肝損傷動(dòng)物模型研究進(jìn)展

1、肝損傷動(dòng)物模型研究進(jìn)展    【關(guān)鍵詞】  肝疾病； 毒物， 四氯化碳； 醋氨酚； 疾病模型，動(dòng)物論文既是探討問題進(jìn)行科學(xué)研究的一種手段，又是描述科研成果進(jìn)行學(xué)術(shù)交流的一種工具.  肝損傷是各種肝臟疾病的病變結(jié)果，對(duì)肝損傷的防治目前仍是一個(gè)嚴(yán)峻的課題。通過建立實(shí)驗(yàn)性肝損傷動(dòng)物模型，研究肝病的發(fā)生機(jī)制，篩選保肝藥物，探索保肝作用原理，具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。現(xiàn)將近年來國內(nèi)外對(duì)實(shí)驗(yàn)性肝損傷動(dòng)物模型分類、作用原理、造模方法及其優(yōu)缺點(diǎn)等研究進(jìn)展作綜述和探討。   &#

2、160;1  化學(xué)性肝損傷動(dòng)物模型    1.1  四氯化碳（carbon tetrachloride, CCl4）  CCl4導(dǎo)致肝損傷的主要機(jī)制目前認(rèn)為與其自身和自由基代謝產(chǎn)物有關(guān)()。CCl4代謝產(chǎn)生的自由基進(jìn)入機(jī)體后，在肝臟經(jīng)細(xì)胞色素P450激活，生成三氯甲基自由基和三氯甲基過氧自由基，攻擊肝臟細(xì)胞膜上的磷脂分子，使得細(xì)胞膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜發(fā)生氯烷化和脂質(zhì)過氧化，損傷細(xì)胞膜、細(xì)胞器；還能與膜脂質(zhì)和蛋白質(zhì)大分子進(jìn)行共價(jià)結(jié)合，影響蛋白質(zhì)代謝，并且破壞膜結(jié)構(gòu)和功能的完整性，鈣離子

3、內(nèi)流增加，影響細(xì)胞正常生理功能，最終導(dǎo)致肝細(xì)胞胞質(zhì)中的可溶性酶滲出，細(xì)胞死亡1。    CCl4所致肝損傷可分為急性和慢性。急性肝損傷：賴力英等應(yīng)用4 mL/kg CCl4劑量灌胃可誘發(fā)SD大鼠急性肝功能衰竭，死亡率達(dá)85 %2。慢性肝損傷：Zhang等采用2 mL/kg CCl4腹膜內(nèi)注射SD大鼠，每周2次，持續(xù)9周可伴有肝細(xì)胞壞死和明顯炎癥的肝硬化3。CCl4導(dǎo)致肝損傷是經(jīng)典模型之一，能準(zhǔn)確反應(yīng)肝細(xì)胞功能、代謝及形態(tài)學(xué)變化，重復(fù)性好且經(jīng)濟(jì)。但CCl4同時(shí)還損傷動(dòng)物的心、脾、肺、腎、腦等器官，另外，蒸汽

4、和液體可由呼吸道、皮膚吸收，對(duì)人體也有一定毒性，操作時(shí)應(yīng)注意。A clear conscience is a sure card.      1.2  萘基異硫氰酸酯(Naphthylisot hiocyanate, ANIT)  ANIT是一種間接肝毒劑，其主要損害是通過膜脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，致使肝細(xì)胞變性、壞死、胞內(nèi)血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT）大量溢入血流，同時(shí)還導(dǎo)致膽管上皮細(xì)胞腫脹壞死，引起毛細(xì)膽管增生及小葉間膽管周圍產(chǎn)生炎癥，從而造成膽管阻塞，形成明顯的膽汁淤積，并伴隨以點(diǎn)狀壞死為主的

5、肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞損害，產(chǎn)生梗阻性黃疸，出現(xiàn)高膽紅素血癥和膽汁分泌減少(醫(yī)藥學(xué)/臨床醫(yī)學(xué)論文 )。    黃正明等采用ANIT 100 mg/kg灌胃48 h后，ALT、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)升高明顯，尤其是總膽紅素升高更明顯，成功誘導(dǎo)Wistar大鼠的急性黃疸型肝炎4。ANIT誘發(fā)大鼠和小鼠的肝損傷模型，可獲得多項(xiàng)異常指標(biāo)，模型復(fù)制簡便易行，重現(xiàn)性好，ANIT對(duì)動(dòng)物機(jī)體氧化自由基反應(yīng)系統(tǒng)的影響對(duì)抗氧化型保肝藥物的研究具有重要意義，是退黃藥物研究的理想模型，因此可用于篩選和研究新型保肝藥及利膽藥。   &

6、#160;1.3  D氨基半乳糖(Dgalactosamine, DGaln )  DGaln是一種肝細(xì)胞磷酸尿嘧啶核苷干擾劑，通過競爭生成二磷酸尿苷半乳糖使磷酸尿苷耗竭,導(dǎo)致肝細(xì)胞的RNA和漿膜蛋白合成障礙，限制細(xì)胞器的再生及酶的生成和補(bǔ)充，使細(xì)胞器受損，引起肝細(xì)胞變性、壞死；另外DGaln還可以與肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞膜特異性結(jié)合，影響其完整性，引起肝細(xì)胞內(nèi)Ca2+增多，Mg2+減少，抑制線粒體功能，激活磷脂酶，加速氧化自由基的產(chǎn)生，因此Mg2+/Ca2+的比例失調(diào)也是DGaln導(dǎo)致肝細(xì)胞不可逆損害的因素之一；加上使肝臟谷胱甘肽減少，并激活庫

7、普弗釋放TNF引起細(xì)胞凋亡5。It is right to put everything in its proper use.      李梅等篩選DGaln造模的最佳劑量，比較DGaln造成的大、小鼠急性肝損傷模型的穩(wěn)定性，發(fā)現(xiàn)DGaln 500 mg/kg誘導(dǎo)的大鼠急性肝損傷模型肝組織形態(tài)變化顯著且死亡率低，更適用于保肝新藥的篩選與評(píng)價(jià)6。DGaln形成的急性肝功能衰竭模型是研究病毒性肝炎的發(fā)病機(jī)制及有效治療藥物理想的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，其優(yōu)點(diǎn)是該模型的病變僅限于肝臟，不涉及其它器官，癥狀、生物化學(xué)、組織學(xué)表現(xiàn)接近人，給藥方便

8、，重復(fù)性好，終點(diǎn)明確，具有可逆性，不造成環(huán)境污染及人體傷害，不需特殊的實(shí)驗(yàn)操作保護(hù)措施，對(duì)肝衰竭、肝性腦病、人工肝支持系統(tǒng)的評(píng)價(jià)研究有重要價(jià)值，但價(jià)格昂貴導(dǎo)致應(yīng)用受限。    1.4  二甲基亞硝胺(Dimethylnitrosamine,DMN)  DMN是常見的致肝癌劑，它通過微粒體代謝，其中間產(chǎn)物與細(xì)胞核酸、蛋白質(zhì)等結(jié)合可造成細(xì)胞內(nèi)大分子損傷，誘發(fā)大鼠肝竇壁肝星狀細(xì)胞的活化，導(dǎo)致過多增多和沉積，引起肝纖維化形成；同時(shí)促進(jìn)竇內(nèi)皮細(xì)胞形成肝竇毛細(xì)血管化，加重肝損傷，促進(jìn)肝纖維化的發(fā)展7。A useful trad

9、e is a mine of gold.      DMN肝損傷動(dòng)物模型可分急性肝損傷動(dòng)物模型和肝纖維化動(dòng)物模型。急性肝損傷模型：Horn等采用DMN 5 mg/kg劑量誘導(dǎo)亞急性肝毒性8。肝纖維化模型：Li等予DMN(10 L/kg)腹腔注射Wistar大鼠，每周2次，持續(xù)4周，成功誘導(dǎo)了肝纖維化模型9。DMN所致的肝纖維化大鼠模型病變類似于人類肝纖維化病變，并且肝纖維化形成率高、死亡率低、造模周期短、肝纖維化形成后病變相對(duì)穩(wěn)定等特點(diǎn)，主要用于肝硬化形成的形態(tài)學(xué)改變、機(jī)理、生化指標(biāo)的異常改變和門脈高壓機(jī)制的研究，

10、還用于肝硬化向肝癌轉(zhuǎn)化機(jī)制的研究10。缺點(diǎn)為DMN毒性大，易揮發(fā)，排泄物在24 h內(nèi)含毒物，易污染環(huán)境和影響周圍人群。    1.5  硫代乙酰胺( thioacetamide，TAA)  TAA具有直接肝毒性作用，攝入后可經(jīng)肝細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞色素P450混合功能氧化酶代謝為TAA硫氧化物，干擾細(xì)胞核內(nèi)RNA轉(zhuǎn)移，影響蛋白質(zhì)合成和酶活力，增加肝細(xì)胞核內(nèi)DNA合成及有絲分裂，促進(jìn)肝硬化發(fā)展，同時(shí)激活肝細(xì)胞磷脂酶A2，破壞肝細(xì)胞膜，形成腸源性內(nèi)毒素血癥，導(dǎo)致大面積肝細(xì)胞破壞，并可使ALT、AST明顯增高。

11、TAA小劑量誘發(fā)肝細(xì)胞凋亡，大劑量導(dǎo)致脂質(zhì)氧化和小葉中央壞死、損傷程度與TNF和內(nèi)毒素水平正相關(guān)，可被羥自由基清除劑緩解11。In a great river great fish are found; but take heed lest you be drowned.      TAA常用于制作急性肝損傷、肝纖維化和肝性腦病模型：王春妍等采用皮下注射TAA 600 mg/kg制作大鼠急性肝損傷動(dòng)物模型12。Wang等采用4%的TAA溶液以0.2 g·kg-1·d-1劑量腹腔注射，每日3次，持

12、續(xù)10周制作成大鼠肝纖維化模型，可用于治療肝硬化藥物的研發(fā)13。TAA致肝損傷模型過程相對(duì)簡單易行致肝細(xì)胞損傷反應(yīng)好，且具有良好的可行性和重復(fù)性、肝纖維化組織接近人類，制備成功率高等優(yōu)點(diǎn)，常用于制作肝纖維化和急性肝功能衰竭模型。    2  藥物性肝損傷模型    2.1  醋氨酚(acetaminophen,PAPA)  PAPA亦名對(duì)乙酰氨基酚、撲熱息痛，經(jīng)體內(nèi)P450代謝可生成活性中間代謝物N乙酰對(duì)苯醌亞胺(NAPQI)，NAPQI具強(qiáng)大的氧化作用，

13、使生物膜系統(tǒng)發(fā)生脂質(zhì)過氧化，干擾細(xì)胞內(nèi)的能量代謝，導(dǎo)致肝細(xì)胞變性壞死，同時(shí)誘導(dǎo)肝組織細(xì)胞中高表達(dá)Fas/FasL和穿孔素/顆粒酶，活化細(xì)胞死亡程序，導(dǎo)致肝細(xì)胞壞死14。PAPA引起肝障礙還與肝臟谷胱甘肽含量減少有關(guān)。    PAPA加熱下溶于生理鹽水，給小鼠300500 mg/kg一次性腹腔注射，也可配成質(zhì)量濃度為2.5%的混懸液經(jīng)口灌胃，制成急性肝損傷模型15。PAPA常用于制作急性肝功能衰竭模型，其誘導(dǎo)的急性肝功能衰竭模型與人急性肝功能衰竭的臨床特點(diǎn)、組織學(xué)表現(xiàn)相似，是較理想的急性肝功能衰竭模型。PAPA肝損傷動(dòng)物模型也可用于因各種原因?qū)е?/p>

14、谷胱甘肽含量減少而引起肝細(xì)胞損傷的治療藥物篩選。趙世鋒等對(duì)雜種家犬采用多次皮下注射醋氨酚的方法建立急性肝損傷模型有以下特點(diǎn)：具有較好的重復(fù)性、可復(fù)制性和穩(wěn)定性；有明顯的肝臟損傷特異性對(duì)其他重要臟器無損害；對(duì)實(shí)驗(yàn)人員危害較小16。    2.2  其他  四環(huán)素（Tetracycline）導(dǎo)致肝損傷的機(jī)制仍未明確，祿保平等應(yīng)用四環(huán)素10倍劑量（2 250 mg/kg），灌胃18 h成功制得急性肝損傷模型17?？菇Y(jié)核藥物異煙肼具有肝毒性，祿保平等認(rèn)為異煙肼的肝損傷機(jī)制與其代謝產(chǎn)物乙酰異煙肼

15、和肼二者引起的自由基脂質(zhì)過氧化反應(yīng)有密切關(guān)系，應(yīng)用2倍劑量（180 mg/kg）異煙肼灌胃后18 h，成功誘導(dǎo)急性肝損傷模型18，由于家兔對(duì)異煙肼敏感多選用家兔動(dòng)物模型，異煙肼引起肝損傷動(dòng)物模型多用于藥物性肝炎的研究。    3  免疫性肝損傷動(dòng)物模型    3.1  卡介苗（bacillus calmetteguerin vaccine,BCG）加脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）  BCG的損

16、傷機(jī)制可能是小鼠注射BCG后導(dǎo)致多核中性粒細(xì)胞或巨噬細(xì)胞(肝內(nèi)庫普弗細(xì)胞)聚集于肝臟并被致敏，繼而用低劑量LPS攻擊，促進(jìn)其釋放大量對(duì)肝細(xì)胞有毒性作用的細(xì)胞因子，如白三烯、TNF、IL1和NO等，NO作為自由基，可以與O2反應(yīng)生成超氧化亞硝酸陰離子(ONOO)以及其他自由基引起脂質(zhì)過氧化造成肝細(xì)胞損害19。Call no man happy until he dies.      SheaBudgell等以BCG漿液每只0.2 mL（含5×106菌）注射小鼠尾靜脈，致敏后10 d，再尾靜脈注射LPS每只7.5

17、60;g，成功誘導(dǎo)小鼠肝損傷模型20。邱英鋒等確定BCG菌數(shù)5.0×107+ LPS 劑量30 g/kg聯(lián)合最佳，能夠充分造成大鼠急性肝損傷21。BCG和LPS肝損傷動(dòng)物模型簡便易行，且造成的大鼠急性肝損傷與病毒性肝炎發(fā)病機(jī)制有較大相似，可用于對(duì)病毒性爆發(fā)性肝炎的研究。    3.2  異種血清  異種血清誘導(dǎo)的免疫性肝纖維化其發(fā)生機(jī)制尚未明確。異種血清腹腔注射法，可選用豬、牛、羊等血清，其中以豬血清最為常用。豬血清每次0.5 mL腹腔注射SD或Wistar大鼠，每

18、周2次，12周后肝內(nèi)廣泛纖維組織增生，假小葉形成，有典型肝硬化表現(xiàn)22。異種血清誘導(dǎo)的肝纖維化模型簡便、經(jīng)濟(jì)、成功率高、病變單純以及與人類病程相似，但有自愈傾向，造模周期較長，且牛和羊血清引起的動(dòng)物死亡率較高。Politeness costs nothing and gains everything.      3.3  刀豆蛋白A（concanavalin A，ConA）  ConA是植物凝集素，作為一種T細(xì)胞絲裂原，有促進(jìn)有絲分裂的作用，可以激活T淋巴細(xì)胞，分泌大量細(xì)胞因子，肝實(shí)質(zhì)可見大量淋

19、巴細(xì)胞浸潤，主要以CD4+T淋巴細(xì)胞為主，引起特異性肝損傷23。A clear conscience is a sure card.      Dawei等研究發(fā)現(xiàn)小鼠靜脈注射ConA(20 mg/kg)后68 h可制成急性免疫性肝損傷模型24。李鴻立等采用小鼠尾靜脈注射1 mol/L ConA (12.5 mg/kg)，每周1次，連續(xù)6周，成功制出肝纖維化模型，常規(guī)病理切片HE染色示肝小葉破壞，結(jié)構(gòu)紊亂，肝壞死明顯25。ConA肝損傷模型特點(diǎn)：制作簡便快速，無需預(yù)先致敏；有劑量依賴性

20、，肝損害隨藥物劑量加大而加重；具有肝臟損傷特異性未發(fā)現(xiàn)肺、脾、心等肝外器官損傷26。ConA肝損傷動(dòng)物模型對(duì)于治療自身免疫性肝炎的藥物篩選具有重要意義。    免疫系統(tǒng)在肝炎的發(fā)病過程中有重要作用，尤其是慢性肝炎、肝硬化、乙醇中毒性及藥物性肝損傷，雖然免疫性肝損傷模型類似于人類肝炎后肝纖維化的形成機(jī)制、病理生理過程，但仍有一定差距，主要是由于缺乏病毒復(fù)制和肝實(shí)質(zhì)持續(xù)損傷的過程，因此此類模型僅有利于從免疫學(xué)角度探討發(fā)病機(jī)制和評(píng)價(jià)藥物療效。    4  酒  精 

21、60;  酒精對(duì)肝損害的機(jī)制尚未完全闡明，可能是炎癥和免疫病理共同作用的結(jié)果，蛋白質(zhì)和各種營養(yǎng)物質(zhì)缺乏會(huì)加重酒精的肝損害。高濃度的酒精引起急性肝損傷產(chǎn)生大量毒性代謝產(chǎn)物和乙醛，并釋放腎上腺素引起肝臟血管收縮肝竇內(nèi)壓升高和肝細(xì)胞缺氧，導(dǎo)致空泡變性肝細(xì)胞溶解壞死27。    酒精所致肝損傷可分為性肝損傷和慢性肝損傷。急性肝損傷：小鼠或大鼠以5060 度白酒或體積分?jǐn)?shù)為50%60%的乙醇一次性經(jīng)口灌胃4.06.0 g/kg，24 h內(nèi)可成功造成大鼠急性酒精性肝損傷模型28。慢性酒精性肝損傷：趙敏等予50%的乙醇

22、灌胃30 d 即可出現(xiàn)酒精性脂肪肝模型，60 d可見肝臟纖維化改變。該造模方法具有肝纖維化出現(xiàn)率高、造模方便、價(jià)格低廉特點(diǎn)，而且模型穩(wěn)定造模方法簡單、快速、易于操作，可以進(jìn)行重復(fù)實(shí)驗(yàn)，增加樣本量29。    5  其  他    缺血再灌注導(dǎo)致的肝組織細(xì)胞損傷主要與氧自由基的生成和鈣超載有關(guān)，主要用于制作急性肝功能衰竭模型以研究肝移植、細(xì)胞移植和人工肝治療效果。另外，營養(yǎng)和代謝性肝損傷模型、寄生蟲性肝纖維化模型、感染性肝損傷模型(病毒性肝炎、沙門

23、菌、大腸桿菌等誘發(fā))亦有不少報(bào)道30。【參考文獻(xiàn)】  1 Lesage G D, Benedetti A, Glaser S, et al. Acute carbon tetrachloride feeding selectively damages large, but not small，cholangiocytes from normal rat

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