初發(fā)糖尿病大鼠腎小球蛋白激酶C活性變化的研究

1、    初發(fā)糖尿病大鼠腎小球 蛋白激酶C活性變化的研究        摘要目的：檢測初發(fā)糖尿病大鼠腎小球蛋白激酶C（proteinkinaseC，PKC）活性變化，以推斷PKC活性變化在腎內(nèi)血流動力學(xué)改變中所起的作用。方法：用鏈脲菌素制備糖尿病大鼠實驗?zāi)Ｐ?，在糖尿病發(fā)病2周后，分離腎小球，提取純化胞漿及胞膜蛋白，利用-32PATP底物磷酸化的方法檢測胞漿及胞膜PKC活性。同時測量血、尿肌酐，計算內(nèi)生肌酐清除率。結(jié)果：糖尿病大鼠表現(xiàn)出明顯的腎小球高濾過及腎臟肥大現(xiàn)象，

2、此時細胞內(nèi)總的PKC活性與對照組無顯著性差異，胞漿PKC活性略有下降，胞膜PKC活性明顯增高，膜結(jié)合PKC百分比顯著增加。表明胞膜PKC活性的增高來源于其自胞漿向胞膜的轉(zhuǎn)移，即初發(fā)糖尿病狀態(tài)腎小球PKC被激活。結(jié)論：鏈脲菌素糖尿病大鼠初發(fā)糖尿病階段腎小球PKC即被激活，激活的PKC通過參與多種血管活性物質(zhì)的釋放、離子通道的調(diào)節(jié)構(gòu)成細胞內(nèi)重要的信息網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)，在糖尿病早期腎內(nèi)血流動力學(xué)改變中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。關(guān)鍵詞蛋白激酶C糖尿病腎小球ACTIVITY CHANGE IN PROTEIN KINASE C IN GLOMERULI OFRAT WITH EARLY STAGE DIABETES

3、Fan Qiuling，Wan Lining，Zhou Hua，Yao Li，Zhou XijingDivision of Nephrology，the First Affiliated Hospital of China Medical Unirersity，Shenyangs 110001OBJECTIVE To explore the role of PKC in renal hemodynamic in diabetes，we detected the change in protein kinase C （PKC） activity in isolated glomeruli fro

4、m 2 weeks streptozotocin-induced diabetic ratsMETHODOLOGY Experimental diabetic rats were induced by peritoneal injection of streptozotocinTwo weeks after the induction of diabetes，glomeruli were isolated and subcellular fraction prepared and partially purifiedSubcellular distribution of PKC was det

5、ected by using -32PATP as the phosphorus donorThe concentrations of serum and urine creatinine，and the creatinine clearance were also measuredRESULTS Diabetic rats had significant increase in glomerular filtration rate and obvious hypertrophic renal changesThe activity of PKC in cytosolic fraction w

6、as found decreased in glomeruli from diabetic rats as compared to the controls，but no statistical significance was foundTotal cellular PKC activity was not significantly changedThe PKC activity in membrane fraction and the percentage of PKC activity associated with the membrane fraction of glomeruli

7、 from diabetic rats was found significantly increasedCONCLUSION As an important intracellular signal，PKC is activated in glomeruli at the early stage of diabetesThis observation implied that the higher PKC activity in membrane fraction was due to translocation of enzyme activity from the cytosolic t

8、o the membrane fraction，indicating the activation of this enzymePKC activation might be involved in the renal hemodynamic abnormalities of early stage diabetesKey words protein kinase C diabetes rats model glomeruli糖尿病腎?。―N）作為糖尿病重要的微血管并發(fā)癥之一，已成為慢性腎功能衰竭的主要原因，美國腎臟病資料系統(tǒng)（USRDS）的統(tǒng)計顯示：超過30的終末期腎功能衰竭為DN所致1。目

9、前的研究提示，糖尿病早期腎內(nèi)血流動力學(xué)改變直接參與了DN的發(fā)生，而腎小球高濾過則在其中起重要作用2。因此研究初發(fā)糖尿病狀態(tài)腎小球血流動力學(xué)改變，尤其是高濾過現(xiàn)象的成因?qū)μ矫鱀N的發(fā)病機制及防治尤為必要。本實驗利用-32PATP底物磷酸化的方法，檢測初發(fā)糖尿病大鼠腎小球胞漿、胞膜蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）活性，以探明腎小球PKC活性變化及其在腎內(nèi)血流動力學(xué)改變中所起的作用。1材料和方法11實驗動物體重150170gSprague-Dawley系雄性大鼠40只由中國醫(yī)科大學(xué)實驗動物部提供，隨機分為正常對照組及糖尿病組，每組各20只。經(jīng)腹腔注射鏈脲菌素（Sigma公司）6

10、0 mgkg，2日后血糖13.9mmolL的大鼠為糖尿病大鼠用于實驗，正常對照組注射同等量生理鹽水。12標本的收集及腎小球胞漿、胞膜蛋白提取所有大鼠均為自由飲水、自由攝食，于鏈脲菌素注射2周后，用代謝籠收集24h尿液。大鼠在戊巴比妥（50 mgkg，ip）麻醉下，取腹部正中切口，分離腎動脈及腹主動脈。在腹主動脈末端插入導(dǎo)管，采血2ml后結(jié)扎右腎動脈以上的腹主動脈和腸系膜上動脈，進行原位腎臟灌洗（生理鹽水4）。取下雙腎，迅速剝?nèi)ツI包膜，稱重后置于4生理鹽水中。實驗所有操作均在4條件下進行，將生理鹽水中的腎臟縱向剖開，分離腎皮質(zhì)，每2只大鼠腎皮質(zhì)為一檢體，用150目、200目不銹鋼篩分離腎小球。腎

11、小球樣品中加入5倍體積的粉碎緩沖液超聲勻漿，4下100，000g高速離心1h，上清即為胞漿蛋白液；將沉淀用1ml胞膜蛋白提取懸液，超聲粉碎后抽提2h，再于4以100，000g離心1h，上清即為胞膜蛋白液3。13測定13124h尿蛋白定量采用硫柳酸法，以牛血清白蛋白為標準蛋白，制定標準曲線進行尿標本檢測。血糖采用葡萄糖氧化酶法，血、尿肌酐采用苦味酸法，利用日立公司7150型全自動生化分析儀進行檢測，并計算內(nèi)生肌酐清除率（Ccr）。132PKC活性測定3以HistoneS為底物，-32PATP為磷的供體，反應(yīng)混合物總體積為50l，其中含10l樣品。30反應(yīng)7min后，取反應(yīng)液25l置于強陽離子交換

12、濾紙上（1cm×2cm，英國Whatman公司），將濾紙吹干，浸于75mmolL磷酸溶液中終止反應(yīng)。用75mmolL磷酸溶液反復(fù)洗三次，每次2min，最后將濾紙烘干，置于含10ml蒸餾水的液閃瓶中，用Beckman液閃儀測定min1值。通過30時每毫克蛋白質(zhì)每分鐘催化-32P摻于底物蛋白的pmol數(shù)表示PKC活性。蛋白定量采用Lowry法，以牛血清白蛋白為標準蛋白。14統(tǒng)計學(xué)處理所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標準誤（±S）表示，利用t-檢驗法進行組間資料的比較，以P0.05為差異顯著。2結(jié)果21實驗室檢查結(jié)果糖尿病大鼠血糖值明顯高于正常對照組，尿量增多，體重增長受到明顯抑制。

13、同時Ccr較對照組明顯增高，腎重體重比值增大，而24h尿蛋白定量兩組之間無顯著性差異，見表1。表1STZ糖尿病大鼠發(fā)病后實驗室檢查結(jié)果（±S）體重（g）尿量（mld）血糖（mmolL）Ccr（mlmin）腎重體重（）尿蛋白定量（mgd）糖尿病組（n20）177.00±9076477±779267±144058±01112±0061258±139對照組（n16）21436±1351869±383476±054036±005083±0031270±210P0050010

14、0100500100522腎小球內(nèi)PKC活性變化糖尿病大鼠腎小球胞漿PKC活性4.81±0.31pmol（min.mgprotein）（以下單位略），與正常對照組相比有所下降，但差異不顯著；胞膜PKC活性1.86±0.12明顯高于對照組大鼠1.30±0.06；兩組大鼠細胞內(nèi)總的PKC活性分別為6.95±0.35與7.39±0.48，差異不顯著。膜結(jié)合PKC百分比糖尿病大鼠為27±4，對照組大鼠為18±3，糖尿病大鼠明顯高于對照組，見表2。 表2初發(fā)糖尿病大鼠腎小球內(nèi)PKC亞細胞分布的變化（±S）細胞總PKC活性（p

15、molmin.mg pro1）胞漿PKC活性（pmolmin.mg pro1）胞膜PKC活性（pmolmin.mg pro1）胞膜PKC活性百分比（）糖尿病組（n10）695±035481±031186±01227±4對照組（n8）739±048607±076130±00618±3P0050050050053討論本實驗糖尿病大鼠組血糖明顯升高，體重減輕，尿量增多，已達到糖尿病診斷標準。而Ccr比正常對照組增高、腎重體重比值增加、尿蛋白無變化，可認為此時腎臟病變主要表現(xiàn)為腎小球高濾過及腎臟肥大，處于初發(fā)糖尿病狀態(tài)。蛋

16、白激酶C是一種可被鈣和磷脂激活的蛋白激酶，廣泛存在于各種組織細胞內(nèi)。靜息狀態(tài)下主要以無活性的形式存在于胞漿中，受到外界刺激時受其特異性底物蛋白吸引自胞漿向胞膜轉(zhuǎn)移，通過對多種膜蛋白的磷酸化發(fā)揮其活性作用，廣泛參與多種細胞信息傳遞，離子通道調(diào)節(jié)，細胞增殖，分化及癌變等一系列與生命現(xiàn)象相關(guān)的過程。始動因子PKC的膜轉(zhuǎn)移現(xiàn)象為PKC激活的重要標志4。本研究結(jié)果顯示，糖尿病大鼠細胞內(nèi)總的PKC活性與對照組差異不顯著，胞漿PKC活性略有下降（P0.05），胞膜PKC活性明顯增高（P0.05），膜結(jié)合PKC百分比顯著增加。表明胞膜PKC活性的增高來源于其自胞漿向胞膜的轉(zhuǎn)移，即初發(fā)糖尿病狀態(tài)腎小球PKC被激

17、活。在糖尿病狀態(tài)下，由于持續(xù)性高血糖使細胞內(nèi)葡萄糖流量增加，葡萄糖可通過糖酵解途徑從頭合成（de novosynthesis）二酯酰甘油（diacylglycerol，DAG），使細胞內(nèi)DAG含量增加，DAG可明顯增加PKC同鈣的親和性，在生理鈣濃度下使PKC完全激活，因此可以認為高血糖為PKC活性增高的主要原因5。糖尿病大鼠2周組主要病理表現(xiàn)為腎小球濾過率增高及腎臟肥大，目前認為其發(fā)生是一系列血管活性物質(zhì)及生長因子共同作用的結(jié)果，這些物質(zhì)激活的機制尚不十分清楚。糖尿病大鼠PKC的激活與腎小球高濾過現(xiàn)象同時出現(xiàn)，提示PKC作為細胞內(nèi)重要的第二信使，可能在糖尿病早期腎臟病變中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用

18、。體外研究的結(jié)果亦表明，激活的PKC可以通過有絲分裂原活化的蛋白激酶（mietogen-activated protein kinase，MAPK）途徑的活化激活磷酯酶A2，促進細胞內(nèi)花生四烯酸釋放，增加前列腺素（PGE2）、前列環(huán)素（PGI2）、血栓素（TXA2）的合成，導(dǎo)致腎小球內(nèi)舒血管縮血管物質(zhì)比率增加，血管擴張6。有學(xué)者報道，PKC可增加腎小球系膜細胞及入球小動脈內(nèi)皮細胞iNOS mRNA的表達，增加NO的合成，導(dǎo)致血管擴張7；而另一些學(xué)者的研究則發(fā)現(xiàn)，PKC可以抑制由NO介導(dǎo)的環(huán)磷酸鳥苷（cGMP）合成，從而引起由cGMP介導(dǎo)的血管收縮功能障礙8。雙方的實驗均證明，PKC抑制劑可抑制

19、由NO介導(dǎo)的血管擴張效應(yīng)，導(dǎo)致腎臟的高灌注現(xiàn)象。此外PKC在內(nèi)皮素及表皮生長因子的激活中亦發(fā)揮著重要的作用9。由此可以推測，高血糖通過激活PKC，活化細胞內(nèi)多種血管活性物質(zhì)及生長因子，促進腎小球高濾過現(xiàn)象與腎臟肥大的發(fā)生。綜上所述，鏈脲菌素糖尿病大鼠初發(fā)糖尿病狀態(tài)腎小球PKC即被激活，表現(xiàn)為其自胞漿向胞膜的轉(zhuǎn)移；激活的PKC通過參與多種血管活性物質(zhì)的釋放、離子通道的調(diào)節(jié)構(gòu)成細胞內(nèi)重要的信息網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)，在糖尿病早期腎內(nèi)血流動力學(xué)改變中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。作者單位：中國醫(yī)科大學(xué)第一臨床學(xué)院腎內(nèi)科（沈陽，110001）參考文獻1The Diabetes Control and Complicatio

20、ns Trial Research GroupThe effect of intensive treatment of diabetes on the development and progression of long-term complications in insulin-dependent diabetes mellitusN Engl J Med，1993，329（14）：9772Wardle ENHow does hyperglycamia predispose to diabetic nephropathy？QJM，1996，89（12）：9433  Ayo SH，

21、Radpik R，Caroni JA et alHigh glucose increases diacylglycerol mass and activates protein kinase C in mesangial cell culturesAm J physiol，1991，261：F5714  Nishizuka YIntracellular signalling by hydrolysis of phospholipids and activation of protein kinase CScience，1992，258：6075  Craven PA，Davidson CM，Derubertis FR et alIncrease in diacylglyceral mass in isolated glomeruli by glucose from de novo synthesis of glycerolipidsDiabetes，1990，39：6676  Haneda ，Araki S，Togawa et al