛建華，董雅娟，等牛胚胎移植技術(shù)開發(fā)與應(yīng)用研究課題鑒定材料哈爾濱：黑龍江省畜牧研究所，溫利華，王風(fēng)武性別控制與在畜牧業(yè)中的應(yīng)用內(nèi)蒙古畜牧科學(xué)，：陳從英，黃路生，陳靜波，等牛早