四種病毒和弓形蟲衣原體支原體感染實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)的重要性

1、四種病毒和弓形蟲衣原體支原體感染實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)的重要性    nbsp; 中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)北京協(xié)和醫(yī)院檢驗(yàn)科nbsp;nbsp;倪安平nbsp;nbsp;nbsp;臨床微生物檢驗(yàn),如細(xì)菌、真菌等,近年來(lái)已取得了長(zhǎng)足的進(jìn)步,尤其是細(xì)菌培養(yǎng)、鑒定和藥敏試驗(yàn)。但某些病毒、衣原體和支原體感染的實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn),由于受到技術(shù)條件的限制,雖     中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)北京協(xié)和醫(yī)院檢驗(yàn)科   倪安平     臨床微生物檢驗(yàn),如細(xì)菌、真菌等,近年來(lái)已取得了長(zhǎng)足的進(jìn)步

2、,尤其是細(xì)菌培養(yǎng)、鑒定和藥敏試驗(yàn)。但某些病毒、衣原體和支原體感染的實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn),由于受到技術(shù)條件的限制,雖有進(jìn)步但步伐不夠大。面對(duì)目前發(fā)病形勢(shì),對(duì)于流感病毒、巨細(xì)胞病毒、單純皰疹病毒、風(fēng)疹病毒和弓形蟲、衣原體、支原體感染的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè),應(yīng)引起檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)界足夠的重視,同時(shí)存在的一些問(wèn)題亦值得探討。一、流感病毒( Influenza virus)    引起流行性感冒,簡(jiǎn)稱流感。在美國(guó),流感每年的發(fā)病率在10 %20 % ,平均超過(guò)11 萬(wàn)多的人次住院和2 萬(wàn)人死亡,死亡者絕大多數(shù)為65 歲的老年人和/ 或已存在某些慢性疾病患者1 。我國(guó)是流感的高發(fā)病區(qū),也是流感變異株易產(chǎn)

3、生的地區(qū)之一,尤其是在華南地區(qū)2 。美國(guó)疾病控制和預(yù)防中心(CDC) 、世界衛(wèi)生組織(WHO) 與我國(guó)衛(wèi)生部合作2 ,已經(jīng)將流感列為重點(diǎn)防治的傳染病,并從2002 年開始,分3 批在全國(guó)23 個(gè)省份展開流感監(jiān)測(cè)(網(wǎng)) ,目的是發(fā)現(xiàn)新的變異株,及時(shí)更新疫苗。國(guó)內(nèi)過(guò)去由于流感具有自愈性,沒有理想的抗流感病毒藥物(金剛烷胺和金剛乙胺因副作用大,易出現(xiàn)耐藥和對(duì)乙型流感病毒無(wú)效,臨床應(yīng)用有限) ,故臨床常規(guī)實(shí)驗(yàn)室基本沒有開展流感病毒的檢測(cè)。傳統(tǒng)的病毒分離等實(shí)驗(yàn)技術(shù)主要由疾病控制部門用于流感流行的疫情監(jiān)測(cè)。近年來(lái),隨著流感病毒神經(jīng)氨酸酶抑制劑( Influenza virus neuraminidase

4、inhibitors) 治療藥物的上市,如扎那米韋(zanamivir) 和奧司他韋(oseltamivir ,已獲我國(guó)新醫(yī)藥評(píng)審中心批準(zhǔn)并在國(guó)內(nèi)上市) ,流感藥物療效有了很大提高。流感病毒神經(jīng)氨酸酶抑制劑在流感發(fā)病36 h 內(nèi)使用,將明顯改善臨床癥狀和縮短病程。因此,流感的快速檢測(cè)勢(shì)在必行。國(guó)外已開發(fā)膠體金方法,如Quick Vue Influenza A/ B Test和Directigen Flu A +B 等,優(yōu)勢(shì)在于30 min 內(nèi)獲得結(jié)果,經(jīng)檢測(cè)陽(yáng)性的患者可以盡快用藥。該試劑不足是成本較高,敏感性也低于培養(yǎng)法。國(guó)內(nèi)尚無(wú)膠體金快速檢測(cè)的同類產(chǎn)品。傳統(tǒng)的流感病毒培養(yǎng)包括雞胚接種及血凝法

5、鑒定,其需要時(shí)間長(zhǎng)(一般為5 d最長(zhǎng)可達(dá)14 d) ,操作繁瑣。離心培養(yǎng)能夠提供快速的流感病毒培養(yǎng)結(jié)果3 ,可為衛(wèi)生防疫行政部門提供及時(shí)的疫情報(bào)告。二、巨細(xì)胞病毒(Cytomegalovirus , CMV)    CMV 所致人類疾病非常廣泛,對(duì)健康影響最大的有2 個(gè)領(lǐng)域。    1. CMV 是最常見的先天性宮內(nèi)感染的因素,世界各地約占整個(gè)活產(chǎn)嬰兒的015 %215 %。孕婦妊娠期CMV 感染包括原發(fā)性感染和再發(fā)性感染(外源性的再感染或體內(nèi)潛伏病毒的再激活) 。80 年代Stagno 等研究顯示CMV 先天性感染的致畸作用(聽力和

6、中樞神經(jīng)系統(tǒng)的損害) 主要緣于妊期內(nèi)的原發(fā)性CMV 感染,現(xiàn)在的研究顯示原發(fā)性和再感染均有致畸作用4 ,但再感染所致CMV 先天性感染的機(jī)率和臨床表現(xiàn)的嚴(yán)重性還有待進(jìn)一步研究5 。孕婦CMV 原發(fā)性感染最可靠的診斷方法是妊娠期CMV特異性IgG抗體發(fā)生陽(yáng)轉(zhuǎn)5 。國(guó)內(nèi)不少醫(yī)院的實(shí)驗(yàn)室已將孕婦CMV 感染篩查作為常規(guī)項(xiàng)目,可能有些欠成熟,其中多數(shù)實(shí)驗(yàn)室將早孕血清CMV2IgM 抗體單項(xiàng)指標(biāo)作為孕婦CMV 感染的指標(biāo),僅從方法學(xué)角度即存在問(wèn)題,因CMV2IgM 抗體的檢測(cè)影響(干擾)因素較多,主要是易出現(xiàn)假陽(yáng)性,即使IgM捕獲法仍難以避免,更何況許多實(shí)驗(yàn)室使用間接法酶免疫法。孕婦CMV 感染及對(duì)胎兒

7、致畸作用在我國(guó)有許多未知問(wèn)題,如孕婦CMV 原發(fā)性感染的發(fā)病率? 垂直傳播的機(jī)率? 我國(guó)育齡婦女CMV 既往感染率90 %左右,妊期再感染對(duì)胎兒的致畸作用及程度如何等。    2. CMV 在免疫抑制患者的感染極為常見,如艾滋病患者、腫瘤化療、器官移植后和自身免疫性疾病使用免疫抑制藥物治療者6 。僅靠血清學(xué)診斷方法可能具有局限性,因?yàn)檫@些患者抗體的產(chǎn)生可能不完全。國(guó)外實(shí)驗(yàn)室過(guò)去一直使用病毒分離作為診斷手段,但培養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng)(最長(zhǎng)可達(dá)21 d) ,且實(shí)驗(yàn)室條件和技術(shù)也要求高,國(guó)內(nèi)一般實(shí)驗(yàn)室很難達(dá)到。90 年代中期國(guó)外開始的CMV 抗原血癥的檢測(cè),為CMV感染的診斷提供了

8、敏感、簡(jiǎn)便、快速和高特異性的新方法。該方法利用葡聚糖分離沉淀抗凝全血中的白細(xì)胞,單克隆抗體間接熒光染色白細(xì)胞核內(nèi)CMV 低基質(zhì)結(jié)構(gòu)磷蛋白( lower matrix structural phosphopo2tein) 。該方法敏感性是病毒分離的23 倍7 ,況且目前實(shí)驗(yàn)室條件和技術(shù)尚不能滿足病毒分離的要求。由于國(guó)內(nèi)這類患者越來(lái)越多,應(yīng)用前景將是廣泛的,目前已有少數(shù)實(shí)驗(yàn)室已開始使用8 。CMV 感染的分子生物學(xué)診斷也是未來(lái)發(fā)展的一個(gè)方向,如在CMV 腦炎診斷的應(yīng)用9 ,國(guó)內(nèi)臨床應(yīng)用尚有待于國(guó)家醫(yī)藥管理部門的批準(zhǔn)。對(duì)于免疫抑制患者CMV 感染及時(shí)、準(zhǔn)確診斷的重要意義在于目前具有較好的化療藥物更昔

9、洛韋(ganciclovir) 。三、單純皰疹病毒(Herpes simplex virus , HSV)    在美國(guó),做為性傳播疾病之一的生殖道皰疹病毒(HSV22) 感染系生殖道潰瘍最常見的病原體,血清HSV22 特異性抗體的陽(yáng)性率在過(guò)去10 年增加了32 %10 。與歐美不同的是,國(guó)內(nèi)無(wú)論是性病門診就診者或孕婦,生殖道皰疹發(fā)病似乎不多見,至少生殖道皰疹皮損不多見。當(dāng)然,作為生殖道皰疹診斷的主要技術(shù)病毒分離在國(guó)內(nèi)應(yīng)用比較少,確切的發(fā)病率需要進(jìn)一步研究。如果孕婦中存在較高的生殖道皰疹發(fā)病率,應(yīng)當(dāng)考慮所致新生兒皰疹的問(wèn)題。    N

10、ahmias 等在70 年代的研究已經(jīng)證實(shí)HSV 經(jīng)血路胎盤導(dǎo)致胎兒畸形是罕見的,因此,國(guó)內(nèi)將HSV 血清學(xué)用于優(yōu)生優(yōu)育的早孕婦篩查可能沒有理論根據(jù)。對(duì)于皰疹性腦膜炎,CSF 標(biāo)本很難分離到HSV、HSV2IgM 僅在部分患者中檢測(cè)到, PCR 方法檢測(cè)CSF 標(biāo)本的HSV2DNA 是最好的選擇。單管多項(xiàng)目(Multiplex) PCR 檢測(cè)技術(shù)可同時(shí)檢測(cè)CSF 標(biāo)本中若干皰疹病毒(HSV、CMV、水痘2帶狀皰疹病毒、EB 病毒) ,以篩查中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染的病原體11 。四、風(fēng)疹病毒(Rubella virus)    目前風(fēng)疹病毒感染的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)的主要臨床意義是

11、先天性風(fēng)疹綜合征(CRS) 的預(yù)防和診斷。與CMV 不同的是,孕婦在妊娠前對(duì)風(fēng)疹已存在的免疫力(已存在的特異性IgG抗體) 能夠非常有效地保護(hù)妊期發(fā)生再次RV 的感染。美國(guó)提出到2010 年消滅本土的風(fēng)疹和CRS ,消滅CRS 的基本條件是預(yù)防育齡婦女風(fēng)疹的發(fā)生12 ,截止到1997 年,在美國(guó)有91 %的1935 月齡的幼兒接種風(fēng)疹疫苗。我國(guó)育齡婦女風(fēng)疹的自然感染率(自然免疫率) 很高,戴斌1986 年報(bào)道孕婦風(fēng)疹抗體的陽(yáng)性率為9415 % ,近年來(lái)調(diào)查顯示仍然維持這個(gè)水平。因此,育齡婦女孕前應(yīng)檢查RV 抗體,如果是陰性,應(yīng)接種RV 減毒疫苗,是預(yù)防CRS 患兒出生最好的方法,這樣也就無(wú)須進(jìn)

12、行妊娠期風(fēng)疹感染的監(jiān)測(cè)。五、弓形蟲(Toxoplasma)    弓形蟲本身在弓形蟲感染者體內(nèi)極少能夠查到,因此,血清學(xué)是弓形蟲感染主要診斷手段。血清弓形蟲抗體陽(yáng)性率在不同國(guó)家和地區(qū)差異很大,法國(guó)孕婦弓形蟲既往感染率可高達(dá)60 % ,美國(guó)育齡婦女10 %15 %。上海市1997 年的報(bào)道為317 % ,19992001 年我們調(diào)查北京市孕婦弓形蟲血清IgG抗體陽(yáng)性率213 %。在法國(guó)和奧地利,孕婦弓形蟲血清學(xué)篩查是強(qiáng)制性的,比利時(shí)、瑞士和意大利則根據(jù)產(chǎn)科醫(yī)生需要進(jìn)行篩查,這些國(guó)家孕婦弓形蟲血清IgG抗體陽(yáng)性率在20 %60 %13 。我國(guó)孕婦弓形蟲既往感染率很低,

13、是否存在弓形蟲高發(fā)病區(qū),如畜牧地區(qū),是否有必要常規(guī)進(jìn)行孕婦弓形蟲血清學(xué)篩查,方案如何均需進(jìn)一步的研究。國(guó)內(nèi)目前孕婦弓形蟲抗體篩查大多數(shù)僅檢測(cè)弓形蟲IgM 抗體,應(yīng)該包括IgG抗體,因?yàn)闄z測(cè)IgM抗體干擾因素多,主要是易出現(xiàn)假陽(yáng)性,由于我國(guó)孕婦弓形蟲血清IgG抗體陽(yáng)性率很低,故檢測(cè)IgG抗體對(duì)排除IgM 抗體的假陽(yáng)性有極大的幫助。六、衣原體(Chlamydia)    沙眼衣原體感染在美國(guó)已成為最主要的性傳播疾病,主要表現(xiàn)為非淋菌性尿道炎、宮頸炎、子宮內(nèi)膜炎和盆腔炎14 。鸚鵡熱衣原體引起人類的鸚鵡熱。肺炎衣原體引起社區(qū)獲得性肺炎和支氣管炎。沙眼衣原體感染的診斷一直

14、以細(xì)胞培養(yǎng)為“金標(biāo)準(zhǔn)”,但其花費(fèi)大、操作繁瑣、培養(yǎng)周期長(zhǎng)且實(shí)驗(yàn)室技術(shù)要求高。近年出現(xiàn)了許多具有較高特異性和敏感性的非培養(yǎng)方法, 如直接熒光抗體技術(shù)( directfluorescescent assay ,DFA) 和EIA、全自動(dòng)免疫分析儀檢測(cè)15 、核酸探針及PCR 技術(shù),其中PCR 技術(shù)已經(jīng)通過(guò)國(guó)家醫(yī)藥管理部門的批準(zhǔn)。直接顯微鏡及與計(jì)算機(jī)連接的顯示系統(tǒng)(超高倍鏡) 形態(tài)學(xué)不適于衣原體的診斷,因?yàn)殓R下不能將衣原體原體與其他微生物、組織細(xì)胞碎片、顆粒及雜質(zhì)區(qū)別。計(jì)算機(jī)放大僅是圖像的放大,而不是分辨率的提高。如果上述系統(tǒng)用于衣原體包涵體檢測(cè)也不可取,因?yàn)樯逞垡略w感染的生殖道標(biāo)本幾乎是游離的原

15、體或網(wǎng)狀體,很少有包涵體存在。沙眼衣原體快速檢測(cè)卡(膠體金標(biāo)記抗原檢測(cè)法) 在特異性和敏感性都存在不足。    沙眼衣原體血清學(xué)適用于沙眼衣原體所致上生殖道或播散性感染(如女性盆腔炎) 和新生兒沙眼衣原體肺炎的診斷。肺炎衣原體培養(yǎng)即使在國(guó)外也非一般實(shí)驗(yàn)室所能,故血清學(xué)仍然是主要診斷方法,微量免疫熒光法為推薦方法16 。鸚鵡熱發(fā)病率現(xiàn)在隨寵鳥飼養(yǎng)人數(shù)的增加有所增加,但總發(fā)病率仍然較低,血清學(xué)結(jié)合典型的臨床癥狀和病史診斷不難17 。七、支原體(Mycoplasma)    3 個(gè)支原體種與人類疾病的關(guān)系最大,肺炎支原體,是明確的病原體,人型支原體和解脲脲原體一般認(rèn)為是機(jī)會(huì)性感染病原體。支原體在普通的光學(xué)顯微鏡不可見,由于沒有細(xì)胞壁,其形態(tài)為無(wú)定形,且不能被革蘭染料所染色,姬姆染色也不能將支原體與標(biāo)本中的碎片顆粒區(qū)別,因此支原體鏡下(包括超高倍鏡下) 形態(tài)學(xué)不能用于支原體檢測(cè)。肺炎支原體在培養(yǎng)基中生長(zhǎng)緩慢,最長(zhǎng)達(dá)21 d ,因此臨床應(yīng)用受到限制。血清學(xué)方法在分子生物學(xué)診斷技術(shù)應(yīng)用之前仍然是肺炎支原體感染診斷的主要手段18 。人型支原體和解脲脲原體在培養(yǎng)基中生長(zhǎng)很快,故培養(yǎng)是實(shí)驗(yàn)室診斷的主要