多聚酶鏈反應(yīng)檢測老年人肺炎支原體的研究

1、    【摘要】  目的 探討肺炎支原體（MP）與老年呼吸道感染的關(guān)系。方法 應(yīng)用多聚酶鏈反應(yīng)（PCR）檢測128例急性期老年患者痰和分泌物MP-DNA，其相應(yīng)血清進(jìn)行MP-IgM檢測。結(jié)果 128例急性期患者M(jìn)P-DNA中有81例表達(dá)陽性，陽性率為63.28（81/128），而血清學(xué)試驗檢測陽性率為28.13（36/128），兩者均陽性32例，兩者均陰性58例，MP-DNA陽性而MP-IgM 陰性38例，PCR法和血清學(xué)試驗兩者陽性符合率為39.51。結(jié)論 應(yīng)用PCR方法檢測急性期老年患者 MP-DNA 較血清學(xué)法更敏感，陽性率高。

2、 【關(guān)鍵詞】  多聚酶鏈反應(yīng)；支原體，肺炎；老年人    肺炎支原體(mycop lasma pneumoniae，MP)是引起原發(fā)性非典型肺炎及其他呼吸道感染性疾病的常見病原微生物1。近年來，MP已成為老年人常見病原菌之一2，為了探討老年呼吸道感染與MP的關(guān)系，我們應(yīng)用多聚酶鏈反應(yīng)（PCR）技術(shù)檢測了老年患者急性期臨床中的MP特異性DNA片段，陽性率達(dá)63.28，現(xiàn)報告如下：1  資料與方法1.1  一般資料 128例老年肺炎患者選自2005年1月2006年12月我院住院及門診病人。病房及門診病人均經(jīng)臨床及胸片X

3、線檢查診斷為肺炎，其中男81例，女47例，中位年齡69歲。1.2  標(biāo)本采集 患者發(fā)病兩天內(nèi)采集標(biāo)本，用5ml玻璃管取受檢患者肺深部咳出的痰液13ml密封送檢，咽拭子則用棉拭子取咽部分泌物，將棉拭子置入無菌玻璃管中密封送檢，采集的標(biāo)本均保存于-20待測。另采集2.0ml靜脈血進(jìn)行MP特異性IgM抗體檢測。1.3  檢驗方法1.3.1  標(biāo)本處理 痰液中加入4倍體積的生理鹽水，輕輕振蕩后置4冰箱過夜，然后取1.0ml于1.5ml離心管中，12000r/min離心5min去上清，沉淀加入50l DNA提取液充分混勻，100 10min后，

4、12000r/min離心5min備用；咽拭子的玻璃管中則加入1.0ml的生理鹽水，充分振蕩后擠干棉拭子，將全部液體轉(zhuǎn)入1.5ml離心管中，12000r/min離心5min，后續(xù)處理同痰液。1.3.2  PCR 按文獻(xiàn)3合成MP PCR引物，上游: 5-AA GCTTA TTGGTACA GGTT-3，下游: 5-TTACCA TCCTTGTTGTTA -3；PCR反應(yīng)體系25l，含0.2M引物，2.0mM MgCl2、0.2 mM dNTPs和1U Taq酶（MBI公司），反應(yīng)條件為94 30s、55 30s、721min，共40個循環(huán)。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5瓊脂糖凝膠電泳，凝

5、膠成像儀觀察結(jié)果，陽性條帶為150bp。1.3.3  MP特異性IgM抗體檢測 用間接血凝法檢測MP特異性IgM抗體，雙份血清MP抗體滴度4倍及以上判斷為陽性，或血清抗體效價132判斷為陽性。2  結(jié)果        經(jīng)PCR檢測發(fā)現(xiàn)128例急性期患者M(jìn)P-DNA中有81例表達(dá)陽性，陽性率為63.28（81/128），而血清學(xué)試驗檢測同一患者血清MP-IgM，陽性率為28.13（36/128），兩者均陽性32例，兩者均陰性58例，MP-DNA陽性而MP-IgM陰性38例，PCR法和血清學(xué)試驗兩者

6、陽性符合率為39.51。3  討論    MP是介于細(xì)菌和病毒之間的一種無細(xì)胞壁的微生物，主要通過飛沫感染呼吸道，其發(fā)病機理由于MP可通過血行進(jìn)行播散直接侵犯全身各器官組織，以及MP抗原與人體多種組織存在部分共同抗原引發(fā)免疫損傷而致多器官損害，近年來，MP已成為老年人常見病原菌之一4。隨著我國人口老齡化，老年人MP肺炎越來越受到臨床的關(guān)注，但由于MP感染后機體在1周后才能產(chǎn)生IgM 抗體，因此用血清法檢測早期患者血清MP-IgM陽性率較低，不利于PM感染患者得到及時診治。此外，大約20 %成人再次感染MP后幾乎檢測不到特異性IgM 抗體5。 

7、  國內(nèi)曹倩等6檢測患兒鼻咽部分泌物MP發(fā)現(xiàn)，MP-DNA 均在病程第1周內(nèi)檢出，而MP-IgM抗體73.68%在發(fā)病12周內(nèi)檢出，僅有26.42 %在病程1周內(nèi)呈陽性。提示，對于病程1周內(nèi)的患兒，快速、特異、敏感的PCR方法是檢測MP的最佳選擇，而間接血凝法雖敏感性稍差，這與我們檢測老年患者的MP結(jié)論相似，而老年肺炎感染后產(chǎn)生抗體易受宿主狀態(tài)的影響，當(dāng)機體免疫功能低下時，難以產(chǎn)生抗體或抗體滴度較低或抗體產(chǎn)生緩慢，不易檢出MP-IgM，再者血清學(xué)方法本身存在的非特異性及敏感性差，這在一定程度上也影響了MP抗體的檢出率。    劉春靈等7則提出，單次血清MP抗體滴度

8、升高可能是6天3年間的1次MP感染產(chǎn)生的，血清特異性MP-IgM抗體檢測、PCR檢測MP-DNA等實驗室診斷方法都不能作為MP的現(xiàn)時感染的確診手段。但我們用PCR方法直接從患者標(biāo)本中檢測MP，效果較好，發(fā)病初期PCR法檢出率明顯高于血清學(xué)方法，因此我們認(rèn)為PCR法是目前MP感染老年人患者較為直觀的檢測方法，因為：PCR可直接從臨床標(biāo)本中檢測MP-DNA，具有快速、特異、敏感，而血清學(xué)方法為間接的、回顧性的；PCR法不受機體免疫狀態(tài)的影響而血清學(xué)方法在機體免疫狀態(tài)低下，如嚴(yán)重的基礎(chǔ)疾病、腫瘤、免疫抑制劑時，抗體滴度極低，不易檢出；PCR法對臨床診斷、治療、療程及療效判斷有直接的指導(dǎo)意義，血清學(xué)除

9、作回顧性診斷外，對臨床治療的指導(dǎo)意義不大。    綜上所述，對患有急性呼吸道感染的老年患者，建議用 PCR 法常規(guī)檢測MP-DNA，但應(yīng)做好質(zhì)量控制防止假陽性污染，而對于發(fā)病數(shù)周后的患者可結(jié)合血清學(xué)檢測用于回顧性診斷?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】  1孫紅妹.肺炎支原體感染的實驗室診斷J.實用兒科臨床雜志，2007，22(4):245-248.2岳猛，姜緋.老年人肺炎支原體感染調(diào)查分析J.中國醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2006，35(5):553.3尤蘭華，周榮菊，封錦芳.發(fā)熱及不發(fā)熱急性呼吸道感染患者肺炎支原體肺炎衣原體的檢測J.中國誤診學(xué)雜志，2007，7(7):1476.4宮向榮，杜濤.肺炎支原體感染后老年人白細(xì)胞變化的探討J.實用醫(yī)技雜志，2007，14(8):981-982.5方德剛，肖清華.支原體感染免疫研究進(jìn)展J.醫(yī)學(xué)臨床研究，2006，23(8):1276-1277.6曹倩，閻